Nisin Z復配劑對常見食源性致病菌的協(xié)同抑菌作用

李津津，匡 珍，徐春霞，遲 海*，陶樂仁

（1 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所 上海200090 2 福建省閩東水產(chǎn)研究所 福建寧德352100 3 上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院 上海200093）

食品致病菌的污染和繁殖是食品安全的主要問題之一[1-2]。傳統(tǒng)的食品抑菌方式主要通過超高壓殺菌、輻射殺菌、熱殺菌和添加其它生物抑菌劑等。然而，超高壓殺菌、輻射殺菌、熱殺菌等殺菌方式會對食品品質(zhì)造成一定影響[3]。同時，生物抑菌劑和食品添加劑的過量添加與潛在殘留也使消費者對食品安全產(chǎn)生擔憂[4]。因此，急需尋求新型抑菌物質(zhì)代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法來確保食品安全。

乳酸菌細菌素是乳酸菌核糖體合成產(chǎn)生的一類對同種或親緣關系較近的乳酸菌有抑制作用的抗菌肽[5]。它具有易酶解，無殘留，抑菌高效等優(yōu)點，成為近年來食品生物抑菌劑研發(fā)的熱點。目前，乳酸鏈球菌素（Nisin）是唯一被FDA/WHO 認證并作為天然食品添加劑應用到食品貯藏和保鮮行業(yè)中的乳酸菌細菌素[6]。Nisin 在食品工業(yè)中的廣泛應用主要是因其抑菌作用。相關研究顯示，Nisin 主要是通過識別革蘭氏陽性菌細胞膜上的脂膜II（Lipid II），從而傳導其抑菌作用[7-8]。然而，由于革蘭氏陰性菌與陽性菌細胞壁結構的差別，使得Nisin 對革蘭氏陰性菌的抑制作用不明顯。目前發(fā)現(xiàn)的Nisin 變體分為Nisin A/F/Q/Z/U/U2 等6種，其中應用到食品中的主要為Nisin A 和Nisin Z。Nisin A 和Nisin Z 的主要區(qū)別在于第27 位上的氨基酸不同，其中Nisin A 第27 位氨基酸序列為組氨酸，Nisin Z 為天冬氨酸[9]，它們理化和抑菌性質(zhì)基本上相似，都具有廣泛的應用價值。

本研究基于前期對Nisin Z 的提取和優(yōu)化結果（試驗結果另刊發(fā)表），針對食源性致病菌殘存和Nisin 對革蘭氏陰性菌抑制作用不明顯的問題，選取從貽貝中篩選的乳酸乳球菌K6 所產(chǎn)Nisin Z和其它抑菌物質(zhì)為研究對象，探討對常見食源致病菌的抑菌作用，如蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌 （Escherichia coli）、腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus），旨在達到可以使用最低的濃度抑制食源性致病菌生長的目的。同時，Nisin Z 與某些抑菌物質(zhì)（食品添加劑）聯(lián)用于食品中，可延長食品貨架期。本試驗中結果有望為食品生物抑菌劑的聯(lián)合抑菌作用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

產(chǎn)Nisin Z 的乳酸乳球菌 （Lactococcus lacits K6）和其它常見的食源性致病菌，如蠟樣芽胞桿菌（B.cereus DH2805）、單增李斯特菌（L.monocytogenes DH2813）、金黃色葡萄球菌 （S.aureus DH3022）、大腸桿菌（E.coli DH3704）、腸道沙門氏菌 （Sal.enterica DH8004）、副溶血性弧菌（V.parahemolyticus DH8005）由中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所保存。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

腦心浸出液培養(yǎng)基 （Brain heart infusion broth，BHI 培養(yǎng)基）、M17 乳酸培養(yǎng)基，青島海博；胰蛋白胨、酵母膏，英國OXOID 公司；瓊脂粉，上海藍季科技發(fā)展有限公司；葡萄糖、EDTA 二鈉、雙乙酸鈉、山梨酸鉀、檸檬酸鈉、硫酸銨、殼聚糖，國藥（上海）化學試劑有限公司；茶多酚，浙江一諾生物科技有限公司；多粘菌素B、乳酸鈉溶液，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器與設備

Nano drop2000c 分光光度計，美國thermo 公司；TG16-WS 離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；酶標儀Power Wave XS，美國伯騰儀器有限公司；MIR-153 低溫恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋（SANYO）電機公司；超凈工作臺SEX-TJ，上海整新電子設備；YXQ-LS-50 SII 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；恒溫振蕩器CHA-S，國華電器有限公司；低溫離心機CF 16RXII，日立（Hitachi）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 Nisin Z 粗提物的制備 將乳酸乳球菌K6接種在1 L 的GM17 （M17 乳酸培養(yǎng)基肉湯中加0.5%的葡萄糖）中，置于30 ℃條件下過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)后的菌液在10 000 r/min 條件下離心30 min。將離心后的上清液加入飽和濃度為45%（體積分數(shù)）的硫酸銨，振蕩混勻后，置于4 ℃條件下靜置不少于4 h。將靜置后的混合液在10 000 r/min 條件下離心30 min，將離心后的沉淀加入20 mL 的無菌水溶解，并置于沸水浴條件下加熱15 min，后冷卻至室溫，即得Nisin Z 的粗提物。

1.4.2 最小抑菌活性的測定 由乳酸乳球菌K6產(chǎn)的Nisin Z 和幾種抑菌物質(zhì)的單一最低抑菌濃度參考Wiegand 等[10]方法，利用96 孔板微量稀釋法測定最小抑菌濃度。對照組的OD600nm值為0.4～0.5 時，開始記錄，確定Nisin Z 及幾種抑菌物質(zhì)的單一抑菌濃度（Minimum inhibition concentration,MIC50）。Nisin Z 的抑菌濃度以細菌素單位BU（Bacteriocin union）表示。BU 定義為Nisin Z 粗提物在一定時間內(nèi)（對照組OD600nm達到0.4～0.5 時）抑制200 μL 蠟樣芽胞桿菌的最低用量。其它食品添加劑（茶多酚、檸檬酸鈉等）的最大添加量遵照國標限定進行添加（表1）。

1.4.3 Nisin Z 復配劑聯(lián)合最低抑菌濃度的測定根據(jù)1.4.2 節(jié)中Nisin Z 與幾種抑菌物質(zhì)的單一最低抑菌濃度，按照Semis 等[11]的方法，利用96 孔板微量稀釋法測定Nisin Z 與幾種抑菌物質(zhì)兩兩聯(lián)用時的抑菌效果（表2）。當對照組的OD600nm值為0.4～0.5 時，用酶標儀測定波長600 nm 下的OD值，確定Nisin Z 與幾種抑菌物質(zhì)兩兩聯(lián)用的最低抑菌濃度。

表1 本試驗中添加劑的最大添加劑量Table 1 Maximum additive amount of common additives

表2 Nisin Z 與抑菌物質(zhì)的添加劑量Table 2 Maximum addition of nisin Z and inhibitory substance

1.4.4 協(xié)同效應的判定 根據(jù)1.4.3 節(jié)中獲得的Nisin Z 與幾種抑菌物質(zhì)兩兩聯(lián)用的最低抑菌濃度，參照Chi 等[4]的方法，來判定是否有協(xié)同抑菌效應。部分抑制濃度 （Fractional inhibition concentration，F(xiàn)IC）按式（1）計算。

式中，F(xiàn)IC——Nisin Z 與各種抑菌物質(zhì)聯(lián)用時的部分抑菌濃度指數(shù)；FICa——Nisin Z 與各種抑菌物質(zhì)聯(lián)用時，Nisin Z 的部分抑菌濃度指數(shù)；FICb——抑菌物質(zhì)與Nisin Z 聯(lián)用時，抑菌物質(zhì)的部分抑菌濃度指數(shù)；MICa聯(lián)用、MICb聯(lián)用——Nisin Z與抑菌物質(zhì)聯(lián)用時的最低抑制濃度；MICa單獨、MICb單獨——Nisin Z 單獨抑制指示菌時的最低抑制濃度；其中Nisin Z 的單位為BU/mL，多粘菌素B 的質(zhì)量濃度用μg/mL 表示，其它抑菌物質(zhì)的單位為mg/mL。

Nisin Z 與其它抑菌物質(zhì)兩兩聯(lián)用時，協(xié)同效果的判定按照Neu 等[12]提出的方法，通過FIC 值的計算，判定Nisin Z 與一種抑菌物質(zhì)是否具有協(xié)同作用（0＜FIC＜0.5）、部分協(xié)同作用（0.5＜FIC＜1）、無協(xié)同作用（1＜FIC＜2）或拮抗作用（FIC＞2）。

1.4.5 時間-殺菌試驗 為進一步確定Nisin Z 與幾種抑菌物質(zhì)聯(lián)用在不同時間內(nèi)的協(xié)同抑菌效果。在4 只5 mL 的BHI 肉湯試管（編號為1，2，3，4）中，分別加入100 μL 過夜培養(yǎng)的指示菌，分別在2～3 號試管內(nèi)加入MIC50的Nisin Z 和一種抑菌物質(zhì)，4 號試管中加入最低抑菌濃度的抑菌物質(zhì)與Nisin Z 的復配劑，不添加任何抑菌物質(zhì)的1號試管作為空白對照組。將4 只試管放入恒溫培養(yǎng)箱中，于30 ℃條件下培養(yǎng)，在不同時間段（0，2，4，6，9，12 h）分別從4 只試管中取出100 μL 菌懸液，梯度稀釋后在相應的培養(yǎng)基上涂布，將涂布后的3 組平行樣本在30 ℃條件下過夜培養(yǎng)，采用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。最后以時間為橫坐標，細菌總數(shù)（Total viable count，TVC）的對數(shù)為縱坐標繪制時間-殺菌曲線。根據(jù)Pournaras 等[13]的研究，當Nisin Z 與抑菌物質(zhì)混合時比單獨使用抑菌物質(zhì)/nisin Z 的抑菌效果更優(yōu)，總活菌數(shù)的減少量≥2-lg 時，則說明Nisin Z 與該抑菌物質(zhì)有協(xié)同抑菌作用。

2 結果與分析

2.1 最小抑制濃度

本試驗分別測定了9 種抑菌物質(zhì)與乳酸乳球菌K6 產(chǎn)生的細菌素Nisin Z 對6 種食源性致病菌的單一最低抑制濃度。結果表明，Nisin Z 對革蘭氏陽性菌的最低抑菌濃度為5 BU/mL （蠟樣芽胞桿菌）和10 BU/mL（金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌），對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和副溶血性弧菌）沒有明顯的抑菌效果（表3）。溶菌酶對檢測的食源性致病菌的抑制效果不明顯。相關研究顯示，溶菌酶對革蘭氏陽性菌的抑制作用優(yōu)于革蘭氏陰性菌[14]，然而溶菌酶抑菌能力依靠濃度作用，這也可能是本試驗中未發(fā)現(xiàn)明顯抑制作用的原因。本試驗中殼聚糖只對副溶血性弧菌有抑制作用（抑菌質(zhì)量濃度為1.9 mg/mL），茶多酚只對金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌有抑菌作用，多粘菌素B 只對革蘭氏陰性菌有抑菌作用，且抑菌濃度均較低（0.4～0.9 μg/mL），其它4 種食品添加劑對檢測的食源性致病菌均有抑制作用。為拓寬Nisin Z 的抑菌譜，使其不僅能抑制革蘭氏陽性菌，還能較好地抑制革蘭氏陰性菌，因此選擇其它幾種抑菌物質(zhì)與Nisin Z 進行聯(lián)用。

2.2 Nisin Z 與抑菌物質(zhì)聯(lián)用的抑菌結果

利用棋盤法探討Nisin Z 和幾種抑菌物質(zhì)聯(lián)合使用對6 種食源性致病菌的抑制效果 （表4）。試驗結果表明Nisin Z 與EDTA 二鈉聯(lián)用，對試驗中被測的所有食源性致病菌都有協(xié)同抑菌作用，同時Nisin Z 的添加量降為單獨抑制時的1/64倍，EDTA 的添加量為原來單獨使用時的1/25 倍。這可能是由于EDTA 二鈉作為螯合劑對細菌外壁的作用，使其結構松散，造成Nisin Z 可以專一性識別受體，從而傳導抑菌作用，這一結果也與目前的研究結果一致[15-16]。Nisin Z 與雙乙酸鈉聯(lián)用對副溶血性弧菌沒有明顯抑制效果，對其它革蘭氏陽性細菌（蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌）的FIC 值分別為0.22，0.43，0.32，這說明Nisin Z 與雙乙酸鈉聯(lián)用時，具有明顯的協(xié)同抑菌效果，同樣的協(xié)同效果也在大腸桿菌和腸道沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)（FIC 值分別為0.40，0.37）。Nisin Z與檸檬酸鈉聯(lián)用對革蘭氏陽性菌（蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌）有明顯的協(xié)同抑菌效果，F(xiàn)IC 值分別為0.23，0.31，0.41。然而，Nisin Z 與檸檬酸聯(lián)用對革蘭氏陰性菌沒有明顯協(xié)同抑菌效果。Nisin Z 與山梨酸鉀聯(lián)用，只對單增李斯特菌和大腸桿菌有協(xié)同抑菌作用。Nisin Z與多粘菌素B 聯(lián)用對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、腸道沙門氏菌、副溶血性弧菌） 分別有協(xié)同抑菌效果，對革蘭氏陽性菌（蠟樣芽胞桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌）沒有協(xié)同抑制作用。

表3 抑菌物質(zhì)與Nisin Z 單獨最低抑菌濃度Table 3 MICs of inhibitory substances and nisin Z work alone

表4 Nisin Z 與幾種抑菌物質(zhì)聯(lián)用的最低抑菌濃度和FIC 值Table 4 MIC combination and FICs of nisin Z and other antimicrobial substances

2.3 時間-殺菌試驗

圖1和圖2分別為Nisin Z 與雙乙酸鈉對蠟樣芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌的時間-殺菌曲線。結果顯示，Nisin Z 單獨抑制蠟樣芽胞桿菌2805的抑菌濃度為5 BU/mL 時，與對照組相比（只加了蠟樣芽胞桿菌2805） 活菌數(shù)在4～6 h，9 h 和12 h分別減少了2.2 左右個對數(shù)值、0.9 個對數(shù)值和2.7 個對數(shù)值；單獨使用25 mg/mL 雙乙酸鈉時，總活菌數(shù)在2 h 和4 h 分別減少了4.5 個對數(shù)值和4.62 個對數(shù)值；在6～12 h，雙乙酸鈉能完全抑制蠟樣芽胞桿菌的生長；Nisin Z（0.078 BU/mL）與雙乙酸鈉（0.016 mg/mL）聯(lián)用，分別在4 h 和6～12 h 總活菌數(shù)分別減少＜2-lg，結果表明Nisin Z 與雙乙酸鈉抑制蠟樣芽胞桿菌不具有協(xié)同抑菌作用。

由圖2可知，Nisin Z（10 BU/mL）單獨抑制金黃色葡萄球菌3022，在檢測時間內(nèi)細菌總數(shù)與空白組相比分別減少了1.14，1.14，0.57，0.41，1.68個對數(shù)值；雙乙酸鈉（5 mg/mL）單獨抑制金黃色葡萄球菌，在檢測時間內(nèi)細菌總數(shù)與空白組相比分別減少了1.14，1.65，1.83，2.34，2.40 個 對數(shù)值；Nisin Z（0.16 BU/mL）與雙乙酸鈉（15 mg/mL）聯(lián)合使用，細菌總數(shù)與空白組相比減少量小于2 個對數(shù)值，這說明Nisin Z 與雙乙酸鈉聯(lián)合抑制金黃色葡萄球菌時協(xié)同作用不太明顯，而單獨使用雙乙酸鈉時，抑菌效果優(yōu)于二者聯(lián)合使用的效果。

本試驗中Nisin Z 與雙乙酸鈉對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌出現(xiàn)的拮抗作用可能由于雙乙酸鈉呈堿性，Nisin Z 與雙乙酸鈉聯(lián)合時pH 值升高，降低了Nisin Z 的活性。江蕓等[16]已經(jīng)證實了在相同溫度下，pH 值越高，抑菌能力降低。此外，路遙[17]研究發(fā)現(xiàn)，Nisin Z 的活性受側鏈氨基酸極性的影響，雙乙酸鈉添加可能影響Nisin Z 側鏈氨基酸的極性，從而造成Nisin Z 的活性降低。同樣的研究結果也顯示，pH 值的變化會導致Nisin Z 的抑菌活性降低[18]。

圖3是Nisin Z 與山梨酸鉀對單增李斯特菌的時間-殺菌曲線。結果顯示Nisin Z（10 BU/mL）單獨抑制單增李斯特菌時，在作用時間內(nèi)總活菌數(shù)減少量均大于2 個對數(shù)值 （分別為4.06，3.99，4.09，6.69，6.75 個對數(shù)值），這說明Nisin Z 對蠟樣芽胞桿菌表現(xiàn)出顯著的抑菌效果；山梨酸鉀（5 mg/mL）單獨抑制單增李斯特菌的抑制效果不太明顯；Nisin Z（2.5 BU/mL）與山梨酸鉀（1 mg/mL）聯(lián)合抑制單增李斯特菌，作用4 h 和6 h 后，細菌總數(shù)降低小于2 個對數(shù)值，作用9～12 h 后，協(xié)同抑制效果不太明顯。

圖1 Nisin Z 與雙乙酸鈉對蠟樣芽胞桿菌的時間-殺菌曲線Fig.1 Time-killing curve of nisin Z and sodium diacetate against B.cereus

圖2 nisin Z 與雙乙酸鈉對金黃色葡萄球菌的時間-殺菌曲線Fig.2 Time-killing curve of nisin Z and sodium diacetate against S.aureus

圖3 Nisin Z 與山梨酸鉀對單增李斯特菌的時間-殺菌曲線Fig.3 Time-killing curve of nisin Z and potassium sorbate against L.monocytogenes

Nisin Z 與山梨酸鉀聯(lián)用對單增李斯特菌沒有明顯的協(xié)同抑菌效果。可能由于一些鈉鹽或者鉀鹽作用于單增李斯特菌時，會導致單增李斯特菌的不同應激反應，導致其細絲的形成，或者參與糖酵解活性基因的下調(diào)，使之存活下來[19]。Nisin Z與山梨酸鉀聯(lián)合作用沒有Nisin Z 單獨抑制效果好，可能由于聯(lián)合作用時，Nisin Z 的濃度較低導致。

由圖4可知，Nisin Z（80 BU/mL）單獨抑制大腸桿菌3704 未顯示明顯抑制效果；多粘菌素B（0.4 μg/mL）單獨抑制大腸桿菌2 h 后，細菌總數(shù)減少3.79 個對數(shù)值，4 h 后可以完全抑制大腸桿菌的生長；Nisin Z （1.25 BU/mL） 與多粘菌素B（0.1 μg/mL）聯(lián)合抑制金黃色葡萄球菌在2 h 內(nèi)能完全抑制，2～6 h 內(nèi)抑制效果慢慢減弱，6 h 后復合抑菌劑對大腸桿菌的抑制趨于平穩(wěn)，細菌總數(shù)減少4.5 左右個對數(shù)值。說明Nisin Z 與多粘菌素B聯(lián)合抑制大腸桿菌時，在3 h 內(nèi)是具有協(xié)同效應的，而后協(xié)同效應不太明顯，然而仍然能很好地抑制大腸桿菌。

由圖5可知，Nisin Z（160 BU/mL）單獨抑制腸道沙門氏菌的抑制效果不明顯；EDTA 二鈉（1 mg/mL）單獨抑制腸道沙門氏菌，在2～9 h 內(nèi)的抑制效果優(yōu)于 Nisin Z（1.25 BU/mL）與EDTA 二鈉（0.25 mg/mL）聯(lián)用的效果，9 h 后復合抑菌劑對腸道沙門氏菌的抑制作用要高于兩者單獨使用的抑制效果，到12 h 時復合抑菌劑組與對照組相比，細菌總數(shù)減少了2.3 個對數(shù)值。

Nisin 對革蘭氏陰性菌沒有明顯的抑制作用，主要是由于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁不同，位于外膜的脂多糖是革蘭氏陰性菌的主要表面分子。多粘菌素B 對革蘭氏陰性菌的抑菌作用主要是通過其與脂質(zhì)帶負電荷的磷酸基團相互作用進入細菌的外表面，從而使細胞膜電位失衡死亡[20]。而Nisin 穩(wěn)固了革蘭氏陰性菌外膜的通透性屏障[21]。本試驗中3 h 內(nèi)Nisin Z 與多粘菌素B 有協(xié)同作用，這與Chi 等[4]研究結果一致。這可能是因為多粘菌素B 破壞了大腸桿菌的外膜結構，增強了Nisin Z 對大腸桿菌的抑菌作用，后來Nisin Z 自身接觸大腸桿菌穩(wěn)固了其膜結構，使多粘菌素B 對其抑制作用減弱。也有可能是多粘菌素B 與Nisin Z 聯(lián)合作用時，多粘菌素B 的濃度較單獨抑制時較低，并不能完全抑制大腸桿菌的生長。此外，由Nisin Z 與EDTA 二鈉聯(lián)合抑制腸道沙門氏菌的殺菌曲線可以看出，兩者聯(lián)用有協(xié)同作用，這與楊曉韜等[22]的研究結果一致。也有類似研究發(fā)現(xiàn)Nisin Z 單獨抑制沙門氏菌時效果不明顯，這是由于革蘭氏陰性菌的膜結構不同，對防腐劑有一定的阻礙作用，所以對Nisin Z 不太敏感，而EDTA 二鈉是金屬螯合劑，可以改變陰性菌的外膜通透性，同時，Nisin Z 通過作用于細菌內(nèi)膜的脂質(zhì)II 分子，使細菌細胞質(zhì)內(nèi)小分子物質(zhì)流出，從而使其對革蘭氏陰性菌產(chǎn)生作用[23]。Nisin Z與部分抑菌物質(zhì)聯(lián)用降低了兩者的使用量，增強了對食源性致病菌的抑菌效果，拓寬了Nisin Z 的抑菌范圍，這將使Nisin 在食品行業(yè)中具有很大的應用前景。

圖4 Nisin Z 與多粘菌素B 對大腸桿菌的時間-殺菌曲線Fig.4 Time-killing curve of nisin Z and polymyxin B against E.coli

圖5 Nisin Z 與EDTA 二鈉對沙門氏菌的時間-殺菌曲線Fig.5 Time-killing curve of nisin Z and EDTA disodium against Salmonella enterica

3 結論

本文利用Nisin Z 及其它抑菌物質(zhì)對食源性致病菌的抑菌效果進行研究。試驗結果顯示Nisin Z 對革蘭氏陽性菌（蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌）有良好的抑菌效果，對革蘭氏陰性菌抑菌（大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌）效果不明顯，而多粘菌素B、EDTA 二鈉、山梨酸鉀、檸檬酸鈉、雙乙酸鈉對革蘭氏陰性菌有抑菌效果。

使用棋盤法，通過FIC 計算判斷Nisin Z 與幾種抑菌物質(zhì)的協(xié)同抑菌效應。結果發(fā)現(xiàn)Nisin Z 與EDTA 二鈉聯(lián)用對蠟樣芽孢桿菌的協(xié)同效果遠遠大于Nisin Z 與其它抑菌物質(zhì)聯(lián)用的協(xié)同抑菌效果，Nisin Z 的添加量降為單獨抑制時的1/64 倍，EDTA 的添加量為原來單獨使用時的1/25 倍。

Nisin Z （0.078 BU/mL） 與雙乙酸鈉（0.016 mg/mL）聯(lián)用抑制蠟樣芽孢桿菌，在4～6 h，與對照組相比，Nisin Z 與雙乙酸鈉不具有協(xié)同作用；Nisin Z（2.5 BU/mL）與山梨酸鉀（1 mg/mL）聯(lián)用對單增李斯特菌沒有明顯的抑菌增強效果，即協(xié)同作用不太明顯；Nisin Z（0.16 BU/mL）與雙乙酸鈉（15 mg/mL）聯(lián)用抑制金黃色葡萄球菌的協(xié)同作用不太明顯，而單獨使用雙乙酸鈉時，抑菌效果優(yōu)于二者聯(lián)合使用的效果；Nisin Z（1.25 BU/mL）與多粘菌素B（0.1 μg/mL）聯(lián)合使用抑制大腸桿菌，3 h內(nèi)具有協(xié)同效應，而后協(xié)同效應不太明顯；Nisin Z（1.25 BU/mL）與 EDTA 二鈉（0.25 mg/mL）聯(lián)用，對腸道沙門氏菌有協(xié)同抑菌效果。