微生物菌種篩選技術(shù)方法研究進(jìn)展①

榮 楠，李 備，唐昊冶，林先貴，馮有智*

(1中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008；2中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所，長(zhǎng)春 130033；3長(zhǎng)春長(zhǎng)光辰英生物科學(xué)儀器有限公司，長(zhǎng)春 130033)

完整地認(rèn)識(shí)地球微生物群落在生物圈和人類健康中的作用，是解決21世紀(jì)人類社會(huì)從能源、傳染病到農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域所面臨許多難題的關(guān)鍵[1-3]。2015年，《Nature》呼吁啟動(dòng)“國(guó)際微生物組計(jì)劃”，幫助人類全面認(rèn)識(shí)地球環(huán)境中微生物群落的數(shù)量與功能，為解決上述問題提供了關(guān)鍵資源[3]。但隨著研究的深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到基因組水平、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)層面的研究只能獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)性結(jié)果，缺乏因果性結(jié)論，其最核心問題在于缺乏菌種的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。因此菌種篩選被日益推到了學(xué)科的前沿，獲取目標(biāo)微生物后進(jìn)行因果性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)有助于科學(xué)家得到最直觀準(zhǔn)確的結(jié)論，進(jìn)而推動(dòng)相關(guān)科學(xué)發(fā)展及其在實(shí)際應(yīng)用方面的進(jìn)步。

實(shí)際上，科研工作者一直致力于篩選菌種。1996年，Rainey和Bailey[4]從英國(guó)牛津大學(xué)農(nóng)場(chǎng)種植的甜菜葉子表面分離出的假單胞菌SBW25除了用于研究微生物–植物–土壤相互作用外，已成為研究進(jìn)化過程的重要模式生物。2006年，Chen等[5]從臺(tái)中市一處未經(jīng)種植地區(qū)的土壤中篩選出了36株溶磷細(xì)菌，并獲得其分泌的3種新型有機(jī)酸，為用于田間的磷酸溶解劑提供了更多選擇。2015年，Yadav等[6]從印度喜馬拉雅山西北部寒冷沙漠采集的不同樣本中篩選出了232種細(xì)菌，豐富了人類對(duì)寒冷高海拔棲息地菌種組成的認(rèn)識(shí)。同年，Daims等[7]從俄羅斯一口石油探井管壁上生長(zhǎng)的微生物膜中培養(yǎng)分離出能一步完全硝化的微生物菌株，打破了科學(xué)家125年來認(rèn)為銨根硝化需要兩類微生物協(xié)作的認(rèn)知。除了推動(dòng)科學(xué)發(fā)展外，菌種篩選也解決了很多重大實(shí)際問題。2015年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者之一——日本科學(xué)家大村智于1974年從土壤中分離到一株鏈霉菌，通過與美國(guó)Merck公司合作，發(fā)現(xiàn)該鏈霉菌生產(chǎn)的二氫衍生物 Ivermectin可制成藥物用于徹底防治盤尾絲蟲癥(河盲癥)和淋巴絲蟲病(象皮病)[8-9]。1989年，Robertson等[10]報(bào)道了好氧反硝化細(xì)菌和好氧反硝化酶的存在，為生物脫氮技術(shù)提供了一種嶄新的思路。2002年，Dean-Ross等[11]從大卡盧梅特河的沉積物中分離出兩種能使多環(huán)芳烴降解的細(xì)菌(分枝桿菌和紅霉菌)，推動(dòng)了生物修復(fù)工業(yè)污染物用地的進(jìn)展。2009年，Hong等[12]從中國(guó)的8個(gè)紅樹林中篩選出與抗癌和抗感染相關(guān)的金黃色葡萄球菌等，為新藥物的研發(fā)提供了可能性。2018年，Mitra等[13]從印度某鋼鐵廠附近水稻田的土壤中篩選到了有重金屬抗性的S2菌株，為后續(xù)研究重金屬污染農(nóng)業(yè)土壤的生物修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。以上成果極大地推動(dòng)了醫(yī)學(xué)、工業(yè)和環(huán)境工程等領(lǐng)域的進(jìn)步，同時(shí)也表明了純菌株的分離具有極為重要的意義，應(yīng)在未來的微生物研究中得到重視。

綜上所述，獲取純菌株的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)是微生物學(xué)和微生物研究相關(guān)學(xué)科的核心內(nèi)容。地球上棲息著多樣性豐富的生物資源，而人類對(duì)這些資源的認(rèn)知和開發(fā)僅是冰山一角，定向發(fā)掘微生物功能對(duì)人類社會(huì)發(fā)展具有不可估量的意義[14]?；耍疚臄M對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)外主流的微生物菌種篩選技術(shù)方法進(jìn)行介紹，并闡明各自的優(yōu)缺點(diǎn)，以及針對(duì)該領(lǐng)域未來發(fā)展方向提出些粗淺的看法，拋磚引玉。

1 傳統(tǒng)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

傳統(tǒng)微生物篩選方法的主要思路為先培養(yǎng)后篩選，即先選擇合適的培養(yǎng)條件(例如培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境等)篩分環(huán)境樣品中的目標(biāo)微生物，再?gòu)闹刑暨x[15-16]。傳統(tǒng)篩選方法能夠獲得純菌株，了解目標(biāo)微生物的種水平、基因組和性狀，并使用純菌株進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。雖然該方法經(jīng)過多年的發(fā)展與完善已形成較為成熟的體系，但仍存在兩個(gè)無法避免的問題。

首先，當(dāng)目標(biāo)微生物的豐度很低或生長(zhǎng)十分緩慢時(shí)極易被忽略。許多微生物，尤其是寡營(yíng)養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)十分緩慢，需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間。只有抑制或降低群落中生長(zhǎng)較快菌株的生長(zhǎng)和豐度，才有可能篩選出此類細(xì)菌。例如，2005年Davis等[17]將土壤細(xì)菌置于黑暗條件下的聚乙烯袋中密封培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，發(fā)現(xiàn)菌群數(shù)量持續(xù)不斷增加，且之前難以分離出的菌株獲取率也隨著時(shí)間的推移而增加。2009年Song等[18]通過在黑暗低溫條件下長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，成功從西太平洋海水樣品中分離出滯后期較長(zhǎng)的SAR11菌株。2005年Tamaki等[19]提出細(xì)菌的生長(zhǎng)也可能受到混合培養(yǎng)中其他細(xì)菌釋放的細(xì)菌素或培養(yǎng)基內(nèi)抗菌物質(zhì)的抑制。

其次，培養(yǎng)基的養(yǎng)分條件和菌株的原生環(huán)境差異大，導(dǎo)致目標(biāo)微生物無法存活。例如，傳統(tǒng)篩選方法使用的培養(yǎng)基大多富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這類培養(yǎng)基利于生長(zhǎng)較快的細(xì)菌，但適應(yīng)貧乏營(yíng)養(yǎng)環(huán)境及生長(zhǎng)緩慢的菌種可能受到抑制[19]。2002年Connon和Giovannoni[20]發(fā)現(xiàn)使用稀釋營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基能成功培育出以前不可培養(yǎng)的水生和陸生細(xì)菌。但上述解決方法仍費(fèi)時(shí)費(fèi)力，有待進(jìn)一步改進(jìn)。2005年Kopke等[21]調(diào)查了不同基質(zhì)和培養(yǎng)條件對(duì)潮汐沉積物中細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)不同的培養(yǎng)方法會(huì)分離出其特有的細(xì)菌，證實(shí)了培養(yǎng)條件對(duì)菌種的影響。2007年Kim[22]發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌的生長(zhǎng)依賴于某些信號(hào)分子，而信號(hào)分子只存在于自然棲息地中。當(dāng)此類細(xì)菌面對(duì)缺少信號(hào)分子這一生存要素的培養(yǎng)基時(shí)，可能會(huì)選擇一種暫時(shí)進(jìn)入低代謝活動(dòng)狀態(tài)的生存策略，從而無法在培養(yǎng)介質(zhì)上增殖并形成菌落[22-23]。由于上述情況，傳統(tǒng)的平板篩分方法獲得的菌種數(shù)量和多樣性很低，無法滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境治理、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域的需求。

2 新技術(shù)方法及其應(yīng)用

新的微生物篩選技術(shù)方法的思路主要為先篩選后培養(yǎng)，可以有效規(guī)避傳統(tǒng)方法的劣勢(shì)。而該思路的實(shí)現(xiàn)主要?dú)w功于從復(fù)雜樣本中識(shí)別及分離單個(gè)微生物細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步、計(jì)算方法和成像技術(shù)的改進(jìn)，以及用于數(shù)據(jù)解析的生物信息學(xué)工具的革新。這些技術(shù)的發(fā)展極大提高了微生物學(xué)家篩分微生物的成功率，并減少了人力成本。下面將簡(jiǎn)單介紹幾種技術(shù)方法。

2.1 基于光學(xué)鑷子結(jié)合拉曼光譜的細(xì)胞分選技術(shù)

光學(xué)鑷子結(jié)合拉曼光譜(laser tweezers and Raman spectroscopy，LTRS)是一種新興的細(xì)胞篩分技術(shù)。其中，光學(xué)鑷子是建立在光輻射壓原理上，采用高度聚焦的激光束提供引力或斥力，從而以物理方式固定和移動(dòng)微觀中性物體的技術(shù)[24]；拉曼光譜則是1928年被印度物理學(xué)家Raman所發(fā)現(xiàn)[25]，它蘊(yùn)含著細(xì)胞在特定生理狀態(tài)下豐富的生化信息，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，可作為 “化學(xué)指紋”用于描述細(xì)胞的分子組成、生理狀態(tài)和生態(tài)功能[26]。二者相結(jié)合則可實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記檢測(cè)、區(qū)分及分選單細(xì)胞[27-28]。

2007年黃超等[29]提出將LTRS技術(shù)與微流控芯片結(jié)合檢測(cè)紅細(xì)胞的拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合后檢測(cè)更為準(zhǔn)確、快速。2009年，Huang等[27]應(yīng)用LTRS識(shí)別毛細(xì)血管中的細(xì)胞，再通過毛細(xì)血管將其分選，為L(zhǎng)TRS技術(shù)用于細(xì)胞分選提供了可能性。2015年，Berry等[28]利用重水(D2O)的穩(wěn)定同位素(D)探測(cè)來快速識(shí)別小鼠盲腸菌群的活性微生物，明確了樣本中兩種主要微生物的活動(dòng)模式并發(fā)現(xiàn)了不明細(xì)菌。該研究證明拉曼–FISH預(yù)篩選的應(yīng)用，可在一定程度上解決因目標(biāo)細(xì)胞尺寸小和易損性而導(dǎo)致的手動(dòng)LTRS分選過程慢等問題，進(jìn)而使LTRS技術(shù)能用于篩分復(fù)雜樣品的菌種。2016年Casabella等[30]為了提高細(xì)胞分選率，將LTRS技術(shù)與微流體芯片結(jié)合，該應(yīng)用使單個(gè)細(xì)胞能自動(dòng)被捕獲并通過拉曼檢測(cè)分析，大大節(jié)省了人工成本。

LTRS技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用方面仍存在兩個(gè)問題。首先，高通量LTRS技術(shù)的實(shí)現(xiàn)依賴于結(jié)合微流體技術(shù)，而該技術(shù)需將樣品細(xì)胞懸浮于溶液中進(jìn)行操作。但許多樣本中細(xì)胞分布在生物膜、沉積物、土壤及人/動(dòng)物糞便中，上述復(fù)雜樣品中的大顆粒物質(zhì)或碎屑易堵塞微流體設(shè)備中的噴嘴和通道，使得操作十分困難[31]；其次，另一個(gè)待解決的問題是激光對(duì)細(xì)胞的損傷，特別是一些反應(yīng)中心對(duì)光損傷敏感的光養(yǎng)生物。光損傷效應(yīng)取決于波長(zhǎng)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)經(jīng)735、785、835 nm的輻射會(huì)不可逆地抑制微藻Trachydiscussp.的光化學(xué)活性；而功率為25 mW的885、935和1 064 nm的激光則無不利影響[32]。此外，激光對(duì)非光養(yǎng)細(xì)胞也有不利影響，例如能量為0.36 J的1 064 nm激光鑷子會(huì)影響大腸桿菌的細(xì)胞分裂，能量為0.54 J時(shí)會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)[33]。上述兩個(gè)問題該如何解決將成為L(zhǎng)TRS技術(shù)能否廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

2.2 熒光活化細(xì)胞分選法

熒光活化細(xì)胞分選法(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)是一項(xiàng)新型的、發(fā)展迅速的細(xì)胞分析技術(shù)。其原理是采用激光束激發(fā)懸浮在液流中的單行細(xì)胞或生物顆粒，探測(cè)其熒光及散射光，從而完成對(duì)細(xì)胞物理和生化特性的高度定量分析與分選[34-35]。流式細(xì)胞儀(flow cytometer, FCM)就是以FACS為核心的儀器。它因具有測(cè)量指標(biāo)多、檢測(cè)速度快、分選純度高等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域的科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用中。它在新興的生物技術(shù)(如系統(tǒng)生物學(xué)，稀有細(xì)胞檢測(cè)或干細(xì)胞分離)方面也有巨大的潛力[36]。

1979年，Parks等[37]就已證明只要有熒光信號(hào)，即使特異性標(biāo)記抗原結(jié)合細(xì)胞在樣品中含量極少，也可用FACS將其分選出。1988年，Webster等[38]提出FACS的獨(dú)特能力可使細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)間最小化的同時(shí)產(chǎn)量最大化，從而使得科學(xué)家可分析研究在體外壽命極其有限的成肌細(xì)胞。2009年，蔡海英等[39]證明FACS可應(yīng)用于體外培養(yǎng)的兔角膜緣上皮細(xì)胞的SP細(xì)胞分離，且分離出的細(xì)胞具有較強(qiáng)的增生能力。2015年，Lawson等[40]利用高敏感度FACS分析并分選到小鼠的原發(fā)性腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性細(xì)胞，推進(jìn)了對(duì)轉(zhuǎn)移性疾病的預(yù)防及治療策略的開發(fā)。2018年，金鑫等[41]利用多參數(shù)FACS研究發(fā)現(xiàn)慢性粒單核細(xì)胞白血病(CMML)和反應(yīng)性增多的單核細(xì)胞的免疫學(xué)分型結(jié)果存在較多差異，綜合這些鑒別點(diǎn)可輔助區(qū)分二者，對(duì)CMML 的診斷具有重要意義。

FACS也存在不可避免的缺點(diǎn)。其一，它的臺(tái)式系統(tǒng)笨重且成本高昂，因此它們大多為各種生物研究或臨床實(shí)驗(yàn)室所共有，可用性與易用性較低；其二，傳統(tǒng)FCM通常為開放式系統(tǒng)，因此科學(xué)家處理傳染性樣本需極其謹(jǐn)慎，以防基于水滴的分析與分選機(jī)制會(huì)產(chǎn)生有害氣溶膠[42]；其三，確保樣品分選質(zhì)量的程序費(fèi)時(shí)費(fèi)力，如無RNase處理需要對(duì)FCM的整個(gè)管路和過濾器系統(tǒng)進(jìn)行滅菌及清潔[36]；其四，F(xiàn)ACS需要大量的樣品和試劑進(jìn)行分析，進(jìn)一步增加了總成本，使許多應(yīng)用變得困難或不可能[35]。綜上所述，盡管FACS有強(qiáng)大的功能，但仍有諸多因素限制其在各種研究和應(yīng)用中的利用。因此，克服問題并改進(jìn)儀器將成為FACS進(jìn)一步發(fā)展的要點(diǎn)。

2.3 基于激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移技術(shù)的細(xì)胞分選技術(shù)

分選單細(xì)胞需運(yùn)用激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移(laserinduced forward transfer, LIFT)技術(shù)，該技術(shù)基于激光與物質(zhì)的相互作用原理，可非接觸地從復(fù)雜生物樣本中將目標(biāo)單細(xì)胞彈射至接收器中，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、無損的單細(xì)胞分離(圖1)，且分選后的細(xì)胞可直接進(jìn)行全基因組擴(kuò)增或純培養(yǎng)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)[35,43]?；贚IFT技術(shù)的細(xì)胞篩分方法相比于傳統(tǒng)的細(xì)胞分離方法具有分選精準(zhǔn)、流程簡(jiǎn)易、適用廣泛等優(yōu)勢(shì)。此外，LIFT細(xì)胞分選技術(shù)與FACS的區(qū)別在于前者具有高分辨率的顯微成像系統(tǒng)，可利用目標(biāo)微生物的細(xì)胞形態(tài)、尺寸等自身特征無標(biāo)記地識(shí)別生物體與非生物顆粒，再進(jìn)行目標(biāo)單細(xì)胞的自動(dòng)或手動(dòng)分選?？偠灾?，LIFT細(xì)胞分選技術(shù)突破了傳統(tǒng)的微生物研究領(lǐng)域，開創(chuàng)了微生物單細(xì)胞基因組學(xué)研究的新方法，或?qū)⑼卣谷祟悓?duì)未培養(yǎng)微生物的認(rèn)知。

2013年，Wang等[44]運(yùn)用LIFT技術(shù)精準(zhǔn)快速地從復(fù)雜的口腔細(xì)菌樣本中分離出5種不同類型的細(xì)菌，驗(yàn)證了該方法的可行性。2017年，Song等[43]利用LIFT技術(shù)從復(fù)雜的海水樣品中分離產(chǎn)類胡蘿卜素的光合細(xì)菌，從而通過單細(xì)胞全基因組測(cè)序進(jìn)一步研究類胡蘿卜素合成途徑；同年他們還使用相同的方法從泰晤士河中分離出抗性微生物并測(cè)序分析，建立了表型與基因型的對(duì)應(yīng)關(guān)系[45]。

LIFT細(xì)胞分選技術(shù)雖然可實(shí)現(xiàn)從復(fù)雜的樣品中分離出目標(biāo)微生物，但如何準(zhǔn)確定位目標(biāo)微生物仍有待解決，于是有科學(xué)家提出了拉曼活化細(xì)胞分選(raman activated cell sorting，RACS)這一種無需標(biāo)記的細(xì)胞分選方法[31]。2012年St?ckel等[46]利用芽孢的特殊拉曼光譜從7種粉末與芽孢桿菌的混合樣品中準(zhǔn)確找到芽孢桿菌；2017年，Song等[43]利用類胡蘿卜素的特殊拉曼光譜從復(fù)雜的海水樣品中篩選光合細(xì)菌。2018年，Jing等[47]以13C底物培養(yǎng)海水樣品中的微生物，成功利用RACS方法從中分離出了原位固碳單細(xì)胞群，并測(cè)定其DNA序列，以重構(gòu)其基因組。

綜上所述，拉曼光譜結(jié)合單細(xì)胞分選技術(shù)可繞過純菌株培養(yǎng)階段，直接實(shí)現(xiàn)活體單細(xì)胞的分離，快速便捷且省時(shí)省力。但此種方法也存在相應(yīng)問題：首先，自發(fā)的拉曼散射較弱，約107個(gè)入射光子中僅有1個(gè)進(jìn)行拉曼散射[48]，因此實(shí)驗(yàn)需要較長(zhǎng)的時(shí)間(通常為幾秒鐘)來獲取細(xì)胞的拉曼光譜，從而限制了RACS高通量的實(shí)現(xiàn)；其次，經(jīng)LIFT分選技術(shù)彈射出的細(xì)胞活性會(huì)受一定程度影響，自身抗逆性差的微生物可能無法在分選后存活，從而使得后續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。因此，拉曼光譜結(jié)合單細(xì)胞分選技術(shù)想要發(fā)展成熟仍有很長(zhǎng)的路要走。

2.4 基于原位培養(yǎng)的細(xì)胞分離技術(shù)

經(jīng)過科學(xué)家?guī)资陙聿粩鄬?duì)可培養(yǎng)微生物的重復(fù)培養(yǎng)、篩選后，想從中分離出結(jié)構(gòu)獨(dú)特、活性顯著的新物種越來越困難。通過長(zhǎng)期研究，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到目前尚可培養(yǎng)的微生物僅占微生物總數(shù)的小部分[49]，而迄今為止無法在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的微生物包含著豐富的物種多樣性與巨大的可利用潛能。為了解決這一問題，科學(xué)家突破了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式，提出了原位培養(yǎng)技術(shù)。該技術(shù)的原理是通過合理模擬某種微生物生長(zhǎng)繁殖的自然條件，以自然環(huán)境作為培養(yǎng)基，即可在不了解其生長(zhǎng)所需全部元素組成的情況下對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。該方法作為對(duì)傳統(tǒng)菌種篩選方法的改良，也遵循先培養(yǎng)后篩選的主要思路。

2002年，Kaeberlein等[50]設(shè)計(jì)了擴(kuò)散室(diffusion chamber)用于原位培養(yǎng)海洋潮汐帶沉積物中的微生物，擴(kuò)散室中的微生物細(xì)胞可通過濾膜與潮汐帶沉積物進(jìn)行物質(zhì)信息交流(圖2)，研究發(fā)現(xiàn)該方法的微生物獲取率比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法高300倍，且培養(yǎng)出了無法在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中生存的MSC2。2008年，Gavrish等[51]以放線菌菌絲可以穿透0.22 μm孔徑的半透膜為基礎(chǔ)，發(fā)明了用于捕獲及原位培養(yǎng)絲狀放線菌的“陷阱”——trap裝置，實(shí)驗(yàn)證明該方法分離到的放線菌數(shù)量與多樣性較傳統(tǒng)方法都有很大提高，且能獲得一些稀有放線菌。2015年，姜明國(guó)等[52]利用原位培養(yǎng)方法從紅樹林根際土壤中分離出了包含疑似新屬放線菌在內(nèi)的多種微生物，研究表明該方法分離出的微生物較傳統(tǒng)方法擁有更高的多樣性與活性。2017年，Berdy等[53]研究出了高通量的微型擴(kuò)散室——隔離芯片(isolation chip，IChip)，該裝置也可使微生物回收率提高至300倍且已成為分離新型抗菌微生物的主要培養(yǎng)工具。

原位培養(yǎng)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于科學(xué)家無需猜測(cè)新物種的生長(zhǎng)需求，直接在滿足其生長(zhǎng)繁殖需求的自然條件中進(jìn)行培養(yǎng)，使用自然環(huán)境中的生長(zhǎng)因子作為生長(zhǎng)介質(zhì)[50,53]。與此同時(shí)，原位培養(yǎng)也存在一個(gè)問題，即依舊無法于復(fù)雜的自然環(huán)境中了解微生物生存所必需的物質(zhì)。Kaeberlein等[50]提出一種信號(hào)假說，即微生物可能需要鄰近微生物發(fā)出的特定信號(hào)，表明此為熟悉環(huán)境后再生長(zhǎng)繁殖，其隱含意義為即使提供適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)條件，微生物也無法在陌生的環(huán)境中生長(zhǎng)。這可在一定程度上解釋人工配制的傳統(tǒng)培養(yǎng)基為何無法培養(yǎng)出大多微生物。這個(gè)假說為今后的研究提供了一種可能的方向，而真實(shí)的原因還有待科學(xué)家不斷探究與突破，從而進(jìn)一步推動(dòng)基于原位培養(yǎng)的微生物分離技術(shù)的發(fā)展。

3 新技術(shù)發(fā)展展望

任何單一技術(shù)都不是完美的。從復(fù)雜環(huán)境中篩選目標(biāo)微生物，雖然傳統(tǒng)菌種篩選方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但現(xiàn)代主流基于單細(xì)胞分選的技術(shù)也存在難以完成精準(zhǔn)篩選，即靶標(biāo)性差等問題。因此，研究實(shí)踐中不能偏重或偏廢某個(gè)單一技術(shù)，更應(yīng)該結(jié)合多個(gè)技術(shù)，取長(zhǎng)補(bǔ)短。只有耦合多個(gè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，才能真正地推進(jìn)微生物菌種的篩選。在此，提出如下幾個(gè)初步想法：

1)傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代方法有機(jī)結(jié)合。使用傳統(tǒng)方法初篩富集后再利用現(xiàn)代方法精準(zhǔn)篩選，將二者相結(jié)合做到既快速又準(zhǔn)確。傳統(tǒng)方法在篩選菌種的過程中仍起到非常重要的作用，通過傳統(tǒng)方法可于復(fù)雜環(huán)境中富集目標(biāo)微生物或者弱化非目標(biāo)微生物，為現(xiàn)代方法的實(shí)施提供了便利性和成功率。反之，現(xiàn)代方法可以由人工智能提供自動(dòng)化的手段，大大降低了因人工操作導(dǎo)致的低效率和可能的錯(cuò)誤率。兩者結(jié)合將極大促進(jìn)菌種篩選的過程。

2)加強(qiáng)源頭創(chuàng)新。選擇有代表性的供試土壤有助于提高篩選目標(biāo)微生物成功率，利用大自然已經(jīng)長(zhǎng)期馴化富集群落的場(chǎng)地將會(huì)使得篩選過程事半功倍。

3)關(guān)注種間互作。物種間相生相克的機(jī)制也是篩選土壤微生物的困難之一，特別是營(yíng)養(yǎng)缺陷型物種。應(yīng)多關(guān)注微生物的種間互作，例如從海洋潮汐帶沉積物中分離出的純菌株MSC1和MSC2只能通過共培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)[50]。

4)應(yīng)用快速檢測(cè)。隨著今后菌種篩選通量的增大，需考慮結(jié)合快速檢測(cè)方法(例如酶活顯色反應(yīng)[54]、核酸測(cè)定[55]等)，以便精準(zhǔn)快速地從復(fù)雜環(huán)境中鎖定目標(biāo)菌種，特別是具有高活性和特定功能的菌種，進(jìn)而為下游分析提供良好的材料。

5)統(tǒng)籌下游分析。在篩得大量菌種后，還需思考如何更好地耦合下游分析，例如如何將細(xì)胞分選技術(shù)與單細(xì)胞測(cè)序、宏基因分析和宏轉(zhuǎn)錄組分析等結(jié)合起來。

6)利用分選技術(shù)人工構(gòu)建微生物群落，以更好地揭示微生物群落對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響。

總之，只有多角度、多方位、多技術(shù)地整合才能精準(zhǔn)、高通量、快速地從大自然中獲得菌種。只有充分獲得微生物資源，才能夠更好地推動(dòng)土壤微生物學(xué)，以及相關(guān)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展，才能真正地利用大自然賦予的瑰寶——微生物，反哺于人類、社會(huì)和環(huán)境的可持續(xù)性發(fā)展。