孕婦外周血NKT細(xì)胞水平與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)病及病情關(guān)系

徐紅娟 卞曉云 陳曉熹 王宏星 徐愛(ài)萍 黃 琳 邵雪峰

南通大學(xué)附屬婦幼保健院(226000)

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)是妊娠中晚期孕婦特有并發(fā)癥，發(fā)病率0.1%～15.6%[1]。臨床以總膽汁酸(TBA)升高為特征，易導(dǎo)致患者凝血功能異常，出現(xiàn)產(chǎn)后出血，也可引起胎兒窘迫、胎糞污染、早產(chǎn)、新生兒顱內(nèi)出血等，導(dǎo)致圍產(chǎn)兒病死率增加[2]。ICP發(fā)生為雌孕激素、免疫因素、家庭遺傳因素等共同作用結(jié)果，近年關(guān)于免疫機(jī)制受到關(guān)注，主要與妊娠期間機(jī)體可涉及抗原、效應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與的獨(dú)特型免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)有關(guān)[3]。目前公認(rèn)的免疫細(xì)胞群體主要包括輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)，大量研究已證實(shí)Th1/Th2平衡發(fā)生偏移與ICP發(fā)生相關(guān)[4-5]。但Th1/Th2預(yù)測(cè)ICP仍存在敏感性低、特異性不高等問(wèn)題。自然殺傷T(NKT)細(xì)胞活化后可分泌大量Th1型細(xì)胞因子。關(guān)于NKT細(xì)胞與乙丙型病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌發(fā)生多有文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]。在正常及病理性妊娠中也扮演著重要角色[9]。ICP為妊娠期特殊類(lèi)型的肝損害，與NKT細(xì)胞相關(guān)性鮮有報(bào)道。本研究主要觀察ICP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中NKT細(xì)胞比例，初步探討NKT細(xì)胞與ICP發(fā)生的關(guān)系，為ICP發(fā)病機(jī)制及改善妊娠結(jié)局提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論并批準(zhǔn)后，選擇2016年3月1日-2018年3月1日本院確診的ICP患者(ICP患者組)，同期孕周相當(dāng)?shù)慕】诞a(chǎn)前檢查孕婦(健康孕婦組)，所有受試者均對(duì)本研究知情并自愿入組。入選標(biāo)準(zhǔn)：①參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)確診為ICP[10]；②未服用影響肝功能藥物及保健品；③未服用治療肝功能異常及膽汁酸分泌及代謝藥物；④愿意遵循本研究要求進(jìn)行相應(yīng)病史了解及相關(guān)診療工作實(shí)施；⑤研究記錄完整；⑥單胎妊娠且生殖道、胎兒均無(wú)畸形者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①合并病毒性、肝吸蟲(chóng)性、藥物性肝炎及自身免疫性慢性活動(dòng)性肝?。虎谄つw疾病引起的皮膚瘙癢；③膽胰疾病引起的總膽汁酸升高；④合并ICP以外或?qū)Σ涣既焉锝Y(jié)局有影響的內(nèi)外科疾??；⑤精神??；⑥研究過(guò)程中發(fā)生嚴(yán)重合并癥需行其他治療或生命體征極其不穩(wěn)定。

1.2 研究方法

收集所有ICP患者基線(xiàn)資料，包括年齡、飲食習(xí)慣、家族史、產(chǎn)次、確診本病時(shí)間、治療用藥情況；OLYMPUS全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能、甘膽酸；參照ICP分度標(biāo)準(zhǔn)[10]，根據(jù)患者基線(xiàn)資料和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)將ICP患者分為輕度ICP組和重度ICP組，分別檢測(cè)外周血PBMC中NKT細(xì)胞比例，分析NKT細(xì)胞含量與ICP發(fā)生發(fā)展相關(guān)性。

1.3 NKT細(xì)胞含量測(cè)定

取孕婦空腹靜脈血抗凝，2 h內(nèi)采用葡萄糖-泛影葡胺密梯度離心法分離血中PBMC進(jìn)行培養(yǎng)； 2只試管分別標(biāo)記為測(cè)定管和對(duì)照管，測(cè)定管中分別加入FITC-CD3抗體、PE-Cy7-CD16+CD56抗體各20 μl和全血50 μl混勻，對(duì)照管中分別加入IgG1-FITC/IgG1-PE 20μL和全血50 μl混勻，4℃避光孵育0.5 h，PBS漂洗；采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀檢測(cè)，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行，DFLEX軟件系統(tǒng)上獲取以FSC和SSC為坐標(biāo)的散點(diǎn)圖，選定以CD3+CD16+CD56+的細(xì)胞為NKT細(xì)胞，每毫升NKT細(xì)胞百分率為所得值乘以血球計(jì)數(shù)儀測(cè)得的外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)值。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)

取上述培養(yǎng)好的PBMC細(xì)胞懸液，純化后放入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，空白為200 μl PBMC懸液，正常為180 μl PBMC懸液+20 μl 正常血清，ICP為180 μl PBMC懸液+20 μl ICP患者血清，PHA為100 μl PBMC懸液+100 μl 植物血凝素(PHA)(北京索萊寶科技有限公司)，置入37℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)52 h；按照上述流式細(xì)胞儀檢測(cè)方式檢測(cè)血中PBMC在不同刺激物作用下NKT細(xì)胞含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

ICP患者組52例，年齡(26.4±2.8)歲(25～38歲)，孕周(29.6±3.1)周；健康孕婦組52例，年齡(26.5±2.8)歲(26～39歲)，孕周(29.8±3.1)周。兩組年齡及孕周無(wú)差異(P>0.05)。

2.2 外周血PBMC中NKT細(xì)胞含量

ICP患者組外周血PBMC中NKT細(xì)胞含量(44.78±3.62)%高于健康孕婦組(32.65±3.47)%(t=17.444，P<0.001)。

2.3 健康孕婦組外周血PBMC不同刺激物培養(yǎng)后NKT細(xì)胞含量

NKT細(xì)胞含量，不同刺激物正常與空白比較無(wú)差異(P>0.05)，PHA、ICP、正常依次降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 ICP患者組孕婦外周血PBMC在不同刺激物培養(yǎng)后NKT細(xì)胞含量

NKT細(xì)胞含量，不同刺激物正常與空白比較無(wú)差異(P>0.05)，PHA、ICP、正常依次降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 健康孕婦組外周血PBMC不同刺激物培養(yǎng)后NKT細(xì)胞含量

表2 ICP患者組外周血PBMC在不同刺激物培養(yǎng)后NKT細(xì)胞含量

2.5 不同病情ICP患者外周血PBMC中NKT細(xì)胞含量

ICP患者組中，輕度28例，重度24例。重度ICP孕婦外周血PBMC中NKT細(xì)胞含量(46.88±3.74)%，高于輕度ICP孕婦(43.96±3.68)%(t=2.831，P=0.007)。外周血PBMC中NKT細(xì)胞含量與ICP病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05，圖1)。

圖1 NKT細(xì)胞含量與ICP病情嚴(yán)重程度相關(guān)性

3 討論

正常妊娠過(guò)程中，母體自身免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)保持動(dòng)態(tài)平衡，有效制約母體對(duì)胎兒排斥反應(yīng)。而當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂，可導(dǎo)致病理性妊娠發(fā)生，其中ICP為危害產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒生命的重大因素[11]。妊娠期由于肝臟負(fù)荷加重及其他多種因素參與，可出現(xiàn)不同程度肝功能受損。目前認(rèn)為ICP發(fā)生機(jī)制主要為免疫功能受損，其中T細(xì)胞及其亞群是構(gòu)成機(jī)體免疫防御系統(tǒng)重要因素和主要免疫細(xì)胞群體[12]。本文考慮免疫功能相關(guān)指標(biāo)可成為預(yù)測(cè)ICP發(fā)生發(fā)展的敏感性標(biāo)志物，參考多篇文獻(xiàn)和國(guó)內(nèi)外報(bào)道，選擇研究ICP孕婦外周血PBMC中NKT細(xì)胞水平，因既往對(duì)NKT細(xì)胞比例與ICP關(guān)系未有明確報(bào)道。NKT細(xì)胞主要存在于外周血PBMC中，占0.001～3.00%[13]，肝臟和網(wǎng)膜中的分別為1%、10%，既往多用于構(gòu)建肝臟疾病預(yù)測(cè)模型。

相關(guān)研究顯示通常人類(lèi)NKT細(xì)胞被認(rèn)為來(lái)源于胸腺，分布于肝臟、外周淋巴器官和外周血中，被認(rèn)定為表型和功能與T、B細(xì)胞不同的第4類(lèi)淋巴細(xì)胞。小鼠模型試驗(yàn)顯示，NKT細(xì)胞可作用于幾乎所有免疫細(xì)胞，包括自然殺傷細(xì)胞(NK)、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、T細(xì)胞及B細(xì)胞等，影響整個(gè)免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，成為連接先天免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的橋梁[14]。Yu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ICP患者蛻膜中NKT細(xì)胞多于正常妊娠婦女，而NKT細(xì)胞可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子分泌增多，提示NKT細(xì)胞可能參與了ICP發(fā)生過(guò)程。本文結(jié)果顯示，ICP患者組NKT細(xì)胞比例增加。對(duì)正常孕婦組和ICP患者組孕婦外周血PBMC細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)胞培養(yǎng)，分別設(shè)置空白組、正常組、ICP組和PHA組，研究ICP患者血清對(duì)NKT細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，加入正常孕婦血清組NKT細(xì)胞含量與空白組無(wú)差異，加入ICP患者血清組NKT細(xì)胞含量多于正常組，加入PHA刺激后NKT細(xì)胞含量顯著多于空白組，提示NKT細(xì)胞具有增殖活性， NKT參與了ICP的發(fā)生。相關(guān)研究顯示NKT細(xì)胞參與肝臟炎癥、纖維化、肝癌一系列變化，且隨著肝臟疾病病情加重細(xì)胞比例增加?？紤]主要與其兼具NK細(xì)胞和T細(xì)胞雙重功效有關(guān)，作為特殊類(lèi)型的免疫細(xì)胞在機(jī)體免疫機(jī)制反映上有更高敏感性和特異性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，重度ICP孕婦NKT細(xì)胞比例高于輕度ICP，且NKT細(xì)胞水平ICP疾病有正相關(guān)性，提示隨著疾病進(jìn)展，NKT細(xì)胞水平上調(diào)。分析其作用機(jī)制：NKT細(xì)胞作用于Th1和Th2細(xì)胞，促進(jìn)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，影響母體正常肝臟功能，導(dǎo)致疾病發(fā)生； Wood等[16]認(rèn)為，NKT細(xì)胞可影響胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖，抑制蛻膜和羊膜生成，肝臟功能受損，且隨著滋養(yǎng)層細(xì)胞的減少肝臟損傷程度加重。

綜上所述，孕婦外周血NKT細(xì)胞比例與ICP發(fā)生及病情進(jìn)展密切相關(guān)，可為ICP發(fā)病機(jī)制及改善其妊娠結(jié)局提供新思路。但由于本研究樣本量少、時(shí)間短，對(duì)結(jié)果可能有一定影響。未來(lái)應(yīng)繼續(xù)設(shè)計(jì)更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拇髽颖倦S機(jī)對(duì)照研究以進(jìn)一步明確相關(guān)機(jī)制。