lncRNA ANRIL和VEGF在原因不明復發(fā)性流產絨毛中表達

楊煒婷 溫 芯 胡洪梅 黃 勇

四川省涼山州第一人民醫(yī)院( 615000)

原因不明復發(fā)性流產(URSA)是婦產科常見妊娠并發(fā)癥[1-2]。發(fā)生涉及到多種因素機制尚不明確。有研究表明，絨毛血管增生、滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲對妊娠建立和維持非常重要，其異?？赡軐е铝鳟a發(fā)生[3]。血管內皮生長因子(VEGF)在妊娠早期胎盤絨毛組織的血管形成、發(fā)育過程中起重要作用[4-5]。細胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA(ANRIL)屬長鏈非編碼RNA(LncRNA)，與腫瘤細胞增殖、遷移過程密切相關[6]。妊娠滋養(yǎng)細胞的生物學行為與腫瘤細胞相似，但lncRNA ANRIL、VEGF在URSA中的關系研究較少。本研究通過檢測lncRNA ANRIL、VEGF在URSA患者絨毛中表達，探討在URSA發(fā)病中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月-2019年6月在本院就診的URSA患者62例(觀察組)，同期要求行人工流產術正常早孕者62例(對照組)。納入標準：①單胎妊娠。②觀察組有腹痛、陰道流血等先兆流產癥狀，經B超檢測證實無胚胎心臟跳動；對照組無腹痛、陰道流血等先兆流產癥狀，B超檢查提示為正常宮內妊娠且胚胎發(fā)育正常。③妊娠≤12周，觀察組連續(xù)自然流產≥3次。排除標準：①有生殖系統(tǒng)異常、慢性高血壓、糖尿病、腎臟疾病、心血管疾病、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、妊娠并發(fā)癥。②有家族復發(fā)性流產病史、外科手術和醫(yī)療并發(fā)癥史。③有染色體、解剖、內分泌、感染、免疫方面原因。④服用過藥物或男方精液檢查不正常。⑤臨床資料保存不完整者。⑥服用藥物。本研究經本院倫理委員會審核并批準。所有研究對象及家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

TRIzol試劑購自北京百奧萊博科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自北京華大蛋白質研發(fā)中心有限公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自北京拜爾迪生物技術有限公司。qRT-PCR儀(Prism 7500)購自美國應用生物系統(tǒng)公司；紫外分光光度計(UV-1800PC)購自上海美譜達儀器有限公司。lncRNA ANRIL、VEGF、GAPDH引物均由華大基因科技有限公司設計并合成。

1.3 絨毛組織采集與保存

觀察組行清宮手術、對照組行人工流產術時采集新鮮胎盤絨毛組織，用生理鹽水反復沖洗，分成兩份，置液氮中速凍，-80℃保存。

1.4 lncRNA ANRIL、VEGF mRNA檢測

使用TRIzol試劑提取絨毛組織總RNA，紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量、完整性，合格后使用逆轉錄試劑盒將總RNA樣品逆轉錄成cDNA，檢驗cDNA質量，合格后采用qRT-PCR法檢測lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平。內參基因為GAPDH基因。10 μl反應體系：Green Mix 5 μl，50 ng/μl cDNA 1 μl，10 μM上下游引物各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反應條件：95℃ 90 s；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 15 s，40個循環(huán)終止。lncRNA ANRIL上游引物：5'-TACCATACAACAGACCAGAA-3'，下游引物：5'-TTGTTTTTCCAACATCCAT-3'；VEGF上游引物：5'-TGGATCCATGAACTTTCTGCTGTC-3'，下游引物：5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACA-3'；GAPDH上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'。lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平以2-ΔΔCt法表示，Ct值為擴增產物量達到臨界閾值時對應的循環(huán)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、體質指數(shù)、孕周、孕囊大小、先前流產次數(shù)比較無差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平

絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平觀察組均低于對照組(P<0.05)。見圖1、表2。

2.3 觀察組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL與VEGF mRNA表達相關性

相關性分析顯示，觀察組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL與VEGF mRNA表達水平呈顯著正相關(r=0.484，P<0.05)。見圖2。

表2 兩組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平比較

圖1 兩組絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達電泳圖

圖2 URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL與VEGF mRNA表達相關性

2.4 影響URSA發(fā)生的多因素分析

將URSA發(fā)生作為因變量，以URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL和VEGF mRNA表達水平為自變量進行多因素logistic回歸分析。結果顯示，絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平均為影響URSA發(fā)生的保護因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響URSA發(fā)生的多因素分析

3 討論

URSA易導致早期流產發(fā)生，再發(fā)生風險隨流產次數(shù)的增加而增加，長此以往可導致不孕不育[7]。既往研究表明，妊娠過程中胚胎著床、植入、發(fā)育需要達到母體、胚胎間的免疫平衡，故免疫治療成為了URSA的主要研究方向，但臨床治療中仍有30%～40% URSA患者無效。有研究表明，URSA的發(fā)生機制與絨毛中血管形成障礙、胚胎缺血缺氧有關[8]。妊娠早期絨毛中血管形成是胚胎成功種植及正常發(fā)育的重要前提，有助于滋養(yǎng)細胞侵入子宮內膜，并在妊娠全過程中保障胚胎發(fā)育。當絨毛中血管形成障礙時，會引起絨毛外滋養(yǎng)細胞侵襲障礙及胚胎植入發(fā)育異常，最終導致流產發(fā)生[9]。

Ferretti等[10]研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移、侵襲特性與腫瘤細胞極其相似。lncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達，通過影響細胞周期、改變腫瘤相關基因的表達及干擾miRNA功能等途徑，參與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲等生物學過程[11]；秦妮娜等[6]研究表明，使用丙泊酚抑制lncRNA ANRIL表達可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖與遷移；吳浩等[11]研究表明，抑制肝癌細胞中l(wèi)ncRNA ANRIL表達可顯著降低肝癌細胞的增殖能力；賀小云等[12]研究表明，lncRNA在胚胎形成、妊娠建立、激素調節(jié)、早期胚胎發(fā)育等階段均發(fā)揮重要作用，但研究多集中在動物繁殖方向。崔進等[13]研究表明，lncRNA在復發(fā)性流產和正常妊娠人工流產者間存在差異。本研究結果顯示，URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL表達水平較正常妊娠者低，提示絨毛組織lncRNA ANRIL參與URSA發(fā)病過程，可能與滋養(yǎng)層細胞的增殖、侵襲過程有關。

VEGF可促進絨毛新生血管形成及滋養(yǎng)細胞增殖、遷移[14]。其表達水平下降會導致血管內皮細胞增殖發(fā)生障礙，血管通透性下降，絨毛、蛻膜血管生成產生缺陷，最終導致胚胎停止發(fā)育并流產[15-16]。尹太郎等[3]研究表明，mRNA通過靶向調控VEGF表達，調控絨毛血管發(fā)育，參與復發(fā)性流產發(fā)病過程。吳成平等[7]研究亦表明，復發(fā)性流產患者胎盤絨毛組織中VEGF表達異常下調可能是引起復發(fā)性流產發(fā)生的重要原因。高玉霞等[17]研究表明，URSA患者絨毛組織中VEGF mRNA表達水平較人工流產者低，且隨著URSA患者流產次數(shù)的升高而降低。本研究結果顯示，URSA患者絨毛組織中VEGF mRNA表達水平較正常妊娠者低，提示絨毛組織VEGF低表達可能是導致URSA發(fā)生的一個重要因素。

陳日紅等[18]研究表明，LncRNA ANRIL可能通過調控VEGF表達參與增生型糖尿病視網膜病變過程。Zhang等[19]研究表明，在大鼠模型中，lncRNA ANRIL過表達后通過上調VEGF表達，促進糖尿病合并腦梗死大鼠血管生成。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL與VEGF mRNA表達水平呈正相關，提示lncRNA ANRIL可能通過調控VEGF表達下調，導致URSA患者絨毛新生血管形成、滋養(yǎng)細胞侵襲過程發(fā)生障礙。多因素分析顯示，絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA水平均為影響URSA發(fā)生的保護因素，提示lncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平異常下降可能是導致URSA發(fā)病的重要因素。

綜上所述，URSA患者絨毛組織中l(wèi)ncRNA ANRIL、VEGF mRNA表達水平異常下調，可能二者共同作用影響URSA發(fā)生，但其具體作用機制還待進一步研究。