高效分解鉀長石細(xì)菌的分離篩選及解鉀工藝優(yōu)化①

薛永萍，肖春橋，張琰圖，池汝安

（1.武漢工程大學(xué) 興發(fā)礦業(yè)學(xué)院，湖北 武漢430073；2.武漢工程大學(xué) 郵電與信息工程學(xué)院，湖北 武漢430073；3.武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢430205；4.延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 延安716000）

鉀是促進(jìn)植物生長發(fā)育必不可少的3大元素之一，對植物生長起著至關(guān)重要的作用［1－2］，而我國土壤中的可溶性鉀資源嚴(yán)重匱乏，僅占世界總儲量的0.4%［3］。從鉀長石礦物中提取難溶性鉀，可采用物理法和化學(xué)法制備化肥［4］。但隨著大量化肥的使用，已出現(xiàn)土壤結(jié)構(gòu)被破壞、環(huán)境污染、食品安全等系列問題［5－6］。為此，利用成本低、方法簡單、條件溫和且無污染的微生物法提取鉀礦中的有效鉀制備微生物有機肥引起了眾多研究者的高度關(guān)注。本文擬以湖北省隨州市一鉀長石礦區(qū)土壤為研究對象，分離篩選具有高效解鉀作用的細(xì)菌，將存在于鉀長石中的緩效鉀和難效鉀轉(zhuǎn)化為速效鉀，既解決了我國土壤缺鉀的瓶頸問題，也可提高土壤有機質(zhì)，實現(xiàn)生態(tài)友好型農(nóng)業(yè)。

1 實 驗

1.1 實驗材料、試劑和培養(yǎng)基

1.1.1 實驗材料和試劑

實驗用土壤為湖北省隨州市某鉀長石礦區(qū)油菜、艾草、茼蒿等農(nóng)作物根系土壤。鉀長石系礦區(qū)提供，經(jīng)粉碎過篩，依次用去離子水、3 mol／L鹽酸浸泡24 h和72 h，以去除礦粉中的可溶性離子，再用去離子水清洗3～5次，至pH值呈中性，烘干保存?zhèn)溆茫?］。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，磷酸氫二鉀0.2 g，氯化鈉0.2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸亞鐵0.002 g，硫酸錳0.2 g，氯化鈣0.2 g，硫酸銨0.3 g，二次蒸餾水1 000 mL，pH＝7.0～8.0。

解鉀培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，鉀長石礦粉2 g，氯化鈉0.2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸亞鐵0.002 g，硫酸錳0.2 g，氯化鈣0.2 g，硫酸銨0.3 g，二次蒸餾水1 000 mL，pH＝7.0～8.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 解鉀菌的分離篩選

多次富集培養(yǎng)：稱取不同根系土壤各100 g，加入1 000 mL無菌水，充分?jǐn)嚢?，紗布過濾。準(zhǔn)確吸取5 mL土壤懸液置入裝有50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，放入搖床（160 r／min），28℃下第1次富集培養(yǎng)2 d；從第1次富集培養(yǎng)液中吸取5 mL發(fā)酵液，并將培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀用量減半，同等條件下再次發(fā)酵培養(yǎng)2 d，即為第2次富集培養(yǎng)。按相同方法，進(jìn)行多次富集培養(yǎng)，直至溶液澄清。值得一提的是，在此過程中將磷酸氫二鉀用量依次減少，其目的是提高微生物在解鉀培養(yǎng)基上的適應(yīng)能力。

菌種分離純化：用移液槍吸取200μL經(jīng)多次富集后的澄清菌液，涂布至固體解鉀培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)及解鉀能力，并多次進(jìn)行菌落的分離純化。將不同形態(tài)的單菌落斜面培養(yǎng)，4℃保藏［8］。

1.2.2 優(yōu)勢解鉀菌株形態(tài)及基因測序鑒定

利用常規(guī)方法對篩選得到的解鉀菌株進(jìn)行形態(tài)和生理生化特性分析，并由上海美吉生物有限公司對其進(jìn)行基因測序，經(jīng)與NT數(shù)據(jù)庫比對，鑒定其種屬。

1.2.3 解鉀菌解鉀能力測定

配制解鉀培養(yǎng)基，量取60 mL解鉀培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中，按實驗要求分別加入適量的鉀長石礦粉，121℃滅菌20 min［9］。將待測菌懸浮液以一定比例接種量接入搖瓶，在不同培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、時間和初始培養(yǎng)基pH值等條件下發(fā)酵培養(yǎng)。每組平行3次，且以不接種為對照組。取發(fā)酵上清液于9 000 r／min高速離心30 min，經(jīng)0.45μm微孔過濾后用原子吸收法測定溶液中有效鉀離子含量。

1.2.4 優(yōu)勢菌解鉀工藝優(yōu)化

采用單因素法，分別探討了培養(yǎng)時間、溫度及轉(zhuǎn)速、鉀長石粉濃度及粒度、培養(yǎng)基初始pH值、接種量、硫酸銨濃度等因素對解鉀菌生長和解鉀能力的影響。

2 實驗結(jié)果及討論

2.1 解鉀菌的分離篩選及鑒定

從礦區(qū)土樣中篩選得到了6株具有解鉀功能的細(xì)菌，其中命名為JX-5的菌株解鉀能力較強。該菌平板菌落形態(tài)和經(jīng)革蘭氏染色制片所得鏡下照片如圖1所示。

圖1 JX?5菌平板菌落形態(tài)及革蘭氏染色圖

由圖1可知，JX-5菌株為一白色桿狀細(xì)菌，表面隆起扁平，干澀且不透明。該菌株在100倍油鏡下觀察為短桿菌，革蘭氏呈陰性。通過基因測序鑒定為巨大芽胞桿菌，與KY660610.1菌株同源性高達(dá)99.00%。

2.2 JX?5菌解鉀能力

解鉀菌JX-5分解鉀長石礦物的能力可通過該菌體對礦物表面的溶蝕效應(yīng)來表征。在不同培養(yǎng)時間下，經(jīng)JX-5菌溶蝕礦物表面的掃描電鏡圖見圖2。

圖2 不同培養(yǎng)時間下經(jīng)JX?5菌溶蝕礦物表面掃描電鏡圖

由圖2可知，未經(jīng)菌體溶蝕的鉀長石礦物表面棱角清晰，隨著培養(yǎng)時間增加，礦粉表面棱角逐漸消失。培養(yǎng)4 d，礦粉表面棱角明顯減少且覆蓋少許菌體；培養(yǎng)8 d，礦粉表面菌體量增加、棱角模糊；培養(yǎng)12 d，礦物顆粒表面棱角幾乎消失，且出現(xiàn)坑洞現(xiàn)象。這一結(jié)果表明微生物破壞了礦物結(jié)構(gòu)，其中難溶性鉀得以釋放。

2.3 JX?5菌解鉀工藝優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)時間的影響

固定培養(yǎng)溫度28℃、轉(zhuǎn)速170 r／min，培養(yǎng)基pH值7.0～8.0，鉀長石濃度2 g／L、粒度0.03～0.04 mm，接種量25%，硫酸銨濃度0.2～0.3 g／L，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)，考察培養(yǎng)時間對解鉀菌解鉀能力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 培養(yǎng)時間對解鉀菌解鉀能力的影響

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間增加，發(fā)酵液pH值先極速下降后趨于平緩，降至3.86，由此可推測微生物代謝過程產(chǎn)生了有機酸，在其作用下破壞了礦物結(jié)構(gòu)。酸性越強，則礦物結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重，釋放的鉀離子越多。而圖3結(jié)果亦表明隨著培養(yǎng)時間增加，溶液中可溶性鉀離子含量先快速增加后趨于不變，這一結(jié)果與pH值變化相一致。當(dāng)培養(yǎng)時間超過12 d，鉀離子濃度變化很小，可達(dá)45.87 mg／L，通過計算鉀浸出率為18.63%。分析其原因，有機酸的分泌量隨著碳源減少而減少，從而降低了細(xì)菌的解鉀能力［10］。

2.3.2 培養(yǎng)溫度的影響

培養(yǎng)時間12 d，其他條件不變，培養(yǎng)溫度對解鉀菌解鉀能力的影響如圖4所示。

圖4 培養(yǎng)溫度對解鉀菌解鉀能力的影響

由圖4可得，隨著培養(yǎng)溫度升高，溶液中可溶性鉀離子含量先增加后減少，最適宜培養(yǎng)溫度為28℃，此時溶液中可溶性鉀離子含量為46.16 mg／L，浸出率高達(dá)18.75%。究其原因，溫度過高或過低均不利于微生物的生長和繁殖，使其分泌有機酸的量減少，從而降低了菌體分解礦物的能力［11］。

2.3.3 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的影響

培養(yǎng)溫度28℃，其他條件不變，以靜止培養(yǎng)為比對，探討培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對解鉀菌解鉀能力的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對解鉀菌解鉀能力的影響

通過比對圖5中靜止和震蕩培養(yǎng)下溶液中鉀含量可知，震蕩轉(zhuǎn)速對微生物分解礦物影響很大，隨著培養(yǎng)轉(zhuǎn)速增加，溶液中可溶性鉀離子含量先增加后下降。當(dāng)轉(zhuǎn)速為170 r／min，溶液中鉀離子濃度最大，可達(dá)45.89 mg／L，此時浸出率為18.64%。而靜止培養(yǎng)時，溶液中可溶性鉀濃度僅為15.28 mg／L，鉀浸出率為6.21%。究其原因，轉(zhuǎn)速較高會產(chǎn)生較大的剪切力，一方面降低了微生物數(shù)量，另一方面也不利于微生物與礦粉接觸，使其解鉀能力下降。而轉(zhuǎn)速過低，則沒有足夠的氧容量維持細(xì)菌的生長和繁殖，其解鉀能力也下降［12］。

2.3.4 初始培養(yǎng)基pH值的影響

培養(yǎng)轉(zhuǎn)速170 r／min，其他條件不變，初始培養(yǎng)基pH值對解鉀菌解鉀能力的影響如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)基初始pH值對解鉀菌解鉀能力的影響

分析圖6，隨著初始培養(yǎng)基pH值增加，溶液中可溶性鉀離子含量先增加后下降。pH值為7.0～8.0時，溶液中鉀離子濃度較大，為44.69～43.59 mg／L，浸出率可達(dá)18.15%～17.70%。過高或過低的pH值都不利于微生物的生長和繁殖［13］，故選擇初始培養(yǎng)基pH＝7.0～8.0。

2.3.5 鉀長石礦粉濃度的影響

初始培養(yǎng)基pH＝7.0～8.0，其他條件不變，礦粉濃度對解鉀菌解鉀能力的影響見圖7。

圖7 礦粉濃度對解鉀菌解鉀能力的影響

由圖7可知，隨著礦粉濃度增加，鉀浸出率先緩慢增加后快速下降。當(dāng)?shù)V粉濃度為2 g／L時，浸出率可達(dá)18.98%。這可能是因為隨著礦粉濃度增加，沒有足夠多的微生物來溶解鉀長石以釋放其中的有效鉀。

2.3.6 鉀長石礦粉粒度的影響

礦粉濃度2 g／L，其他條件不變，礦粉粒度對解鉀菌解鉀能力的影響如圖8所示。

圖8 礦粉粒度對解鉀菌解鉀能力的影響

由圖8可得，隨著礦粉粒度增大，鉀離子含量先增加后下降，當(dāng)粒徑為0.03～0.04 mm時，鉀離子含量可達(dá)45.79～46.02 mg／L，浸出率為18.60%～18.69%。礦粉粒徑越小，礦物與培養(yǎng)液中菌體接觸則越頻繁，更有利于微生物破壞礦物結(jié)構(gòu)，以釋放更多的鉀離子。但當(dāng)?shù)V物粒徑小于0.03 mm時，礦物顆粒間易發(fā)生團聚現(xiàn)象，減小了礦粉與溶液中菌體的接觸面，導(dǎo)致鉀離子難以釋放。

2.3.7 接種量的影響

鉀長石粒徑0.03～0.04 mm，其他條件不變，接種量對解鉀菌解鉀能力的影響見圖9。

圖9 接種量對解鉀菌解鉀能力的影響

由圖9可知，當(dāng)菌液接種量小于20%時，溶液中可溶性鉀離子含量隨接種量增加而快速增加。當(dāng)接種量超過20%后，鉀離子含量變化不明顯，故較佳接種量為25%（體積分?jǐn)?shù)），此時鉀離子含量可達(dá)46.32 mg／L，浸出率為18.81%。菌液濃度過低，沒有足夠量的微生物分解鉀長石以破壞其晶體結(jié)構(gòu)。但并不是接種量越多越好，一方面過多的微生物需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)，大量微生物會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分供應(yīng)不足而死亡；同時隨著接種量增加，需氧量也增加，有限的培養(yǎng)環(huán)境下難以補充更多的氧容量，也將導(dǎo)致微生物菌體衰亡，進(jìn)而降低了微生物溶解鉀礦的能力。

2.3.8 硫酸銨濃度的影響

接種量25%，其他條件不變，硫酸銨濃度對解鉀菌解鉀能力的影響如圖10所示。

圖10 硫酸銨濃度對解鉀菌解鉀能力的影響

由圖10可知，隨著硫酸銨濃度增加，溶液中可溶性鉀離子含量先增加后減少，當(dāng)硫酸銨濃度為0.2～0.3 g／L時，鉀離子濃度可達(dá)44.98～46.18 mg／L，鉀浸出率為18.27%～18.76%。不加硫酸銨時，鉀離子含量僅為12.36 mg／L，浸出率為5.02%，究其原因，無機氮的加入，不僅能促進(jìn)細(xì)菌生長，也有利于細(xì)菌產(chǎn)生更多的有機酸［14］。但當(dāng)硫酸銨濃度過高時，則與培養(yǎng)基中的鈣、鎂等離子形成沉淀，降低了微生物賴以生長和繁殖的微量元素，使其解鉀能力下降。

2.3.9 優(yōu)化條件實驗

根據(jù)單因素實驗，得到菌株JX-5分解鉀礦的最佳工藝條件為：培養(yǎng)溫度28℃、時間12 d、轉(zhuǎn)速170 r／min，培養(yǎng)基pH＝7.0～8.0，鉀長石濃度2 g／L、粒度0.03～0.04 mm，接種量25%，硫酸銨濃度0.2～0.3 g／L。在此最佳工藝條件下驗證菌株分解鉀礦的能力，鉀浸出率最高可達(dá)20.79%。由此可見，在最優(yōu)化工藝條件下JX-5菌株分解礦物能力較強，這一結(jié)果為后續(xù)研究微生物分解礦物的熱力學(xué)、動力學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

1）經(jīng)鑒定，菌株JX-5為巨大芽胞桿菌，革蘭氏呈陰性。

2）供試菌株JX-5能有效分解鉀礦，JX-5菌株溶解鉀礦的最佳工藝條件為：培養(yǎng)溫度28℃、時間12 d、轉(zhuǎn)速170 r／min，培養(yǎng)基pH值7.0～8.0，鉀長石濃度2 g／L、粒度0.03～0.04 mm，接種量25%，硫酸銨濃度0.2～0.3 g／L。在此條件下，鉀浸出率可達(dá)20.79%。

致謝：

本工作得到國家自然科學(xué)基金（51674178）和國家重點研發(fā)計劃（2018YFC1801800）的支持，也得到了武漢工程大學(xué)測試與分析中心、武漢理工大學(xué)和中國地質(zhì)大學(xué)分析測試中心提供的檢測分析，特此致謝！