復發(fā)性流產患者外周血FOXP3 mRNA、RORγt mRNA表達及臨床診斷價值

高艷霞 鄭玉霞

遼寧省健康產業(yè)集團撫礦總醫(yī)院(撫順，113000)

目前認為復發(fā)性流產(RSA)發(fā)生與生殖器官異常、內分泌異常、遺傳因素及孕婦全身性疾病等有關[1]。自然妊娠屬特殊的同種異體移植，胚胎可產生免疫應答，提高母體免疫抑制功能細胞數量，維持機體免疫耐受[2]。既往研究表明[3-4]RORγt在RSA中發(fā)揮作用，不僅能激活機體免疫，亦可刺激內皮細胞、成纖維細胞直接機體炎癥反應。而FOXP3屬CD4+CD25+T細胞發(fā)育和功能維持的重要調節(jié)因子，特異性表達于CD4+CD25+T細胞[5]。但FOXP3mRNA、RORγt mRNA在RSA的診斷效能研究較少[6]。因此，本研究以RSA患者、健康早孕女性及健康體檢女性為對象，探討外周血中FOXP3mRNA、RORγt mRNA的表達特點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

納入標準：①RSA診斷符合相關標準[7]，所有夫婦染色體核型、婦科檢查、甲狀腺功能檢查等均未見異常；②完成外周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA檢查且可耐受；排除標準：①合并精神異常、血液系統疾病或自身免疫性疾??；②合并甲狀腺功能異常、黃體功能異常及惡性腫瘤；③合并認知功能障礙、器質性疾病疾病或凝血異常。選擇2018年1月-2019年12月本院就診的RSA患者為RSA組，產前檢查健康早孕女性為健康早孕組，健康體檢女性為健康體檢組。本研究經本院倫理委員會審批。研究對象知情同意。

1.2 檢查方法

RSA組入院后次日取外周血，健康早孕組和健康體檢組健康于體檢當天取外周血。

1.2.1 FOXP3mRNA、RORγtmRNA 取血清標本加入Trizol 500μl，充分混合后轉移到離心管1.0ml振蕩5min后靜置。加入氯仿200μl振蕩15s，靜置5min后離心15min。去上清液，加入預冷的75.0%乙醇1ml，常溫下7min干燥；紫外分光度儀A260測吸光度值。采用實時熒光PCR技術測定外周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA水平。設置PCR參數：30℃下10min；42℃下30 min；99℃下5 min；5℃下5 min，連續(xù)35個循環(huán)，72℃下10min延長，獲最終產物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳，β-actin為內對照，引物見表1[8-9]。

表1 引物設計

1.2.2細胞因子取血清標本，采用酶聯免疫吸附試驗測定各組白細胞介素-6、7(IL-6、7)、人胸腺活化調節(jié)趨化因子17(CCL17)、CC趨化因子受體4 (CCR4)水平[10]。

1.3 統計分析

2 結果

2.1 一般臨床資料

RSA組106例，年齡(28.6±3.5)歲(23～39)歲，自然流產(3.7±0.7)次(2～6)次，孕周(9.1±0.8)周(3～13)周；健康早孕組39例，年齡(28.6±3.5)歲(22～35)歲，孕周(9.1±0.8)周(3～12)周；健康體檢組42例，年齡(28.0±3.4)歲(23～35)歲。3組比較無差異(P>0.05)。

2.2 外周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA表達

RSA組FOXP3mRNA水平高于健康體檢組但低于健康早孕組，RORγtmRNA水平高于另外兩組；健康早孕組FOXP3mRNA水平高于健康體檢組，RORγtmRNA水平高于健康體檢組(均P<0.05)。見表2。

2.3 外周血中IL-6、7、CCL17、CCR4水平

RSA組IL-6、IL-7水平高于另外兩組，CCL17和CCR4水平低于健康早孕組但高于健康體檢組；健康早孕組IL-6、7、CCL17、CCR4水平高于健康體檢組(均P<0.05)。見表3。

表2 各組外周血中mRNA表達比較

表3 各組外周血檢測因子水平比較

2.4 FOXP3mRNA、RORγtmRNA診斷RSA效能

ROC曲線分析，FOXP3mRNA聯合RORγtmRNA診斷RSA的敏感性、特異性均高于各單一檢測(P<0.05)。見表4和圖1(211頁)。

表4 各檢測指標診斷RSA的效能

3 討論

目前臨床將RSA分為同種免疫性與自身免疫性兩種：自身免疫性RSA多與系統性紅斑狼瘡、抗磷脂綜合征等自身免疫疾病有關；同種免疫性RSA多與妊娠免疫耐受有關。因此，加強RSA患者早期診斷、治療對改善患者預后具有重要意義。

RSA的發(fā)生發(fā)展是一個多因素過程，多與人體免疫功能有關，尤其是T淋巴細胞。在正常人體中，外周血、脾臟組織CD4+T細胞中5%～10%的細胞高表達，臨床稱為CD4+CD25+T，在維持機體免疫穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，不僅能抑制自身免疫病的發(fā)生，亦可參與妊娠免疫調節(jié)[11]。本研究中，RSA組FOXP3mRNA水平高于健康體檢者但低于正常早孕婦女，RORγtmRNA水平高于另外兩組，說明FOXP3mRNA、RORγtmRNA在RSA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。Treg細胞是CD4+T淋巴細胞的亞群，能特異性表達FOXP3，能作為Treg特異標志物。既往研究表明Treg能抑制機體免疫細胞表達。妊娠者免疫耐受的形成、維持是一個多因素過程，而Th17能直接參與機體免疫炎性反應的調節(jié)。RORγt屬Th17細胞特異性轉錄因子，在分化成熟的Th17細胞中呈高表達，能控制Th17細胞分化。Treg細胞與Th17細胞相互作用、相互影響而抑制炎癥和促進炎癥，調節(jié)機體免疫平衡，維持免疫穩(wěn)態(tài)。對RSA患者能引起Treg細胞減少或Th17細胞增多，加強炎癥反應，發(fā)揮免疫負性調節(jié)作用，導致免疫穩(wěn)態(tài)失衡，加劇疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。本次研究顯示，RSA組IL-6、IL-7水平均高于另外兩組，CCL17及CCR4水平低于健康早孕組但高于健康體檢組。提示RSA患者外周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA呈高表達，有炎癥因子參與加速疾病的發(fā)生發(fā)展。ROC曲線分析結果表明，FOXP3mRNA聯合RORγtmRNA檢測診斷RSA的敏感性、特異性較高，可用于復發(fā)性流產的診斷。

綜上所述，外RSA患者周血中FOXP3mRNA、RORγtmRNA表達異常，可能與機體免疫紊亂有關，檢測這兩項指標能獲得較高的診斷RSA效能。