高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉及豬肉制品中?；撬岷?/h1>
2021-05-17 13:31周海珍栗亞瓊王淑霞王祎娟
肉類研究 2021年2期
周海珍 栗亞瓊 王淑霞 王祎娟
摘 要：建立豬肉及豬肉制品中?；撬岷康母咝б合嗌V-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測方法。樣品經水超聲提取后，經乙腈沉淀蛋白，正己烷除脂肪，采用HPLC-MS/MS法定量測定。結果表明：在1～1 000 ng/mL線性范圍內，?；撬岬幕貧w方程呈良好的線性關系，R2>0.998，在豬肉和豬肉制品陽性樣品中加標水平為20～50 mg/100 g時，牛磺酸的加標回收率為92.78%～104.96%，相對標準偏差為1.39%～3.80%;該方法的儀器檢出限為0.3 ng/mL，儀器定量限為1 ng/mL，方法檢出限為0.1 mg/100 g，方法定量限為0.5 mg/100 g;該方法檢出限低，回收率、靈敏度、準確度和精密度均較高，且操作簡便、快捷，適用于豬肉及豬肉制品中牛磺酸含量的準確定性定量。
關鍵詞：豬肉;豬肉制品;高效液相色譜-串聯質譜法;牛磺酸;檢測
Determination of Taurine in Pork and Pork Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
ZHOU Haizhen1， LI Yaqiong1，WANG Shuxia2， WANG Yijuan2
（1.Food Testing Department， Luohe Vocational College of Food， Luohe 462300， China;
2.Technical Center， Shineway Group Co. Ltd.， Luohe 462003， China）
Abstract： This study intended to develop a method for rapid determination of taurine in pork and pork products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. The samples were ultrasonically extracted with water， added with acetonitrile to precipitate protein， and re-extracted with n-hexane to remove fat. Then the analytes were detected by HPLC-MS/MS. The matrix-matched calibration curve developed showed a good linearity within the concentration range from 1 to 1 000 ng/mL （R2 > 0.998）. The average recovery for positive samples spiked with taurine at concentration levels of 20–50 mg/100 g was from 92.78% to 104.96%， with relative standard deviation （RSD） between 1.39% and 3.80%. The instrumental detection limit and quantitation limit were 0.3 ng/mL and 1 ng/mL respectively; the method detection limit and quantitation limit were 0.1 mg/100 g and 0.5 mg/100 g respectively. The method is characterized by low detection limit， as well as high recovery， sensitivity， accuracy and precision. It is simple and quick to operate and suitable for the accurate determination of taurine in pork and pork products.
Keywords： pork; pork products; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; taurine; determination
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210203-030
中圖分類號：TS252.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）02-0035-06
引文格式：
周海珍， 栗亞瓊， 王淑霞， 等. 高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉及豬肉制品中牛磺酸含量[J]. 肉類研究， 2021， 35（2）： 35-40. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210203-030.? ? http：//www.rlyj.net.cn
ZHOU Haizhen， LI Yaqiong， WANG Shuxia， et al. Determination of taurine in pork and pork products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2021， 35（2）： 35-40. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210203-030.? ? http：//www.rlyj.net.cn
?；撬?，化學名為2-氨基乙磺酸，俗稱牛膽堿，是一種存在于動物體內的含硫非蛋白氨基酸[1-2]。?；撬嵩洷徽J為是含硫氨基酸的無功能代謝產物[3]，直到1975年Hayes等[4]報道，采用以酪蛋白為主要蛋白來源的飼料飼喂貓，因其缺乏?；撬?，可引起貓的視網膜變性，若長期缺乏，可導致貓失明，從而引起了人們對牛磺酸營養(yǎng)作用的高度重視。
研究表明，?；撬釋ιL發(fā)育有一定影響，是人體條件性必需氨基酸[5]，具有促進脂肪和脂溶性物質吸收、提高機體免疫力、促進生長及保護細胞、改善心肌缺血損傷及促進蛋白質、氨基酸、糖代謝等生理學功能[6-8]，適量的?；撬崮艽龠M機體的激素分泌，增強和改善機體的各種功能，是調節(jié)機體正常活動的活性物質，而缺乏?；撬釙е露喾N疾病的發(fā)生[9]?；谂；撬岬闹匾砉δ?，準確檢測各類食品中牛磺酸的含量對指導營養(yǎng)的均衡攝入具有重要意義。
天然食品中，海洋動物的?；撬岷枯^高，豬肉、牛肉、雞肉等畜禽肉中?；撬岷枯^豐富，雞胚中?；撬岷考s為哺乳動物的100 倍[10]。食品中?；撬岬臋z測方法主要包括液相色譜法[11-16]、氨基酸分析儀法[17-18]、離子色譜法[19]、分光光度法[20]和液相色譜-串聯質譜法[21-24]等;而對于藥物[25-26]、大鼠血液及組織[27-29]等不同基質中?；撬岬臋z測方法研究，國內外也有相關報道。在眾多檢測方法中，最常用的方法為高效液相色譜法，但因?；撬岬淖贤馕蛰^弱，常采用衍生化方法提高檢測靈敏度，而衍生化反應操作較繁瑣，要求較高，影響因素較多。本研究旨在利用高效液相色譜-串聯質譜儀建立一種操作簡便、檢出限低、靈敏度高、定性及定量準確的牛磺酸含量檢測方法，以滿足豬肉和豬肉制品中?；撬岷康臏蚀_定性及定量。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
豬肉、豬肉圓火腿為市售。
牛磺酸標準物質（100 mg，純度≥99.6%） 中國標準物質中心;乙腈（質譜純）、乙酸銨（質譜純） 美國Fisher公司;亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、正己烷 天津市科密歐化學試劑有限公司。
1.2 儀器與設備
Xevo TQ MS高效液相色譜-串聯質譜儀、BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、BEH-HILIC色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 美國Waters公司;BSA224S電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;5200DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;VX-III多管平行振蕩器 北京Targin公司;JW-3021HR離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司;MS 3 basic渦旋振蕩器、高速分散機 德國IKA公司;0.22 μm微孔濾膜（有機相） 天津市津騰實驗設備有限公司。
1.3 方法
1.3.1 標準溶液的配制
?；撬針藴蕛湟海?.0 mg/mL）：準確稱取10 mg（精確至0.1 mg）?；撬針藴饰镔|于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。
?；撬針藴手虚g溶液（10 μg/mL）：準確吸取1.0 mg/mL?；撬針藴蕛湟? mL于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。
?；撬針藴使ぷ魅芤海簻蚀_吸取一定量的10 μg/mL牛磺酸標準中間溶液，用體積分數75%乙腈水溶液稀釋成質量濃度分別為1、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的標準工作溶液，現配現用。
1.3.2 高效液相色譜條件
BEH-HILIC色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱溫40 ℃，流動相A為超純水，流動相B為乙腈，流速0.40 mL/min，進樣量2 μL，流動相及梯度洗脫條件見表1。
1.3.3 質譜條件
電離模式：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）負離子模式（ESI-）;檢測模式：多反應監(jiān)測（multiple response monitoring，MRM）模式;毛細管電壓2.8 kV;離子源溫度150 ℃;干燥氣流量950 L/h;干燥氣溫度450 ℃;錐孔反吹氣流量40 L/h，MRM監(jiān)測條件如表2所示。
1.3.4 樣品處理
1.3.4.1 樣品提取
準確稱取經絞肉機攪碎處理均勻的樣品2 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入20 mL約40 ℃的溫水[13]，采用高速分散機處理約0.5 min，使其完全分散，渦旋振蕩提取10 min，將離心管中的樣品轉移至100 mL容量瓶中，用約50 mL 40 ℃左右的溫水分2～3 次洗滌離心管，洗滌液合并轉入100 mL容量瓶中，超聲提取10 min，待樣液冷卻至室溫后用水定容至100 mL，移取10 mL定容液于另一50 mL離心管中，加入10 mL水飽和正己烷，渦旋振蕩混合5 min，于4 ℃、7 000 r/min離心5 min。
1.3.4.2 樣品凈化
準確吸取1 mL離心后下層清液于15 mL離心管中，加入3 mL乙腈用以沉淀蛋白質，渦旋振蕩混勻1 min，7 000 r/min離心5 min，吸取1 mL上清液過0.22 μm有機濾膜，濾液供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。
1.4 數據處理
采用與高效液相色譜-串聯質譜儀配套使用的數據采集和處理一體化軟件MassLynx V4.1（美國Waters公司）進行實驗數據的采集和實驗結果的自動處理，經軟件自動處理得到試樣溶液中?；撬岬馁|量濃度，按式（1）計算試樣中?；撬岷?。
（1）
式中：X為試樣中牛磺酸含量/（mg/100 g）;ρ為從標準工作曲線得到的試樣溶液中?；撬岬馁|量濃度/（ng/mL）;
V為樣液最終定容體積/mL;m為試樣質量/g。
2 結果與分析
2.1 質譜條件優(yōu)化
采用10 μg/mL?；撬針藴嗜芤和ㄟ^蠕動泵注射至離子源，分別在ESI+模式和ESI-模式下進行全掃描，結果表明，牛磺酸在ESI-模式下的響應值明顯高于ESI+模式，且因牛磺酸含有磺基結構，在ESI-模式下，較易失去H形成較為穩(wěn)定的[M—H]-分子離子，因此選擇ESI-模式。確定離子模式后，分別選擇全掃描和子離子掃描模式，獲得?；撬岬哪鸽x子掃描圖譜（圖1）和特征碎片離子掃描圖譜（圖2），選擇離子豐度最強的碎片離子對為定量離子對，離子豐度相對較強的離子對為定性離子對，同時對其毛細管電壓、碎裂電壓和碰撞能量等條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的質譜條件如1.3.2節(jié)所示。
2.2 高效液相色譜條件優(yōu)化
采用優(yōu)化后的質譜條件（1.3.2節(jié)），對比BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）與BEH-HILIC色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）對10 ng/mL?；撬針藴嗜芤旱姆蛛x效果。
當使用BEH-C18柱進行分離時，牛磺酸的保留效果不好，出峰過快（約0.3 min），且峰型嚴重不對稱，這可能是?；撬針O性較強所致，更換不同流動相，添加甲酸銨、乙酸銨等峰型改善劑，同時調整不同流動相的洗脫梯度，?；撬崛詿o法得到較好保留和相對較優(yōu)的峰型。
當使用BEH-HILIC柱進行分離時，因HILIC柱裝填了中性的酰胺鍵合基團，提高了其對強極性、水溶性堿性有機物的保留能力，其對脂肪類物質基本不保留，從而可有效去除基質效應的影響，當采用乙腈、超純水作為流動相時，其對?；撬嵊休^好的保留，且色譜峰峰型對稱、美觀，靈敏度高。
采用優(yōu)化后的高效液相色譜條件（1.3.1節(jié)）和質譜條件（1.3.2節(jié)）測定10 ng/mL和1 ng/mL?；撬針藴嗜芤?，色譜圖分別如圖3和圖4所示。
2.3 樣品前處理條件優(yōu)化
豬肉及豬肉制品中含有大量的蛋白質和脂肪，若不去除，會給?；撬岬臋z測造成一定的基質干擾。去除蛋白質的主要方法有固相萃取法[30-31]和蛋白沉淀法[32-34]，固相萃取法成本較高，凈化步驟較為繁瑣，而蛋白沉淀法操作簡便、快捷，因此本研究使用蛋白沉淀法對樣品進行凈化處理。去除肉及肉制品中脂肪一般采用正己烷除脂肪法，本研究采用此法得到了很好的除脂肪效果。
分別選用亞鐵氰化鉀、乙酸鋅混合溶液（92 g/L亞鐵氰化鉀、183 g/L乙酸鋅體積比1∶1混合）和乙腈作為沉淀劑。當采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅混合溶液作為沉淀劑時，利用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅反應生成的氰亞鐵酸鋅沉淀挾走或吸附干擾物質，與蛋白質共沉淀而達到凈化目的，凈化效果較好，基本可消除基質干擾，測定豬肉及豬肉制品中牛磺酸含量時，加標回收率可達80%以上，但本研究選用的色譜柱為BEH-HILIC柱，采用純水相作為上機定容液時，對色譜柱的填料有一定破壞作用，且因溶劑效應，導致色譜峰的對稱性變差，峰型變寬。而采用乙腈作為沉淀劑時，乙腈可降低水的介電常數，導致具有表面水層的生物大分子脫水聚集后沉淀析出，對蛋白質具有很好的沉淀效果，其凈化效果好，可消除基質干擾，測定豬肉及豬肉制品中?；撬岷繒r，加標回收率可達90%以上，且采用體積分數75%乙腈-水溶液作為上機定容液時，對BEH-HILIC色譜柱的填料無破壞作用，無溶劑效應，峰型窄而尖銳對稱。因此選擇乙腈作為蛋白沉淀劑。
2.4 線性方程和定量限
按優(yōu)化后的儀器條件及樣品前處理方法對牛磺酸標準工作溶液進行測定。以定量離子峰面積（y）對?；撬豳|量濃度（x，ng/mL）繪制標準曲線，其回歸方程為y=3 746.9x+354.2（R2=0.998 9）。以定量離子對3 倍信噪比為檢出限，得到該方法的儀器檢出限為0.3 ng/mL（實際3 倍信噪比為3.52），10 倍信噪比為定量限，得到該方法的儀器定量限為1 ng/mL（實際10 倍信噪比為11.59）。因受樣品基質影響，又未找到牛磺酸陰性豬肉和豬肉制品樣品，從而無法獲得在檢出限或接近檢出限的樣品數據，故采用校準方程的適用范圍評估方法檢出限[35]。本研究采用式（2）計算XLOD。
（2）
式中：S為?；撬彡栃曰|樣品重復測定12 次的校準標準誤差（儀器響應的標準偏差）/（ng/mL）;b為回歸方程的斜率。
通過實驗得到S=6 298.3 ng/mL，因此XLOD=5 ng/mL。
將XLOD=5 ng/mL代入公式（1），XLOD即為公式（1）中的ρ，計算得到對應的方法檢出限為0.1 mg/100 g，以3～10 倍檢出限作為方法定量限[35]，最終確定本方法的定量限為0.5 mg/100 g。
2.5 加標回收率和精密度
2.5.1 豬肉樣品的加標回收率和精密度
取經絞肉機攪碎處理均勻的同一豬肉樣品，按表3設計實驗。因未找到牛磺酸陰性豬肉樣品，為減小樣品中較高的?；撬岷繉訕嘶厥章实挠绊?，故未選擇定量限做加標回收實驗，而選擇與樣品中?；撬岷肯喈數募訕肆亢蜏p半的加標量進行加標實驗（下同）。本研究所用豬肉樣品為同一豬肉樣品，表3中測得的加標回收率結果均為扣除豬肉樣品中?；撬岷克媒Y果。
由表3可知，豬肉樣品中?；撬岷繛?2.3 mg/100 g，其加標回收率為92.78%～104.96%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.39%～3.77%。
2.5.2 豬肉制品樣品的加標回收率和精密度
取經絞肉機攪碎處理均勻的同一豬肉圓火腿樣品，按表4設計實驗，測得的加標回收率結果均為扣除豬肉圓火腿樣品中牛磺酸含量所得結果。
由表4可知，豬肉制品（豬肉圓火腿）中?；撬岷繛?9.8 mg/100 g，其加標回收率為93.10%～104.70%，RSD為1.70%～3.80%。
3 討 論
對比了ESI+和ESI-模式下牛磺酸的響應值，結合?；撬岬慕Y構特點，選擇在ESI-模式下進行質譜方法的優(yōu)化，通過全掃描和子離子掃描，確定了牛磺酸的母離子和子離子，同時優(yōu)化了毛細管電壓、干燥氣流量、碰撞能等質譜參數;通過對比BEH-C18和BEH-HILIC色譜柱對牛磺酸的保留和分離效果，選擇對牛磺酸保留效果好、色譜峰峰型對稱、靈敏度高且基質效應低的BEH-HILIC色譜柱，同時優(yōu)化了流動相及洗脫梯度，達到了很好的保留和分離效果。
Mario[22]、Massimo[23]、Chen Zhi[25]、潘軍[26]等采用質譜法對能量飲料和藥片中?；撬岷窟M行檢測，但能量飲料和藥片相對于豬肉及豬肉制品，沒有蛋白質、脂肪等大分子雜質的干擾，處理過程相對較簡便，甚至可以直接測定，而豬肉及豬肉制品中的蛋白質、脂肪等會對?；撬岬臋z測造成一定的基質干擾，需采取合適的方法去除。因牛磺酸可溶于水，不溶于乙醚、正己烷等有機溶劑，結合GB 5009.169—2016《食品安全國家標準 食品中?；撬岬臏y定》[13]中前處理方法，選擇用水進行提取，正己烷除脂肪，同時對比了亞鐵氰化鉀、乙酸鋅混合溶液和乙腈的除蛋白效果，結合加標回收率、基質效應和BEH-HILIC色譜柱的特性，最終選擇采用乙腈作為蛋白沉淀劑，達到了很好的除雜效果。
采用優(yōu)化后的方法對豬肉和豬肉制品中的牛磺酸含量進行檢測，在質量濃度1～1 000 ng/mL范圍內，?；撬岬幕貧w方程線性良好，在陽性樣品中添加水平為20～50 mg/100 g時，?；撬岬募訕嘶厥章蕿?2.78%～104.96%，RSD為1.39%～3.80%，方法檢出限為0.1 mg/100 g，定量限為0.5 mg/100 g，與林琳等[24]建立的方法比較，本研究的方法檢出限和定量限均更低，能滿足豬肉和豬肉制品中?；撬岬目焖俣ㄐ院投繖z測。
本研究使用高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬肉及豬肉制品中牛磺酸的含量，對準確檢測各類動物源性食品中牛磺酸的含量、指導營養(yǎng)的均衡攝入具有重要意義。但本研究只針對?；撬? 種目標物進行了檢測，與對多種目標物同時檢測相比，其提取和分離過程均相對簡單，為提高方法的實用性和應用價值，需在本方法的基礎上，參考Mario[22]、Chen Zhi[25]等建立的方法，繼續(xù)加強不同基質中牛磺酸與其他多種營養(yǎng)素同時檢測的方法研究。
4 結 論
本研究優(yōu)化了牛磺酸測定的高效液相色譜條件、質譜條件和樣品提取及凈化步驟，建立了豬肉和豬肉制品中?；撬岷康母咝б合嗌V-串聯質譜快速檢測方法，具有靈敏度高、檢出限低、雜峰干擾小、回收率高、定性定量準確、檢測快速等特點，適用于豬肉和豬肉制品中?；撬岷康臏蚀_定性定量，對準確檢測各類動物源性食品中?；撬岬暮俊⒅笇I養(yǎng)的均衡攝入具有重要意義。
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周海珍 栗亞瓊 王淑霞 王祎娟
摘 要：建立豬肉及豬肉制品中?；撬岷康母咝б合嗌V-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測方法。樣品經水超聲提取后，經乙腈沉淀蛋白，正己烷除脂肪，采用HPLC-MS/MS法定量測定。結果表明：在1～1 000 ng/mL線性范圍內，?；撬岬幕貧w方程呈良好的線性關系，R2>0.998，在豬肉和豬肉制品陽性樣品中加標水平為20～50 mg/100 g時，牛磺酸的加標回收率為92.78%～104.96%，相對標準偏差為1.39%～3.80%;該方法的儀器檢出限為0.3 ng/mL，儀器定量限為1 ng/mL，方法檢出限為0.1 mg/100 g，方法定量限為0.5 mg/100 g;該方法檢出限低，回收率、靈敏度、準確度和精密度均較高，且操作簡便、快捷，適用于豬肉及豬肉制品中牛磺酸含量的準確定性定量。
關鍵詞：豬肉;豬肉制品;高效液相色譜-串聯質譜法;牛磺酸;檢測
Determination of Taurine in Pork and Pork Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
ZHOU Haizhen1， LI Yaqiong1，WANG Shuxia2， WANG Yijuan2
（1.Food Testing Department， Luohe Vocational College of Food， Luohe 462300， China;
2.Technical Center， Shineway Group Co. Ltd.， Luohe 462003， China）
Abstract： This study intended to develop a method for rapid determination of taurine in pork and pork products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. The samples were ultrasonically extracted with water， added with acetonitrile to precipitate protein， and re-extracted with n-hexane to remove fat. Then the analytes were detected by HPLC-MS/MS. The matrix-matched calibration curve developed showed a good linearity within the concentration range from 1 to 1 000 ng/mL （R2 > 0.998）. The average recovery for positive samples spiked with taurine at concentration levels of 20–50 mg/100 g was from 92.78% to 104.96%， with relative standard deviation （RSD） between 1.39% and 3.80%. The instrumental detection limit and quantitation limit were 0.3 ng/mL and 1 ng/mL respectively; the method detection limit and quantitation limit were 0.1 mg/100 g and 0.5 mg/100 g respectively. The method is characterized by low detection limit， as well as high recovery， sensitivity， accuracy and precision. It is simple and quick to operate and suitable for the accurate determination of taurine in pork and pork products.
Keywords： pork; pork products; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; taurine; determination
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210203-030
中圖分類號：TS252.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）02-0035-06
引文格式：
周海珍， 栗亞瓊， 王淑霞， 等. 高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉及豬肉制品中牛磺酸含量[J]. 肉類研究， 2021， 35（2）： 35-40. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210203-030.? ? http：//www.rlyj.net.cn
ZHOU Haizhen， LI Yaqiong， WANG Shuxia， et al. Determination of taurine in pork and pork products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2021， 35（2）： 35-40. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210203-030.? ? http：//www.rlyj.net.cn
?；撬?，化學名為2-氨基乙磺酸，俗稱牛膽堿，是一種存在于動物體內的含硫非蛋白氨基酸[1-2]。?；撬嵩洷徽J為是含硫氨基酸的無功能代謝產物[3]，直到1975年Hayes等[4]報道，采用以酪蛋白為主要蛋白來源的飼料飼喂貓，因其缺乏?；撬?，可引起貓的視網膜變性，若長期缺乏，可導致貓失明，從而引起了人們對牛磺酸營養(yǎng)作用的高度重視。
研究表明，?；撬釋ιL發(fā)育有一定影響，是人體條件性必需氨基酸[5]，具有促進脂肪和脂溶性物質吸收、提高機體免疫力、促進生長及保護細胞、改善心肌缺血損傷及促進蛋白質、氨基酸、糖代謝等生理學功能[6-8]，適量的?；撬崮艽龠M機體的激素分泌，增強和改善機體的各種功能，是調節(jié)機體正常活動的活性物質，而缺乏?；撬釙е露喾N疾病的發(fā)生[9]?；谂；撬岬闹匾砉δ?，準確檢測各類食品中牛磺酸的含量對指導營養(yǎng)的均衡攝入具有重要意義。
天然食品中，海洋動物的?；撬岷枯^高，豬肉、牛肉、雞肉等畜禽肉中?；撬岷枯^豐富，雞胚中?；撬岷考s為哺乳動物的100 倍[10]。食品中?；撬岬臋z測方法主要包括液相色譜法[11-16]、氨基酸分析儀法[17-18]、離子色譜法[19]、分光光度法[20]和液相色譜-串聯質譜法[21-24]等;而對于藥物[25-26]、大鼠血液及組織[27-29]等不同基質中?；撬岬臋z測方法研究，國內外也有相關報道。在眾多檢測方法中，最常用的方法為高效液相色譜法，但因?；撬岬淖贤馕蛰^弱，常采用衍生化方法提高檢測靈敏度，而衍生化反應操作較繁瑣，要求較高，影響因素較多。本研究旨在利用高效液相色譜-串聯質譜儀建立一種操作簡便、檢出限低、靈敏度高、定性及定量準確的牛磺酸含量檢測方法，以滿足豬肉和豬肉制品中?；撬岷康臏蚀_定性及定量。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
豬肉、豬肉圓火腿為市售。
牛磺酸標準物質（100 mg，純度≥99.6%） 中國標準物質中心;乙腈（質譜純）、乙酸銨（質譜純） 美國Fisher公司;亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、正己烷 天津市科密歐化學試劑有限公司。
1.2 儀器與設備
Xevo TQ MS高效液相色譜-串聯質譜儀、BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、BEH-HILIC色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 美國Waters公司;BSA224S電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;5200DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;VX-III多管平行振蕩器 北京Targin公司;JW-3021HR離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司;MS 3 basic渦旋振蕩器、高速分散機 德國IKA公司;0.22 μm微孔濾膜（有機相） 天津市津騰實驗設備有限公司。
1.3 方法
1.3.1 標準溶液的配制
?；撬針藴蕛湟海?.0 mg/mL）：準確稱取10 mg（精確至0.1 mg）?；撬針藴饰镔|于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。
?；撬針藴手虚g溶液（10 μg/mL）：準確吸取1.0 mg/mL?；撬針藴蕛湟? mL于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。
?；撬針藴使ぷ魅芤海簻蚀_吸取一定量的10 μg/mL牛磺酸標準中間溶液，用體積分數75%乙腈水溶液稀釋成質量濃度分別為1、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的標準工作溶液，現配現用。
1.3.2 高效液相色譜條件
BEH-HILIC色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱溫40 ℃，流動相A為超純水，流動相B為乙腈，流速0.40 mL/min，進樣量2 μL，流動相及梯度洗脫條件見表1。
1.3.3 質譜條件
電離模式：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）負離子模式（ESI-）;檢測模式：多反應監(jiān)測（multiple response monitoring，MRM）模式;毛細管電壓2.8 kV;離子源溫度150 ℃;干燥氣流量950 L/h;干燥氣溫度450 ℃;錐孔反吹氣流量40 L/h，MRM監(jiān)測條件如表2所示。
1.3.4 樣品處理
1.3.4.1 樣品提取
準確稱取經絞肉機攪碎處理均勻的樣品2 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入20 mL約40 ℃的溫水[13]，采用高速分散機處理約0.5 min，使其完全分散，渦旋振蕩提取10 min，將離心管中的樣品轉移至100 mL容量瓶中，用約50 mL 40 ℃左右的溫水分2～3 次洗滌離心管，洗滌液合并轉入100 mL容量瓶中，超聲提取10 min，待樣液冷卻至室溫后用水定容至100 mL，移取10 mL定容液于另一50 mL離心管中，加入10 mL水飽和正己烷，渦旋振蕩混合5 min，于4 ℃、7 000 r/min離心5 min。
1.3.4.2 樣品凈化
準確吸取1 mL離心后下層清液于15 mL離心管中，加入3 mL乙腈用以沉淀蛋白質，渦旋振蕩混勻1 min，7 000 r/min離心5 min，吸取1 mL上清液過0.22 μm有機濾膜，濾液供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。
1.4 數據處理
采用與高效液相色譜-串聯質譜儀配套使用的數據采集和處理一體化軟件MassLynx V4.1（美國Waters公司）進行實驗數據的采集和實驗結果的自動處理，經軟件自動處理得到試樣溶液中?；撬岬馁|量濃度，按式（1）計算試樣中?；撬岷?。
（1）
式中：X為試樣中牛磺酸含量/（mg/100 g）;ρ為從標準工作曲線得到的試樣溶液中?；撬岬馁|量濃度/（ng/mL）;
V為樣液最終定容體積/mL;m為試樣質量/g。
2 結果與分析
2.1 質譜條件優(yōu)化
采用10 μg/mL?；撬針藴嗜芤和ㄟ^蠕動泵注射至離子源，分別在ESI+模式和ESI-模式下進行全掃描，結果表明，牛磺酸在ESI-模式下的響應值明顯高于ESI+模式，且因牛磺酸含有磺基結構，在ESI-模式下，較易失去H形成較為穩(wěn)定的[M—H]-分子離子，因此選擇ESI-模式。確定離子模式后，分別選擇全掃描和子離子掃描模式，獲得?；撬岬哪鸽x子掃描圖譜（圖1）和特征碎片離子掃描圖譜（圖2），選擇離子豐度最強的碎片離子對為定量離子對，離子豐度相對較強的離子對為定性離子對，同時對其毛細管電壓、碎裂電壓和碰撞能量等條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的質譜條件如1.3.2節(jié)所示。
2.2 高效液相色譜條件優(yōu)化
采用優(yōu)化后的質譜條件（1.3.2節(jié)），對比BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）與BEH-HILIC色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）對10 ng/mL?；撬針藴嗜芤旱姆蛛x效果。
當使用BEH-C18柱進行分離時，牛磺酸的保留效果不好，出峰過快（約0.3 min），且峰型嚴重不對稱，這可能是?；撬針O性較強所致，更換不同流動相，添加甲酸銨、乙酸銨等峰型改善劑，同時調整不同流動相的洗脫梯度，?；撬崛詿o法得到較好保留和相對較優(yōu)的峰型。
當使用BEH-HILIC柱進行分離時，因HILIC柱裝填了中性的酰胺鍵合基團，提高了其對強極性、水溶性堿性有機物的保留能力，其對脂肪類物質基本不保留，從而可有效去除基質效應的影響，當采用乙腈、超純水作為流動相時，其對?；撬嵊休^好的保留，且色譜峰峰型對稱、美觀，靈敏度高。
采用優(yōu)化后的高效液相色譜條件（1.3.1節(jié)）和質譜條件（1.3.2節(jié)）測定10 ng/mL和1 ng/mL?；撬針藴嗜芤?，色譜圖分別如圖3和圖4所示。
2.3 樣品前處理條件優(yōu)化
豬肉及豬肉制品中含有大量的蛋白質和脂肪，若不去除，會給?；撬岬臋z測造成一定的基質干擾。去除蛋白質的主要方法有固相萃取法[30-31]和蛋白沉淀法[32-34]，固相萃取法成本較高，凈化步驟較為繁瑣，而蛋白沉淀法操作簡便、快捷，因此本研究使用蛋白沉淀法對樣品進行凈化處理。去除肉及肉制品中脂肪一般采用正己烷除脂肪法，本研究采用此法得到了很好的除脂肪效果。
分別選用亞鐵氰化鉀、乙酸鋅混合溶液（92 g/L亞鐵氰化鉀、183 g/L乙酸鋅體積比1∶1混合）和乙腈作為沉淀劑。當采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅混合溶液作為沉淀劑時，利用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅反應生成的氰亞鐵酸鋅沉淀挾走或吸附干擾物質，與蛋白質共沉淀而達到凈化目的，凈化效果較好，基本可消除基質干擾，測定豬肉及豬肉制品中牛磺酸含量時，加標回收率可達80%以上，但本研究選用的色譜柱為BEH-HILIC柱，采用純水相作為上機定容液時，對色譜柱的填料有一定破壞作用，且因溶劑效應，導致色譜峰的對稱性變差，峰型變寬。而采用乙腈作為沉淀劑時，乙腈可降低水的介電常數，導致具有表面水層的生物大分子脫水聚集后沉淀析出，對蛋白質具有很好的沉淀效果，其凈化效果好，可消除基質干擾，測定豬肉及豬肉制品中?；撬岷繒r，加標回收率可達90%以上，且采用體積分數75%乙腈-水溶液作為上機定容液時，對BEH-HILIC色譜柱的填料無破壞作用，無溶劑效應，峰型窄而尖銳對稱。因此選擇乙腈作為蛋白沉淀劑。
2.4 線性方程和定量限
按優(yōu)化后的儀器條件及樣品前處理方法對牛磺酸標準工作溶液進行測定。以定量離子峰面積（y）對?；撬豳|量濃度（x，ng/mL）繪制標準曲線，其回歸方程為y=3 746.9x+354.2（R2=0.998 9）。以定量離子對3 倍信噪比為檢出限，得到該方法的儀器檢出限為0.3 ng/mL（實際3 倍信噪比為3.52），10 倍信噪比為定量限，得到該方法的儀器定量限為1 ng/mL（實際10 倍信噪比為11.59）。因受樣品基質影響，又未找到牛磺酸陰性豬肉和豬肉制品樣品，從而無法獲得在檢出限或接近檢出限的樣品數據，故采用校準方程的適用范圍評估方法檢出限[35]。本研究采用式（2）計算XLOD。
（2）
式中：S為?；撬彡栃曰|樣品重復測定12 次的校準標準誤差（儀器響應的標準偏差）/（ng/mL）;b為回歸方程的斜率。
通過實驗得到S=6 298.3 ng/mL，因此XLOD=5 ng/mL。
將XLOD=5 ng/mL代入公式（1），XLOD即為公式（1）中的ρ，計算得到對應的方法檢出限為0.1 mg/100 g，以3～10 倍檢出限作為方法定量限[35]，最終確定本方法的定量限為0.5 mg/100 g。
2.5 加標回收率和精密度
2.5.1 豬肉樣品的加標回收率和精密度
取經絞肉機攪碎處理均勻的同一豬肉樣品，按表3設計實驗。因未找到牛磺酸陰性豬肉樣品，為減小樣品中較高的?；撬岷繉訕嘶厥章实挠绊?，故未選擇定量限做加標回收實驗，而選擇與樣品中?；撬岷肯喈數募訕肆亢蜏p半的加標量進行加標實驗（下同）。本研究所用豬肉樣品為同一豬肉樣品，表3中測得的加標回收率結果均為扣除豬肉樣品中?；撬岷克媒Y果。
由表3可知，豬肉樣品中?；撬岷繛?2.3 mg/100 g，其加標回收率為92.78%～104.96%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.39%～3.77%。
2.5.2 豬肉制品樣品的加標回收率和精密度
取經絞肉機攪碎處理均勻的同一豬肉圓火腿樣品，按表4設計實驗，測得的加標回收率結果均為扣除豬肉圓火腿樣品中牛磺酸含量所得結果。
由表4可知，豬肉制品（豬肉圓火腿）中?；撬岷繛?9.8 mg/100 g，其加標回收率為93.10%～104.70%，RSD為1.70%～3.80%。
3 討 論
對比了ESI+和ESI-模式下牛磺酸的響應值，結合?；撬岬慕Y構特點，選擇在ESI-模式下進行質譜方法的優(yōu)化，通過全掃描和子離子掃描，確定了牛磺酸的母離子和子離子，同時優(yōu)化了毛細管電壓、干燥氣流量、碰撞能等質譜參數;通過對比BEH-C18和BEH-HILIC色譜柱對牛磺酸的保留和分離效果，選擇對牛磺酸保留效果好、色譜峰峰型對稱、靈敏度高且基質效應低的BEH-HILIC色譜柱，同時優(yōu)化了流動相及洗脫梯度，達到了很好的保留和分離效果。
Mario[22]、Massimo[23]、Chen Zhi[25]、潘軍[26]等采用質譜法對能量飲料和藥片中?；撬岷窟M行檢測，但能量飲料和藥片相對于豬肉及豬肉制品，沒有蛋白質、脂肪等大分子雜質的干擾，處理過程相對較簡便，甚至可以直接測定，而豬肉及豬肉制品中的蛋白質、脂肪等會對?；撬岬臋z測造成一定的基質干擾，需采取合適的方法去除。因牛磺酸可溶于水，不溶于乙醚、正己烷等有機溶劑，結合GB 5009.169—2016《食品安全國家標準 食品中?；撬岬臏y定》[13]中前處理方法，選擇用水進行提取，正己烷除脂肪，同時對比了亞鐵氰化鉀、乙酸鋅混合溶液和乙腈的除蛋白效果，結合加標回收率、基質效應和BEH-HILIC色譜柱的特性，最終選擇采用乙腈作為蛋白沉淀劑，達到了很好的除雜效果。
采用優(yōu)化后的方法對豬肉和豬肉制品中的牛磺酸含量進行檢測，在質量濃度1～1 000 ng/mL范圍內，?；撬岬幕貧w方程線性良好，在陽性樣品中添加水平為20～50 mg/100 g時，?；撬岬募訕嘶厥章蕿?2.78%～104.96%，RSD為1.39%～3.80%，方法檢出限為0.1 mg/100 g，定量限為0.5 mg/100 g，與林琳等[24]建立的方法比較，本研究的方法檢出限和定量限均更低，能滿足豬肉和豬肉制品中?；撬岬目焖俣ㄐ院投繖z測。
本研究使用高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬肉及豬肉制品中牛磺酸的含量，對準確檢測各類動物源性食品中牛磺酸的含量、指導營養(yǎng)的均衡攝入具有重要意義。但本研究只針對?；撬? 種目標物進行了檢測，與對多種目標物同時檢測相比，其提取和分離過程均相對簡單，為提高方法的實用性和應用價值，需在本方法的基礎上，參考Mario[22]、Chen Zhi[25]等建立的方法，繼續(xù)加強不同基質中牛磺酸與其他多種營養(yǎng)素同時檢測的方法研究。
4 結 論
本研究優(yōu)化了牛磺酸測定的高效液相色譜條件、質譜條件和樣品提取及凈化步驟，建立了豬肉和豬肉制品中?；撬岷康母咝б合嗌V-串聯質譜快速檢測方法，具有靈敏度高、檢出限低、雜峰干擾小、回收率高、定性定量準確、檢測快速等特點，適用于豬肉和豬肉制品中?；撬岷康臏蚀_定性定量，對準確檢測各類動物源性食品中?；撬岬暮俊⒅笇I養(yǎng)的均衡攝入具有重要意義。
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