西達(dá)本胺聯(lián)合干擾素α對(duì)人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Hut78的協(xié)同作用及其分子機(jī)制的研究

谷曉廣，劉永生，續(xù)言鳳，李孟曙

蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征屬于皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤，其中蕈樣肉芽腫是皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤中最常見(jiàn)的類型[1]。目前的研究顯示，蕈樣肉芽腫和Sézary綜合征的發(fā)病機(jī)制中腫瘤細(xì)胞的不斷擴(kuò)增主要依賴于對(duì)凋亡的抵抗而不是過(guò)度的增殖[2]。因此，臨床上進(jìn)展期的蕈樣肉芽腫患者對(duì)主要通過(guò)抑制細(xì)胞增殖的常規(guī)化療的治療方法是高度抵抗的。目前針對(duì)蕈樣肉芽腫特別是進(jìn)展為腫瘤期的患者和惡性程度更高的Sézary 綜合征患者治療方法非常有限，系統(tǒng)性化療的緩解率不高。尋求一種高效的藥物和藥物組合是目前治療蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征的關(guān)鍵。西達(dá)本胺是具有全新化學(xué)結(jié)構(gòu)的選擇性組蛋白去乙?；敢种苿℉DAC-I），其對(duì)組蛋白的抑制具有特殊性，只針對(duì)第Ⅰ大類組蛋白去乙?；福℉DAC）的亞型-HDAC2 和HDAC3，而上述兩種亞型與腫瘤的發(fā)生和腫瘤的進(jìn)展是高度相關(guān)的[3]。干擾素（IFN）-α目前是蕈樣肉芽腫治療的一線治療藥物，特別是針對(duì)斑片和斑塊期等早期蕈樣肉芽腫具有非常高效的控制腫瘤進(jìn)展的作用。即使蕈樣肉芽腫進(jìn)展至腫瘤期以及惡性程度更高的Sézary 綜合征患者，應(yīng)用IFN-α也是有效的[4]。本研究通過(guò)觀察西達(dá)本胺和IFN-α 單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征相關(guān)人皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Hut78 增殖抑制和凋亡的影響，檢測(cè)Hut78 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，探究西達(dá)本胺聯(lián)合IFN-α 治療蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征的可能分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

Hut78 細(xì) 胞 系（ATCC 號(hào)：TIB-161），RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司），胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司），MTS（美國(guó)Promega 公司），F(xiàn)ITC-AnnexinV凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD 公司），cDNA 合成試劑盒（加拿大Fermentas 公司），熒光定量試劑盒power SYBR?Green PCR Master Mix（美 國(guó)Applied Biosystems 公司），IFN-α（北京凱因生物技術(shù)有限公司），西達(dá)本胺（深圳微芯生物科技有限公司，貨號(hào)：H20140129）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hut78細(xì)胞在37℃, 5% CO2孵育箱中培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)基為RPMI1640，其中含有10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素。

1.2.2 采用細(xì)胞增殖檢測(cè)法（MTS 法）測(cè)定細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（濃度2×104/ml）培養(yǎng)在每孔含1 ml 培養(yǎng)基6 孔板中。西達(dá)本胺設(shè)4 個(gè)濃度組：0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L，IFN-α 設(shè)4 個(gè)濃度組：3 000、5 000、10 000、20 000 U/ml，再設(shè)一個(gè)聯(lián)合組：1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 000 U/ml IFN-α，加入等量培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組作用于Hut78 細(xì)胞24、48、72 h。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)混勻細(xì)胞，然后取100 μl 細(xì)胞混懸液加至96 孔板中，并且每個(gè)濃度做3 個(gè)副孔，每孔中加20 μl 預(yù)先配置好的MTS 溶液，37℃孵箱中孵育2 h，96 孔板在分光光度儀中測(cè)定490 nm 處的吸光度。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞體外克隆形成能力檢測(cè) 使用甲基纖維素培養(yǎng)基（MethoCult CFC，StemCell Technologies）對(duì)Hut78細(xì)胞的體外克隆形成能力進(jìn)行分析，CFC可以使單個(gè)細(xì)胞克隆原位進(jìn)行增殖，進(jìn)而形成單細(xì)胞克隆細(xì)胞群落。分別設(shè)3個(gè)濃度組：1.2 μmol/L西達(dá)本胺組、10 000 U/ml IFN-α組以及聯(lián)合組，加入等量培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組先分別處理Hut78細(xì)胞24 h，每個(gè)濃度組平皿細(xì)胞在顯微鏡下計(jì)數(shù)103個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞加入CFC中并振蕩，然后應(yīng)用帶鈍端針頭的注射器將混合好的細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，上述培養(yǎng)皿放置在37℃, 5% CO2點(diǎn)孵育箱中培養(yǎng)14 d，再使用倒置顯微鏡和計(jì)數(shù)皿計(jì)數(shù)和評(píng)估集落類型。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞凋亡 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，計(jì)數(shù)Hut78 細(xì)胞（2 ×104/ml）接種于6 孔板中，每孔1 ml。實(shí)驗(yàn)組分別每孔加入1.2 μmol/L 西達(dá)本胺，10 000 U/ml IFN-α，1.2 μmol/L 西達(dá)本胺聯(lián)合10 000 U/ml IFN-α，每孔10 μl，加入等量培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組培養(yǎng)24 h。不同濃度組計(jì)數(shù)5×105個(gè)細(xì)胞，使用冷的PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞2 次，將Hut78細(xì)胞重新以1×106/ml 的濃度懸浮在結(jié)合緩沖液中。將100 μl 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到5 ml 試管中，每管中加入5 μl 的FITC 偶聯(lián)AnnexinV 和5 μl PI。輕輕混勻細(xì)胞，避光孵育15 min。每管中加入結(jié)合緩沖液400 μl，在1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用FlowJo8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)FITC 陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。上述需重復(fù)3 次，取其平均值。

表1 凋亡相關(guān)基因Fas、FasL、Caspase3、Caspase8、內(nèi)參GAPDH的引物序列

圖1 西達(dá)本胺和IFN-α單獨(dú)以及聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞體外增殖的影響

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA 的表達(dá) 1.2 μmol/L西達(dá)本胺組，10 000 U/ml IFN-α 組，1.2 μmol/L 西達(dá)本胺聯(lián)合10 000 U/ml IFN-α 組及加入等量培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組培養(yǎng)24 h 后，分別計(jì)數(shù)各組Hut78細(xì)胞5×105個(gè)，高速離心后棄去上清，然后加入Trizol?Reagent 提取細(xì)胞RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以cDNA 為模板，加入選取的目的基因引物，各引物序列見(jiàn)表1。使用power SYBR?Green PCR Master Mix 試劑盒，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PRC 檢測(cè)儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，與此同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH基因作為定量PCR 的對(duì)照。各目的基因mRNA 的表達(dá)值=（目的基因Ct 值-內(nèi)參基因Ct 值）/內(nèi)參基因Ct 值×104，每個(gè)樣本分別重復(fù)3 管，最終結(jié)果取平均值，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果需重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西達(dá)本胺和IFN-α單獨(dú)以及聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞體外增殖的影響

由圖1 可見(jiàn)，與空白對(duì)照組相比，西達(dá)本胺0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L 各濃度組，細(xì)胞的增殖速度均出現(xiàn)顯著降低。在3 個(gè)時(shí)間段24 h，48 h 及72 h 差 異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（F24h=56.45，F(xiàn)48h=121.74，F(xiàn)72h=301.11，P均＜0.05）。與空白對(duì)照組相比，IFN-α 3 000、5 000、10 000 、20 000 U/ml 各濃度組細(xì)胞的增殖速度均表現(xiàn)為顯著降低。在3 個(gè)時(shí)間段24 h，48 h 及72 h 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F24h=21.43，F(xiàn)48h=53.38，F(xiàn)72h=182.71，P均＜0.05）。與空白對(duì)照組相比1.2 μmol/L 西達(dá)本胺、10 000 U/ml IFN-α、1.2μmol/L 西達(dá)本胺聯(lián)合10 000 U/ml IFN-α 處理組細(xì)胞的增殖速度也均表現(xiàn)為顯著降低。在3 個(gè)時(shí)間段24 h、48 h 及72 h 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F24h=44.21，F(xiàn)48h=38.32，F(xiàn)72h=51.38，P均＜0.05）。上述結(jié)果顯示聯(lián)合藥物處理組對(duì)Hut78 細(xì)胞的增殖抑制作用均比單藥處理組對(duì)Hut78 細(xì)胞的增殖抑制作用更顯著。

2.2 西達(dá)本胺和IFN-α單獨(dú)以及聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞體外克隆形成能力的影響

通過(guò)CFC 檢 測(cè)1.2 μmol/L西達(dá)本胺、10 000 U/ml IFN-α、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺聯(lián)合10 000 U/ml IFN-α 處理組對(duì)Hut78 細(xì)胞的體外克隆形成能力，先用1.2 μmol/L 西達(dá)本胺、10 000 U/ml IFN-α 以及聯(lián)合組分別處理Hut78 細(xì)胞24 h，再行細(xì)胞計(jì)數(shù)103接種于CFC 上，14 d 后倒置顯微鏡計(jì)數(shù)形成的細(xì)胞群落。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，1.2 μmol/L 西達(dá)本胺、10 000 U/ml IFN-α、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺聯(lián)合10 000 U/ml IFN-α 處理組Hut78 的體外克隆形成能力明顯降低，其中聯(lián)合組對(duì)細(xì)胞的體外克隆形成能力抑制最明顯，與單藥1.2 μmol/L 西達(dá)本胺組、10 000 U/ml IFN-α 組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.3 西達(dá)本胺和IFN-α單獨(dú)以及聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞凋亡的影響

1.2 μmol/L 西達(dá)本胺組、10 000 U/ml IFN-α 組、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺聯(lián)合10 000 U/ml IFN-α 處理組的Hut78 細(xì)胞凋亡比例均顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。藥物聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡比例均高于1.2 μmol/L 西達(dá)本胺、10 000 U/ml IFN-α等單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（圖3）。

圖2 西達(dá)本胺和IFN-α單獨(dú)以及聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞體外克隆形成能力的影響

圖3 西達(dá)本胺和IFN-α單獨(dú)以及聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞凋亡的影響

2.4 西達(dá)本胺和IFN-α單獨(dú)以及聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響

采用1.2 μmol/L 西達(dá)本胺、10 000 U/ml IFN-α、1.2μmol/L 西達(dá)本胺聯(lián)合10 000 U/ml IFN-α 處理Hut78細(xì)胞24 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)凋亡相關(guān)基因Fas、FasL、Caspase3、Caspase8 的相對(duì)表 達(dá) 量 進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺、10 000 U/ml IFN-α、聯(lián)合組Fas、Caspase8、Caspase3 基因相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），聯(lián)合組Fas、Caspase3、Caspase8 基因相對(duì)表達(dá)量均高于1.2 μmol/L 西達(dá)本胺、10 000 U/ml IFN-α 單藥組相對(duì)表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。而FasL的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化，各治療組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.842）（圖4）。

圖4 西達(dá)本胺和IFN-α單獨(dú)以及聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

目前表觀遺傳學(xué)調(diào)控藥物去乙?；敢种苿℉DAC-I）已經(jīng)成功應(yīng)用于皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤，特別是蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征的臨床治療[5]。研究顯示HDAC-I 可以通過(guò)多種機(jī)制抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)血管生成相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)和抗血管生成基因的表達(dá)的激活，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成而實(shí)現(xiàn)[6]。第二種機(jī)制系通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而這種生物學(xué)作用的核心是通過(guò)上調(diào)染色質(zhì)中組蛋白的乙?；交罨虮磉_(dá)而實(shí)現(xiàn)的[7]。目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已經(jīng)批準(zhǔn)非選擇性針對(duì)HDAC 表觀遺傳的小分子藥物——一種去乙?；敢种苿┓⒅Z他（vorinostat）應(yīng)用于皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤的治療。臨床研究表明，口服伏立諾他對(duì)其他常規(guī)抗腫瘤藥物治療失敗的皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤患者依然有效[8]。西達(dá)本胺是我國(guó)本土研究機(jī)構(gòu)自主研發(fā)的高選擇性HDAC 抑制劑，其特異性地針對(duì)HDAC 的某些亞型，這也是該藥物相對(duì)于同類藥物伏立諾他的一大優(yōu)勢(shì)，其主要抑制HDAC2 和HDAC3，而HDAC2 和HDAC3 是與腫瘤發(fā)生和發(fā)展高度相關(guān)的第Ⅰ大類HDAC 亞型。臨床試驗(yàn)顯示該藥物對(duì)皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤的抗腫瘤活性非常高，且其臨床不良反應(yīng)輕微[3]。有學(xué)者運(yùn)用西達(dá)本胺對(duì)非霍奇金淋巴瘤患者進(jìn)行了Ⅰ期臨床研究，結(jié)果顯示大部分患者的部分緩解率達(dá)到90%[9]。本研究也顯示不同濃度西達(dá)本胺作用Hut78 細(xì)胞后，其能明顯抑制Hut78 細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間和濃度依賴性，西達(dá)本胺在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)可引起凋亡相關(guān)基因Fas、Caspase3、Caspase8表達(dá)的升高，推測(cè)西達(dá)本胺可能通過(guò)上調(diào)Hut78 細(xì)胞表面的Fas表達(dá)觸發(fā)了細(xì)胞的FasL-Fas 細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。

重組人IFN-α 很早就應(yīng)用于對(duì)皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤的治療[10]。目前在臨床上IFN-α 已經(jīng)成為治療蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征的一線藥物，對(duì)斑片、斑塊、腫瘤期蕈樣肉芽腫以及惡性程度很高的Sézary 綜合征患者均具有很好的治療效果[11]。大量關(guān)于IFN-α治療腫瘤作用機(jī)制方面的研究顯示，IFN-α 可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖進(jìn)而誘導(dǎo)其凋亡達(dá)到抗腫瘤的目的[12]。個(gè)別研究顯示，IFN-α 和常規(guī)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的抗腫瘤活性[13]。但是目前其對(duì)于治療皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤的具體機(jī)制報(bào)道還比較少。本研究采用不同濃度組的IFN-α 處理Hut78 細(xì)胞，結(jié)果顯示IFN-α 對(duì)Hut78 細(xì)胞的體外增殖具有明顯的抑制作用，伴隨著藥物濃度的不斷遞增，這種抑制作用逐漸增強(qiáng)，這種抑制的趨勢(shì)呈現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴性。

綜上所述，與單用IFN-α 相比，西達(dá)本胺與IFN-α 聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Hut78 細(xì)胞的增殖和克隆形成抑制、凋亡誘導(dǎo)作用更加明顯，并對(duì)凋亡相關(guān)基因Fas、Caspase3、Caspase8 表達(dá)的升高作用均明顯高于單用IFN-α，顯示西達(dá)本胺聯(lián)合IFN-α 能明顯提高抑制皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Hut78 的生長(zhǎng)率，初步揭示了西達(dá)本胺抑制皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Hut78生長(zhǎng)的可能分子機(jī)制。