幽門螺桿菌感染小鼠模型的應(yīng)用進(jìn)展

朱 媚,馬郁荃,谷海瀛,2*

（1.寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,浙江 寧波 315211;2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,浙江 寧波 315020）

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種持續(xù)定植于胃腸黏膜有鞭毛的革蘭陰性微需氧致病菌[1].H.pylori感染是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因素,并且與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、胃癌的發(fā)生密切相關(guān).H.pylori感染也可能與缺鐵性貧血(IDA)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、阿爾茨海默病(AD)等胃腸外疾病有關(guān)[2-3].H.pylori感染非常普遍,全球總感染率為44.3%,發(fā)展中國家明顯高于發(fā)達(dá)國家[4].H.pylori致病機(jī)制探索、新型治療藥物篩選和疫苗制備都需要建立合適的動物感染模型.

悉生乳豬是最早成功制備H.pylori感染的動物模型,H.pylori感染的悉生乳豬只出現(xiàn)了淋巴細(xì)胞性胃炎,但沒有出現(xiàn)胃潰瘍或胃癌等其他典型病變[5].由于乳豬實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間比較短,因此無法研究其慢性感染[6].H.pylori感染的恒河猴會出現(xiàn)萎縮性胃炎,但沒有發(fā)展為消化性潰瘍或胃癌等病變[7].研究人員可以使用胃鏡連續(xù)觀察恒河猴胃部病變[6],但實(shí)驗(yàn)觀察周期較長.悉生乳豬和恒河猴的飼養(yǎng)條件復(fù)雜,價(jià)格昂貴,因此都難以推廣.H.pylori感染的豚鼠只出現(xiàn)了慢性胃竇炎,沒有發(fā)生萎縮性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等病變[8],因此豚鼠僅適用于建立H.pylori感染的胃炎模型.H.pylori感染的蒙古沙鼠會出現(xiàn)萎縮性胃炎、胃潰瘍、腸上皮化生以及胃腺癌等疾病[9],但目前缺乏生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因沙鼠的方法,因此研究H.pylori感染過程中宿主沙鼠的作用受到了限制[10].盡管小鼠不是H.pylori感染的最適動物模型,但小鼠是研究H.pylori致病性使用最廣泛的動物宿主[10].小鼠遺傳背景明確、品系豐富、繁殖周期短、飼養(yǎng)方便、價(jià)格便宜,小鼠相關(guān)的實(shí)驗(yàn)試劑也較多,并且基因工程小鼠在不斷增加,因此小鼠仍然是研究H.pylori的主要動物模型[9].

1 H.pylori 感染消化系統(tǒng)疾病的小鼠模型

早期研究表明H.pylori感染宿主的范圍有限,臨床分離菌株不易定植于小鼠胃黏膜.1997 年Lee等[11]首次使用H.pylori悉尼菌株(Sydney Strain,SS1)成功建立了小鼠感染模型,組織病理學(xué)和培養(yǎng)結(jié)果顯示該菌株在C57BL/6 小鼠胃部有較好定植載量.野生型小鼠可用來制備H.pylori感染胃炎模型,還可用于測試不同H.pylori突變株的定植特性[10].在不使用基因工程小鼠或化學(xué)致癌物的情況下,單獨(dú)的H.pylori感染野生型小鼠不會誘發(fā)胃癌[12].基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠模型還可用來制備H.pylori感染的腸上皮化生、異型增生或胃癌等模型,并可用于評估特定宿主基因在H.pylori定植感染和胃癌進(jìn)展中的作用.H.pylori感染消化系統(tǒng)疾病小鼠模型的制備方法和結(jié)果參照表1.

1.1 活動性胃炎和萎縮性胃炎

Lee 等[11]使用H.pyloriSS1 感染不同品系的小鼠,發(fā)現(xiàn)菌株在C57BL/6 小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出現(xiàn)較高的定植水平.感染3.5 個(gè)月時(shí)的C57BL/6 小鼠胃竇和胃體出現(xiàn)了輕度胃炎,感染6 個(gè)月時(shí)的胃炎明顯加重,感染8 個(gè)月時(shí)小鼠出現(xiàn)了慢性活動性胃炎以及胃體黏膜萎縮變化.Kim 等[13]使用H.pyloriSS1感染C57BL/6 小鼠,感染8 周時(shí)的小鼠胃底和胃竇固有層和黏膜下層均可見炎性細(xì)胞浸潤;感染16周和24 周時(shí)的胃黏膜中單核細(xì)胞增多,胃底可見腺體萎縮;感染36 周時(shí)的小鼠胃壁增厚,黏膜折疊肥大;感染50 周時(shí)的胃黏膜增生達(dá)到峰值,胃腺損失更加明顯;感染80 周時(shí)的胃竇出現(xiàn)了增生性胃炎,而胃體和胃底出現(xiàn)了萎縮性胃炎,但未觀察到胃潰瘍或胃癌.

1.2 化生、異型增生和胃癌

Kuzushita 等[14]使用H.pyloriSS1 感染p27?/?C57BL/6 小鼠模型,感染30 周和45 周時(shí)的小鼠胃部腸上皮化生發(fā)生率是40%(4/10)和67%(4/6),感染60 周時(shí),58%(7/12)小鼠出現(xiàn)異型增生和胃腺癌,其胃部炎癥和病變進(jìn)程與人類腸型胃癌相似,而SS1 感染的野生型小鼠沒有出現(xiàn)胃癌.他們認(rèn)為p27 缺失和H.pylori定植是導(dǎo)致該模型形成胃癌的必要因素.該小鼠模型可用于H.pylori感染相關(guān)腸上皮化生、異型增生和胃癌的研究.Fox 等[15]使用H.pyloriSS1 感染TFF2?/?C57BL/6×Sv129 小鼠,感染6 個(gè)月和19 個(gè)月時(shí)的小鼠胃黏膜IFN-γ 水平顯著提高,小鼠胃竇出現(xiàn)了嚴(yán)重的異型增生.他們認(rèn)為H.pylori感染過程中,TFF2 可能通過調(diào)節(jié)IFN-γ 水平來保護(hù)胃黏膜和抑制炎癥.該實(shí)驗(yàn)為研究H.pylori感染的異型增生提供了很好的模型[16].Nam 等[17]先給iNOS?/?C57BL/6 小鼠和野生型C57BL/6 小鼠服用N-甲基-N-亞硝基脲(MNU),再使用H.pyloriSS1 感染小鼠,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示iNOS缺乏型小鼠的胃腫瘤發(fā)生率是31.0% (9/29),而野生型小鼠是72.7% (16/22).他們還發(fā)現(xiàn)iNOS 缺乏能引起NO 水平下降,有助于降低H.pylori相關(guān)胃癌的發(fā)生.

2 H.pylori 感染非消化系統(tǒng)疾病的小鼠模型

動物模型也是研究H.pylori感染對非消化系統(tǒng)疾病疾影響的重要工具,目前已經(jīng)用于研究H.pylori非消化系統(tǒng)的小鼠模型見表2.H.pylori感染還被報(bào)道可能與慢性蕁麻疹、帽狀息肉病、帕金森病、動脈粥樣硬化和腦卒中等呈正相關(guān),與哮喘、肥胖等疾病呈負(fù)相關(guān),但這些相關(guān)的因果關(guān)系尚未證實(shí)[2-3],能否通過小鼠模型來證實(shí)H.pylori感染與這些疾病的關(guān)系有待研究.

表1 H.pylori 感染小鼠模型的制備方法和結(jié)果(消化系統(tǒng)疾病)

表2 H.pylori 感染小鼠模型(非消化系統(tǒng)疾病)

2.1 血液系統(tǒng)

H.pylori感染被認(rèn)為可能與IDA和ITP發(fā)生有關(guān)[2].Fukuda 等[18]使用H.pyloriSS1 灌胃不同品系小鼠來研究H.pylori感染與ITP 的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)BALB/c 小鼠感染后,血小板計(jì)數(shù)顯著減少.結(jié)果表明H.pylori感染與ITP 呈正相關(guān),但H.pyloriSS1 感染的DBA/2 和C57BL/6 小鼠模型與ITP 發(fā)生沒有相關(guān)性.Burns 等[19]使用H.pyloriSS1 感染INS-GAS 小鼠模型,小鼠感染后的血紅蛋白和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)減少,而紅細(xì)胞平均體積升高.結(jié)果表明小鼠出現(xiàn)的貧血是再生性貧血,而不是大多數(shù)缺鐵性貧血時(shí)典型的小細(xì)胞性、非再生性貧血,提示H.pylori慢性感染的INS-GAS 小鼠模型與IDA 沒有相關(guān)性.這些研究均提示H.pylori感染對胃腸外疾病的影響與模型動物宿主的選擇密切相關(guān).

2.2 呼吸系統(tǒng)

近年來已有研究人員使用小鼠模型來探索H.pylori對肺部的影響.Arismendi 等[20]使用H.pyloriNCTC 11638 經(jīng)氣管感染BALB/c 小鼠,小鼠感染后肺組織H.pylori培養(yǎng)陽性,感染7 d 時(shí)的肺泡出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤,感染14 d 時(shí)的炎性細(xì)胞侵潤加重并出現(xiàn)肺纖維化,感染30 d 時(shí)的肺組織嚴(yán)重纖維化進(jìn)而影響到肺功能.實(shí)驗(yàn)表明H.pylori感染導(dǎo)致肺組織形態(tài)學(xué)改變、炎性細(xì)胞增多和肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞退化,提示H.pylori感染與肺部炎癥呈正相關(guān).Arismendi 等[21]使用同樣方法感染BALB/c 小鼠來評估H.pylori感染對肺部炎癥標(biāo)志物表達(dá)的影響,小鼠感染后的肺水腫指數(shù)上升,支氣管肺泡灌洗上清液中活細(xì)胞百分比下降,而乳酸脫氫酶上升,小鼠肺組織染色可見典型H.pylori.實(shí)驗(yàn)表明,H.pylori經(jīng)氣管感染的小鼠出現(xiàn)肺部炎癥反應(yīng),提示H.pylori感染與肺部炎癥呈正相關(guān).

2.3 神經(jīng)系統(tǒng)

最近流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)H.pylori感染可能與AD 發(fā)生有關(guān)[22],而生活條件或教育水平等因素與H.pylori感染和AD 都有關(guān),這些共同的影響因素會導(dǎo)致流行病學(xué)研究結(jié)論具有局限性[23],因此有研究人員使用小鼠模型進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)來探索H.pylori感染與AD 的關(guān)系.Baudron 等[22]使用H.pyloriSS1 灌胃C57BL/6J 小鼠,小鼠感染18 個(gè)月的后腦內(nèi)沒有出現(xiàn)淀粉樣斑塊和腦神經(jīng)炎癥,并且腦內(nèi)也檢測不到H.pyloriDNA.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H.pyloriSS1 感染的C57BL/6J 小鼠沒有發(fā)生AD,提示H.pylori感染與AD 發(fā)生沒有相關(guān)性.

3 探索H.pylori 生物被膜作用與宿主因素的小鼠模型

3.1 H.pylori 生物被膜作用

既往研究表明H.pylori致病性與細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A、空泡毒素A、脲酶、鞭毛、黏附素和外膜蛋白等毒力因子有關(guān)[10].新的研究和觀點(diǎn)認(rèn)為生物被膜的形成在H.pylori定植過程中也扮演著重要角色[24],已有研究人員使用小鼠模型對H.pylori生物被膜形成進(jìn)行初步探索.Attaran 等[25]使用胃炎患者分離株H.pylori19B和4B感染C57BL/6J 小鼠模型,利用抗H.pylori特異性免疫熒光抗體和掃描電子顯微鏡檢測小鼠胃部H.pylori的定植和生物被膜形成能力,發(fā)現(xiàn)小鼠感染后的胃黏膜出現(xiàn)了明顯的慢性炎性細(xì)胞浸潤,球性H.pylori嵌套在無定形基質(zhì)中,牢固地附著在鱗狀上皮和腺上皮上,表明H.pylori能在小鼠胃的各個(gè)部位形成生物被膜.實(shí)驗(yàn)證實(shí)C57BL/6J 小鼠體內(nèi)H.pylori生物被膜的形成.但目前尚不清楚體內(nèi)生物被膜基質(zhì)是由細(xì)菌自己產(chǎn)生還是由宿主衍生,生物被膜是否為H.pylori提供了更有利的定植生態(tài)位也不明確,生物被膜在增加抗生素耐藥性和干擾免疫清除中的作用也不清楚[24],這些都需要更多的動物模型進(jìn)一步研究.

3.2 H.pylori 感染的宿主小鼠因素

近年來,基因工程小鼠廣泛用于研究H.pylori感染過程中細(xì)菌與宿主因素的相互作用.Muthupalani 等[26]使用 Muc5ac?/?小鼠模型研究黏蛋白Muc5ac 在H.pylori感染中的作用,他們發(fā)現(xiàn)該小鼠模型傾向于在胃竇幽門區(qū)域自發(fā)性地出現(xiàn)上皮增生,而H.pylori感染可以減弱其胃體黏膜上皮化生.該研究表明Muc5ac 能維持胃竇上皮細(xì)胞平衡,并抑制H.pylori定植感染.Suarez 等[27]使用C57BL/6Nod1?/?和INS-GASNod1?/?小鼠模型來研究天然免疫受體NOD1 在H.pylori定植感染中的作用,他們發(fā)現(xiàn)Nod1的缺乏會導(dǎo)致H.pylori感染,引起更嚴(yán)重的炎癥和損傷,改變胃黏膜內(nèi)趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)組合,加速胃癌的發(fā)生.他們認(rèn)為Nod1可能是通過改變巨噬細(xì)胞極化來發(fā)揮其限制作用,而Nod1的缺乏會有助于H.pylori逃避宿主免疫清除.Neumeyer 等[16]使用RNF43H292R/H295R小鼠模型研究H.pylori慢性感染在小鼠胃部病變進(jìn)程中的作用,他們發(fā)現(xiàn)H.pylori感染加重了腫瘤抑制因子Rnf43突變小鼠的胃部病變,導(dǎo)致小鼠胃部CD44 表達(dá)增加,而NF-kB 信號過度激活.研究表明Rnf43突變與H.pylori引起的持續(xù)慢性炎癥共同促進(jìn)了胃部惡性腫瘤的發(fā)生,他們推測H.pylori感染激活NF-kB 會進(jìn)一步上調(diào)CD44 的表達(dá),從而導(dǎo)致胃部病變向更嚴(yán)重的方向發(fā)展.

4 總結(jié)與展望

不同動物對H.pylori感染表現(xiàn)出不同的宿主反應(yīng)和免疫應(yīng)答,沒有任何一種動物感染模型能夠完全復(fù)制出H.pylori感染人類引起的所有病理結(jié)果.目前尚未見H.pylori感染導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)胃潰瘍或十二指腸潰瘍的報(bào)道,能否開發(fā)出H.pylori感染小鼠的消化性潰瘍模型還不清楚.提高小鼠感染模型的穩(wěn)定性和可復(fù)制性,使其在更短時(shí)間內(nèi)更好地模擬人類感染后的病變還有待探索合適的實(shí)驗(yàn)條件.