線粒體和溶酶體內(nèi)源性NO的同時(shí)熒光傳感

方君如，苗俊峰，霍瑩瑩，翁嘉勁，郭煒

（山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

一氧化氮（NO）是生物體內(nèi)重要的氣體信使分子，在細(xì)胞內(nèi)由L-精氨酸、NADPH和氧氣在一氧化氮合成酶的催化下產(chǎn)生[1-5]，并在一系列生理系統(tǒng)，如心血管、免疫和中樞神經(jīng)等，發(fā)揮著重要的生理功能[6-8]。研究表明，NO主要產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)的線粒體[9-10]，通過(guò)結(jié)合細(xì)胞色素c氧化酶的血色素基團(tuán)和調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)的pH來(lái)參與調(diào)控呼吸作用和線粒體引起的細(xì)胞凋亡[11-12]；而且，NO可以穿透線粒體膜而自由擴(kuò)散到溶酶體中來(lái)調(diào)節(jié)溶酶體相關(guān)功能，如細(xì)胞自噬[13-15]。然而，不正常的生理?xiàng)l件會(huì)導(dǎo)致NO的過(guò)量表達(dá)，從而引起其下游氧化產(chǎn)物過(guò)氧亞硝基（ONOO-）的爆發(fā)。ONOO-具有極強(qiáng)的氧化性，能氧化損傷線粒體和溶酶體內(nèi)的各種生物大分子，導(dǎo)致其功能喪失，從而引發(fā)系列疾病，例如癌癥、糖尿病、高血壓、老年癡呆以及溶酶體貯積癥等[4]。盡管如此，由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，許多與NO相關(guān)的線粒體和溶酶體功能迄今尚未被揭示[16-17]。因此，開(kāi)發(fā)能特異性傳感線粒體和溶酶體內(nèi)源性NO的熒光探針顯得尤為重要。

在過(guò)去十幾年間，為了監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO的變化，大量的NO熒光探針被開(kāi)發(fā)出來(lái)。在各種類型的NO熒光探針中，基于鄰苯二胺反應(yīng)基團(tuán)的NO熒光探針最早被開(kāi)發(fā)，其后被廣泛應(yīng)用，目前已經(jīng)商業(yè)化[18-23]。該類探針對(duì)NO的傳感機(jī)理是：鄰苯二胺反應(yīng)基團(tuán)在有氧條件下與NO反應(yīng)生成苯并三氮唑基團(tuán)，該基團(tuán)抑制了探針?lè)肿拥墓庹T導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移猝滅過(guò)程（PET），從而導(dǎo)致熒光“關(guān)-開(kāi)”響應(yīng)[24]。盡管該類探針在生物系統(tǒng)中得到了廣泛的應(yīng)用，但仍然存在一些限制，如易被細(xì)胞內(nèi)脫氫抗壞血酸（DHA）/抗壞血酸（AA）/丙酮醛（MGO）所干擾以及相對(duì)長(zhǎng)的熒光響應(yīng)時(shí)間（通常超過(guò)5 min）。為了克服這些限制，2008年Xu課題組報(bào)道了一個(gè)“鄰苯二胺-羅丹明內(nèi)酰胺”型NO熒光探針。由于鄰苯二胺基團(tuán)的一個(gè)胺基得到了保護(hù)，該探針有效地克服了傳統(tǒng)鄰苯二胺型NO熒光探針選擇性低的缺點(diǎn)，并大大提高了熒光響應(yīng)速度[25]。此后，該設(shè)計(jì)理念被多個(gè)課題組采用，并發(fā)展出各式各樣的羅丹明內(nèi)酰胺型NO熒光探針[26-30]。然而，該類探針與NO反應(yīng)后得到的?；讲⑷蛑虚g體非?；顫姡芘c細(xì)胞內(nèi)豐富的半胱氨酸反應(yīng)而得到非熒光的產(chǎn)物，因此在細(xì)胞影像應(yīng)用時(shí)靈敏度將受到較大的影響。2017年，本課題組開(kāi)發(fā)了一個(gè)“鄰苯二胺-硅羅丹明脫氧內(nèi)酰胺”型 NO熒光探針 Lyso-NO[31]（圖1A）。該探針不僅避免了傳統(tǒng)鄰苯二胺型NO熒光探針易被DHA/AA/MGO干擾的限制以及羅丹明內(nèi)酰胺型NO熒光探針易被細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸干擾的限制，而且展現(xiàn)出對(duì)NO快速的熒光響應(yīng)、大的熒光增強(qiáng)倍數(shù)以及超低的檢測(cè)限。不僅如此，由于該探針的結(jié)構(gòu)中包含了多個(gè)弱堿性的三級(jí)胺單元，該探針能通過(guò)質(zhì)子化作用而選擇性地定位在弱酸性的溶酶體中，從而實(shí)現(xiàn)了溶酶體中NO的熒光影像。

圖1 Lyso-NO和Mito-NO的NO傳感機(jī)理Fig.1 Fluorescence sensing mechanism of Lyso-NO and Mito-NO for NO.

在上述工作基礎(chǔ)上，本文設(shè)計(jì)合成了一個(gè)“鄰苯二胺-羅丹明脫氧酰胺”型NO熒光探針Mito-NO（圖1B）。與硅羅丹明的9位碳原子相比，羅丹明9位碳原子的電正性略小[32-33]，因此Mito-NO在生理pH條件下以開(kāi)環(huán)的正離子形式存在。由于線粒體具有大的負(fù)性膜電勢(shì)，Mito-NO能在靜電相互作用下而特異性地靶向線粒體，從而實(shí)現(xiàn)了線粒體內(nèi)NO的熒光影像?；谠撎结槻⒔Y(jié)合本課題組之前報(bào)道的一個(gè)溶酶體靶向的NO熒光探針Lyso-NO，本文從可見(jiàn)及近紅外兩個(gè)熒光通道實(shí)現(xiàn)了線粒體和溶酶體內(nèi)NO的同時(shí)熒光傳感，為NO生理病理功能的探索提供了優(yōu)良的影像工具。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

紫外可見(jiàn)光譜儀Varian Cary 4000分光光度計(jì)；熒光光譜儀Hitachi F-7000熒光光譜儀；超導(dǎo)核磁共振儀Bruker ARX600；高分辨質(zhì)譜儀Varian QFT-ESI質(zhì)譜儀；激光共聚焦顯微鏡Zeiss LSM 880。合成所用試劑都為分析純，測(cè)試所用乙腈為色譜純?cè)噭?，所用水均為去離子水。

1.2 探針的合成

探針Lyso-NO的合成參考本課題組報(bào)道的方法[26]。

探針Mito-NO的合成步驟如圖2所示。

圖2 探針Mito-NO的合成步驟Fig.2 Synthesis of probe Mito-NO

在室溫下，向羅丹明 B（1）（422 mg，1.0 mmol）的1，2-二氯乙烷（5.0 mL）溶液中緩慢滴加三氯氧磷（460 mg，3.0 mmol）?；亓? h后，將反應(yīng)混合物冷卻并減壓旋干，得到羅丹明B的酰氯粗產(chǎn)品。將該產(chǎn)物溶于無(wú)水乙腈（5.0 mL）中，然后將其緩慢加入到含有三乙胺（5.0 mL）和鄰苯二胺（OPD）（540 mg，5.0 mmol）的無(wú)水乙腈（5.0 mL）的溶液中。室溫下攪拌過(guò)夜后，將混合物減壓旋干，粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱色譜純化（乙酸乙酯：石油醚=1∶4，V/V），得到鄰苯二胺-羅丹明內(nèi)酰胺2（266 mg，50% yield，除特別說(shuō)明以外本文的百分?jǐn)?shù)均表示質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.04（dd，J=6.4，1.7 Hz，1H），7.65～ 7.51（m，2H），7.27（dd，J=6.3，1.4 Hz，1H），6.97（td，J=8.0，1.4 Hz，1H），6.66（d，J=8.8 Hz，2H），6.57（dd，J=8.0，1.0 Hz，1H），6.49～ 6.40（m，1H），6.38～ 6.21（m，4H），6.12（dd，J=7.9，1.1 Hz，1H），3.33（dd，J=13.8，6.9 Hz，8H），1.17（t，J=7.0 Hz，12H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ166.44，153.98，152.40，148.91，144.52，132.63，131.95，128.83，128.75，128.67，128.37，124.30，123.46，122.18，118.22，117.01，107.98，98.03，68.06，44.40，12.53；ESI-MS：Calcd for[M+H]+533.291 7，F(xiàn)ound 533.291 1。

在室溫條件下，將鄰苯二胺-羅丹明內(nèi)酰胺2（106 mg，0.2 mmol）加入到超干 THF（5ml）溶液中，在N2氣保護(hù)下滴加硼烷BH3的四氫呋喃溶液（1 mol/L，THF，1.1 mmol）。回流 12 h后，將反應(yīng)物冷卻并加入甲醇（5 mL）猝滅。將所得反應(yīng)物減壓旋干，硅膠柱色譜純化（乙酸乙酯：石油醚=1∶5，V/V）后得到紫色固體 Mito-NO（56 mg，51% yield）。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ7.78（d，J=7.6 Hz，1H），7.58（t，J=7.6 Hz，1H），7.45（t，J=7.5 Hz，1H），7.11（d，J=7.4 Hz，1H），7.07（d，J=9.3 Hz，2H），6.81～ 6.73（m，4H），6.50（dd，J=25.4，7.1 Hz，3H），6.17（d，J=7.6 Hz，1H），4.25（s，2H），3.63（q，J=6.9 Hz，8H），1.34（t，J=7.0 Hz，12H）；13C NMR（151 MHz，CD3CN）δ153.46，148.92，141.35，136.88，132.63，132.05，129.38，128.95，127.59，125.73，121.29，118.33，116.53，115.4，112.69，108.75，97.11，68.69，58.67，43.75，14.53；ESI-MS：Calcd for[M]+519.311 8，F(xiàn)ound 519.305 7。

1.3 待測(cè)溶液的配制

探針Mito-NO和Lyso-NO溶解到色譜純的乙腈中，配制成2 mmol/L的儲(chǔ)備液。NO水溶液的制備是在N2保護(hù)下將NO氣體首先通過(guò)NaOH溶液以除去由NO和O2反應(yīng)產(chǎn)生的NO2，然后通入脫氧的去離子水中30 min，得到的NO溶液由Griess方法測(cè)定其濃度為1.8 mmol/L。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，使用市售的NO供體NOC-9。在光譜研究中，將不同的分析物（·OH and1O2除外）分別加入到Mito-NO（或 Lyso-NO）（4.0 μmol/L）的 PBS 溶液中（50 mmol/L，pH7.4，包含20% 體積DMSO 或CH3CN），然后記錄吸收和熒光發(fā)射光譜。對(duì)于·OH和1O2，首先將 Mito-NO（或 Lyso-NO）和 H2O2預(yù)混合，然后向混合物中加入Fe2+或ClO-。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針Mito-NO對(duì)NO的傳感性能研究

首先，我們檢驗(yàn)了探針Mito-NO與NO反應(yīng)的吸收光譜變化。如圖3A所示，在生理pH條件下，探針Mito-NO在可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍出示了一個(gè)大的吸收峰，吸收最大值為553 nm，表明該探針主要以開(kāi)環(huán)形式存在；當(dāng)向Mito-NO的溶液中加入NO（30 μmol/L）后，由于生成的苯并三氮唑基團(tuán)對(duì)羅丹明的共軛結(jié)構(gòu)影響很小，因此吸收光譜僅僅發(fā)生了輕微的變化。隨后，我們檢驗(yàn)了探針Mito-NO與NO反應(yīng)的熒光光譜變化。如圖3B所示，探針Mito-NO在生理pH條件下幾乎是非熒光的，表明該探針存在一個(gè)由鄰苯二胺基團(tuán)到羅丹明共軛結(jié)構(gòu)的PET熒光淬滅過(guò)程；當(dāng)往Mito-NO的溶液中加入NO（30 μmol/L）后，在588 nm處出現(xiàn)了一個(gè)大的熒光發(fā)射峰，熒光增強(qiáng)倍數(shù)達(dá)到96倍，表明生成的苯并三氮唑基團(tuán)有效地抑制了探針?lè)肿拥腜ET熒光猝滅，從而導(dǎo)致熒光大大增強(qiáng)。重要的是，Mito-NO與NO的反應(yīng)能夠在數(shù)秒內(nèi)完成（圖3C），表明探針Mito-NO具有實(shí)時(shí)影像生物體內(nèi)NO的能力。熒光滴定實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，隨著NO濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)增加的NO濃度達(dá)到80 μmol/L時(shí)，熒光達(dá)到最大值（圖3D），而且熒光強(qiáng)度與NO濃度在0 μmol/L～ 1.0 μmol/L范圍呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)（R2=0.994）（圖3E）。根據(jù)信噪比S/N=3，計(jì)算得到探針Mito-NO對(duì)NO的檢測(cè)限為2.4 nmol/L。上述結(jié)果表明，探針Mito-NO是一個(gè)高敏感、快響應(yīng)的NO熒光探針。

圖3 （A，B）Mito-NO（4 μmol/L）與NO（30 μmol/L）反應(yīng)前后的吸收光譜和熒光光譜變化；（C）Mito-NO（4 μmol/L）與NO（30 μmol/L）的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；（D）Mito-NO（4 μmol/L）與NO（0 μmol/L ～ 80 μmol/L）的熒光滴定光譜；（E）Mito-NO在588 nm處的熒光密度與NO濃度（0 mol/L～1 mol/L）的線性相關(guān)Fig.3 （A，B）Absorption and fluorescence spectra of Mito-NO（4 μmol/L）in the absence and presence of NO（30 μmol/L）；（C）Time course of fluorescence intensities of Mito-NO（4 μmol/L）at 588 nm upon treatment with NO（30 μmol/L）；（D）Fluorescence spectra of Mito-NO（4 μmol/L）treated with various concentrations of NO（0-80 μmol/L）；（E）Plots of the fluorescence intensities of Mito-NO at 588 nm vs.NO concentrations（0-1.0 μmol/L）

接下來(lái)，我們檢驗(yàn)了探針Mito-NO對(duì)NO的選擇性。如圖4A所示，當(dāng)向探針Mito-NO的PBS溶液中加入生物相關(guān)的活性氧化物（ROS：ClO-，H2O2，1O2，O2·-，·OH，NO2-和 ONOO-，100 μmol/L）、DHA/AA/MGO（1 mmol/L）、金屬離子（K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Al3+，Zn2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Cu+，and Cu2+，1 mmol/L）、生物硫醇（Cys and GSH，1 mmol/L）后，溶液的熒光幾乎沒(méi)有變化；相反，當(dāng)向探針Mito-NO的PBS溶液中加入NO（30 μmol/L）后，溶液的熒光顯著增強(qiáng)，表明探針Mito-NO對(duì)NO具有高的選擇性。進(jìn)一步，我們?cè)诓煌琾H條件下檢驗(yàn)了探針Mito-NO對(duì)NO傳感性能。如圖4B所示，探針Mito-NO在pH=5～9的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)非熒光特性；當(dāng)加入NO（30 μmol/L）后，在生理pH范圍展現(xiàn)了大的熒光增強(qiáng)，表明該探針能在復(fù)雜的生理pH條件下高選擇性地傳感NO。

圖4 （A）Mito-NO 對(duì)各種生理相關(guān)的分子或離子的熒光響應(yīng)結(jié)果。（1）Mito-NO；（2）HClO；（3）H2O2；（4）1O2；（5）O2·-；（6）·OH；（7）NO2-；（8）ONOO-；（9）DHA；（10）AA；（11）MGO；（12）K+；（13）Ca2+；（14）Na+；（15）Mg2+；（16）Al3+；（17）Zn2+；（18）Fe2+；（19）Fe3+；（20）Cu+；（21）Cu2+；（22）Cys；（23）GSH；（24）NO；（B）Mito-NO 在不同pH條件下對(duì)NO的熒光響應(yīng)結(jié)果Fig.4 （A）Fluorescence response of Mito-NO（4 μmol/L）toward various biologically related species，including（1）Mito-NO；（2）HClO；（3）H2O2；（4）1O2；（5）O2·-；（6）·OH；（7）NO2-；（8）ONOO-；（9）DHA；（10）AA；（11）MGO；（12）K+；（13）Ca2+；（14）Na+；（15）Mg2+；（16）Al3+；（17）Zn2+；（18）Fe2+；（19）Fe3+；（20）Cu+；（21）Cu2+；（22）Cys；（23）GSH；（24）NO；（B）Fluorescence response of Mito-NO（4 μmol/L）toward NO（30 μmol/L）under varied pH conditions

為了證明反應(yīng)機(jī)理，我們用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀研究了探針Mito-NO與NO的反應(yīng)產(chǎn)物。如圖5所示，探針Mito-NO本身的液相色譜保留時(shí)間為12.42 min，相應(yīng)的分子離子峰的質(zhì)核比為519.312 5；探針Mito-NO與NO反應(yīng)后生成了一個(gè)主要產(chǎn)物（保留時(shí)間：8.89），該產(chǎn)物分子離子峰的質(zhì)核比為m/z=530.291 5，與預(yù)測(cè)的苯并三氮唑產(chǎn)物一致（計(jì)算值：m/z=530.291 4）。該結(jié)果支持了我們?cè)趫D1中建議的反應(yīng)機(jī)理。

圖5 Mito-NO與NO反應(yīng)前后的液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Fig.5 HPLC-MS results of Mito-NO in the absence（A）and presence（B）of NO

2.2 細(xì)胞影像實(shí)驗(yàn)

接下來(lái)，我們利用激光共聚焦影像儀在HeLa細(xì)胞系測(cè)試了探針Mito-NO對(duì)NO的影像能力。如圖6A所示當(dāng)往HeLa細(xì)胞內(nèi)孵入探針Mito-NO后，在561 nm激發(fā)光激發(fā)下，幾乎沒(méi)有可檢測(cè)的背景熒光；當(dāng)往孵有Mito-NO的HeLa細(xì)胞內(nèi)孵入NOC-9（商業(yè)化的NO供體）后，該細(xì)胞在紅色通道呈現(xiàn)出強(qiáng)熒光，表明Mito-NO能在細(xì)胞環(huán)境中影像外源性NO；當(dāng)往孵有Mito-NO的HeLa細(xì)胞內(nèi)分別加入H2O2、ClO-、SIN-1（商業(yè)化的 ONOO-供體）后，紅色通道沒(méi)有觀察到明顯的熒光，暗示了該探針能在細(xì)胞中選擇性影像NO。進(jìn)一步，我們?cè)赗AW264.7細(xì)胞系測(cè)試了探針Mito-NO對(duì)內(nèi)源性NO的影像能力。如圖6B所示，在激發(fā)光激發(fā)下，RAW264.7本身沒(méi)有熒光，然而當(dāng)孵入Mito-NO后，該細(xì)胞呈現(xiàn)微弱的熒光；當(dāng)RAW264.7細(xì)胞預(yù)先用γ-干擾素/脂多糖（IFN-γ/LPS）刺激6 h再孵入探針Mito-NO后，該細(xì)胞在紅色通道呈現(xiàn)明顯的熒光；當(dāng)在IFN-γ/LPS刺激的同時(shí)加入NO合成酶抑制劑AG（或L-Name），然后再孵入探針Mito-NO，該細(xì)胞在紅色通道僅呈現(xiàn)微弱的熒光。上述結(jié)果表明，探針Mito-NO不僅能檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)生理濃度的NO，而且能檢測(cè)該細(xì)胞刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性NO。另外，我們也研究了Mito-NO的光穩(wěn)定性和抗光漂白能力。如圖6C所示，當(dāng)用激發(fā)光連續(xù)激發(fā)孵有Mito-NO的HeLa細(xì)胞30 min后，該細(xì)胞仍然呈現(xiàn)低的背景熒光，表明該探針具有較強(qiáng)的抗光氧化能力；當(dāng)用激發(fā)光連續(xù)激發(fā)孵有Mito-NO和NOC-9的HeLa細(xì)胞30 min后，細(xì)胞在紅通道的熒光沒(méi)有明顯減弱，表明探針Mito-NO與NO的反應(yīng)產(chǎn)物具有良好的抗光漂白性能。

圖6 （A）HeLa細(xì)胞外源性NO的共聚焦影像結(jié)果，在該試驗(yàn)中，細(xì)胞分別用Mito-NO，Mito-NO/NOC-9，Mito-NO/SIN-1，Mito-NO/H2O2，和 Mito-NO/ClO-處理；（B）RAW264.7內(nèi)源性NO的共聚焦熒光影像結(jié)果，在該試驗(yàn)中，細(xì)胞分別用Mito-NO，LPS/INF-γ/Mito-NO，LPS/INF-γ/AG/Mito-NO，和LPS/INF-γ/L-Name/Mito-NO處理；（C）探針Mito-NO的抗光氧化和抗光漂白能力的檢測(cè)結(jié)果，在該實(shí)驗(yàn)中，負(fù)載Mito-NO和Mito-NO/NOC-9的HeLa細(xì)胞分別用561 nm激光器連續(xù)照射30 min，然后進(jìn)行共聚焦熒光影像Fig.6 （A）Confocal images of HeLa cells pretreated with Mito-NO（2 μmol/L）and then treated with NOC-9（20 μmol/L），SIN-1（0.5 mmol/L），H2O2（0.5 mmol/L），and ClO-（0.5 mmol/L），respectively.（B）Confocal images of RAW264.7 cells treated with Mito-NO（2 μmol/L）only，or pretreated with LPS（20 mg/mL）/INF-γ（150 units/mL）for 6 h and then treated with Mito-NO（2 μmol/L），or pretreated with LPS（20 mg/mL）/INF-γ（150 units/mL）in the presence of AG（2 mmol/L）or L-Name（10 μmol/L）for 6 h and then treated with Mito-NO（2 μmol/L），respectively.（C）Confocal images of Mito-NO-loaded HeLa cells continuously excited by 561 nm laser for 30 min in the absence and presence of NOC-9.Emission was collected at 566-650 nm（λex=561 nm）

為了驗(yàn)證Mito-NO的亞細(xì)胞器定位能力，我們進(jìn)行了共染實(shí)驗(yàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，我們將探針Mito-NO與商業(yè)化亞細(xì)胞器靶向熒光探針（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針ER Tracker，溶酶體探針Lyso Tracker，線粒體探針Mito Tracker）同時(shí)孵入HeLa細(xì)胞中，然后加入NOC-9點(diǎn)亮探針在紅色通道的熒光。如圖7A所示，共染實(shí)驗(yàn)表明，Mito-NO與NO反應(yīng)產(chǎn)物的熒光影像與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針和溶酶體探針的重疊效果較差，皮爾森系數(shù)分別僅為0.35和0.25；然而與線粒體探針呈現(xiàn)良好的重疊影像，皮爾森系數(shù)可達(dá)0.88，表明探針與NO的反應(yīng)產(chǎn)物主要定位于線粒體。為了進(jìn)一步探測(cè)Mito-NO本身的定位情況，我們提高了共聚焦熒光影像儀的激光強(qiáng)度來(lái)獲得可觀測(cè)的Mi-to-NO本身的弱熒光，并在該條件下進(jìn)行了共染實(shí)驗(yàn)。如圖7B所示，Mito-NO本身與線粒體靶向探針呈現(xiàn)良好的共定位，皮爾森系數(shù)為0.8，而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體探針的共定位效果較差，皮爾森系數(shù)分別僅為0.35和0.28。這些結(jié)果表明，探針Mito-NO及其與NO的反應(yīng)產(chǎn)物均能特異性靶向細(xì)胞的線粒體。

圖7 （A）HeLa細(xì)胞中，探針Mito-NO（2 μmol/L）與NO的反應(yīng)產(chǎn)物與商業(yè)化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針ER-Tracker Green（1 μmol/L）、溶酶體探針Lyso Tracker Green DND-26（0.07 μmol/L）以及線粒體探針Mito Tracker green FM（0.2 μmol/L）的共染影像結(jié)果；（B）HeLa細(xì)胞中，探針Mito-NO（2 μmol/L）與商業(yè)化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針ER-Tracker Green（0.2 μmol/L）、溶酶體探針 Lyso Tracker Green DND-26（0.02 μmol/L）以及線粒體探針Mito Tracker green FM（0.05 μmol/L）的共染影像結(jié)果，激發(fā)和收集波長(zhǎng)：Mito-NO：λex=561 nm，λem=566 nm～650 nm；Mito Tracker/Lyso Ttracker/ER-Tracker：λex=488 nm，λem=493 nm～550 nmFig.7 （A）Confocal images of HeLa cells co-stained with Mito-NO（2 μmol/L）/ER-Tracker Green（1 μmol/L），Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso Tracker Green DND-26（0.07 μmol/L），and Mito-NO（2 μmol/L）/Mito Tracker green FM（0.2 μmol/L），and then treated with NOC-9（30 μmol/L）；（B）Confocal images of HeLa cells co-stained with Mito-NO（2 μmol/L）/ER-Tracker Green（0.2 μmol/L），Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso Tracker Green DND-26（0.02 μmol/L），and Mito-NO（2 μmol/L）/Mito-Tracker green FM（0.05 μmol/L）.For Mito-NO，emission was collected at 566 nm-650 nm（λex=561 nm）；for ER-Tracker/Lyso-Tracker/Mito Tracker，emission was collected at 493 nm-550 nm（λex=488 nm）

利用Mito-NO和本課題組之前報(bào)道的溶酶體NO探針Lyso-NO進(jìn)行了同時(shí)熒光影像線粒體和溶酶體內(nèi)源性NO的實(shí)驗(yàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，我們將Mito-NO、Lyso-NO 以及 Mito Tracker（或 Lyso Tracker）同時(shí)孵入內(nèi)皮EA.hy926細(xì)胞，然后將該細(xì)胞置于“氧糖剝奪-再灌氧（OGD/RO）”條件下以刺激該細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性NO。如圖8A所示，共聚焦影像結(jié)果表明，探針Mito-NO與線粒體探針的熒光影像重疊良好，皮爾森系數(shù)高達(dá)0.82，表明該探針能靶向線粒體并影像線粒體內(nèi)源性NO；而探針Lyso-NO與Mito-NO以及線粒體探針的熒光影像基本沒(méi)有重疊，皮爾森系數(shù)僅為0.41和0.45。如圖8B所示，探針Lyso-NO與溶酶體探針的熒光影像重疊良好，皮爾森系數(shù)高達(dá)0.84，表明該探針能靶向溶酶體并影像溶酶體內(nèi)源性NO；然而Mito-NO與Lyso-NO以及Lyso Tracker的熒光影像基本沒(méi)有重疊，皮爾森系數(shù)僅為0.31和0.24。這些結(jié)果表明，Mito-NO和Lyso-NO能同時(shí)在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)熒光影像線粒體和溶酶體內(nèi)源性NO，且相互不干擾，因此是研究線粒體和溶酶體內(nèi)NO生理功能的良好影像工具。

圖8 （A）EA.hy926細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪-再灌氧、Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso-NO（2 μmol/L）/Mito Tracker Green DND-26（0.2 μmol/L）共染后的熒光影像圖；（B）EA.hy926細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪-再灌氧、Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso-NO（2 μmol/L）/Lyso Tracker Green DND-26（0.07 μmol/L）共染后的熒光影像圖；激發(fā)和收集波長(zhǎng)：Mito-NO：λex=561 nm，λem=566 nm～650 nm；Lyso-NO：λex=633 nm，λem=638 nm～750 nm；Mito Tracker/Lyso Ttracker：λex=488 nm，λem=493 nm～550 nmFig.8 （A）Confocal images of EA.hy926 cells subjected to OGD（2 h）/RO（1 h）and then co-stained with Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso-NO（2 μmol/L）/Mito Tracker Green DND-26（0.2 μmol/L）.（B）Confocal images of EA.hy926 cells subjected to OGD（2 h）/RO（1 h）and then co-stained with Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso-NO（2 μmol/L）/Lyso Tracker Green DND-26（0.07 μmol/L）.For Mito-NO，emission was collected at 566 nm-650 nm（λex=561 nm）；for Lyso-NO，emission was collected at 638 nm-750nm（λex=633 nm）；for Lyso-Tracker/Mito Tracker，emission was collected at 493 nm-550 nm（λex=488 nm）

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了一個(gè)線粒體靶向的羅丹明脫氧酰胺型NO熒光探針Mito-NO，并在模擬生理?xiàng)l件下以及細(xì)胞內(nèi)證實(shí)了該探針能高選擇性、高靈敏性檢測(cè)線粒體內(nèi)源性NO。結(jié)合本課題組之前報(bào)道的一個(gè)溶酶體靶向的硅羅丹明脫氧內(nèi)酰胺型NO熒光探針Lyso-NO，本文成功地實(shí)現(xiàn)了線粒體和溶酶體內(nèi)源性NO的同時(shí)熒光影像。本工作為NO生理病理的深層次研究提供了優(yōu)良的熒光影像工具。