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    山西老陳醋大曲霉菌生理代謝特征及優(yōu)良菌株間的互作

    2021-05-15 07:11:28王佳麗孫列雄陳旭峰孫建平王如福
    中國食品學(xué)報(bào) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:糖化酶大曲黑曲霉

    王佳麗,朱 丹,孫列雄,陳旭峰,孫建平,王如福,許 女*

    (1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 山西太谷030801)

    大曲作為生產(chǎn)白酒和食醋的主要糖化劑和發(fā)酵劑,對酒醋產(chǎn)品的品質(zhì)至關(guān)重要。目前,大曲的制備方法仍是傳統(tǒng)的自然發(fā)酵,整個(gè)發(fā)酵制備過程依據(jù)傳統(tǒng)工藝形成的固有原料配比和環(huán)境條件變化,微生物自我組裝,互相適應(yīng),自然演變,此消彼長,其中的微生物眾多,酶系豐富,機(jī)理復(fù)雜[1]。

    霉菌是大曲生產(chǎn)制備中最重要的微生物,其主要功能是產(chǎn)生大量的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶,將原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為一些小分子物質(zhì)——還原糖、氨基酸等[2]。大曲中的優(yōu)勢霉菌是曲霉屬和根霉屬。施安輝等[3]通過對徐坊大曲的微生物區(qū)系進(jìn)研究,以及對其優(yōu)勢菌鑒定,結(jié)果顯示:中溫大曲中占優(yōu)勢的霉菌主要為黑曲霉、毛霉、根霉和青霉。姚萬春等[4]系統(tǒng)研究瀘州老窖國窖曲中不同層次間微生物的數(shù)目、種類及優(yōu)勢種群的差異和規(guī)律,結(jié)果顯示:在國窖曲層次間微生物的數(shù)目、種類和優(yōu)勢種群差別較大,其中曲側(cè)表層和曲包表層的微生物數(shù)目較多,霉菌是曲中的主要菌群,微生物的種類較少,根霉為優(yōu)勢菌群。Wang 等[5]通過DGGE 方法在中國白酒釀造用大曲中檢測到米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillus terreus)等霉菌。王佳麗[6]通過菌種分離手段及ITS 測序技術(shù)在大曲制作過程中檢測到14種霉菌,對這些霉菌的產(chǎn)酶能力進(jìn)行測定,篩選出一株高產(chǎn)糖化酶、蛋白酶及纖維素酶的霉菌菌株,經(jīng)鑒定為黑曲霉。黃靜等[7]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)法檢測到食醋大曲中主要的霉菌有曲霉、毛霉、根霉等,其中曲霉和根霉可分泌糖化酶,淀粉酶等,有利于促進(jìn)大曲發(fā)酵。

    黑曲霉具有較強(qiáng)的產(chǎn)糖化酶、液化酶、蛋白酶、單寧酶的能力,還能產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶等其它酶系[8]。目前在制醬、釀酒、制醋等一些釀造工業(yè)中,通常使用黑曲霉作為主要的糖化生產(chǎn)菌株[9]。黑曲霉對風(fēng)味也具有重要貢獻(xiàn),如程偉等[10]從金種子濃香型大曲中分離篩選出1 株產(chǎn)糖化酶的黑曲霉Mxzd-001,將該菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)后產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)主要有醇類、酯類、醛類等推測,該菌株在發(fā)酵代謝的過程中還可產(chǎn)生豐富的酸類物質(zhì),并為酯類物質(zhì)的生成提供前體物質(zhì)。米根霉具有非常強(qiáng)的淀粉酶活力,多用作糖化菌,其次,米根霉還具有酒精發(fā)酵的能力,能夠同時(shí)分解蛋白質(zhì),還可產(chǎn)生乳酸、反丁烯二酸等物質(zhì)[8]。

    鑒于曲霉和根霉對大曲酶活、發(fā)酵力和最終產(chǎn)品風(fēng)味的重要作用,一些學(xué)者開展了大曲中優(yōu)良霉菌的篩選、強(qiáng)化應(yīng)用在酒醋釀造的研究。如:王旭亮等[11]從不同香型白酒大曲中分離篩選出1株優(yōu)良米根霉(Rhizopus oryzae)Rh-07,其在大麥豌豆純種曲培養(yǎng)基中,25 ℃下培養(yǎng)7 d,糖化酶活力高達(dá)2 657.00 U/g。劉曄等[12]從浙江傳統(tǒng)玫瑰醋釀造過程中篩選出高產(chǎn)糖化酶和蛋白酶的米根霉Ml 和米曲霉M17,二者以一定比例強(qiáng)化制備的米曲可明顯縮短玫瑰醋釀造時(shí)間。

    本文主要對山西老陳醋大曲中分離出的75株霉菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,從中篩選出1 株高產(chǎn)糖化酶的菌株-黑曲霉186,將其與大曲中的優(yōu)勢優(yōu)良高產(chǎn)蛋白酶菌株-米根霉774-2 進(jìn)行共培養(yǎng),研究二者不同比例共培養(yǎng)條件下對生物量、酶活、有機(jī)酸和揮發(fā)性香氣的影響,為將來進(jìn)一步揭示霉菌間的共培養(yǎng)機(jī)制及采用優(yōu)良組合菌株進(jìn)行大曲生產(chǎn)代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品 山西老陳醋大曲,山西福源昌老陳醋有限公司。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    1)PDA 培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g,葡萄糖20.0 g,蛋白胨2 g,KH2PO42 g,MgSO4·2H2O 1 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L。1×105Pa 滅菌20 min。

    2)麩皮培養(yǎng)基 將麩皮和水按照1∶1 的質(zhì)量比進(jìn)行混合,1×105Pa 滅菌20 min。

    3)大麥豌豆培養(yǎng)基 將大麥、豌豆、水按照7∶3∶4 的質(zhì)量比進(jìn)行混合,1×105Pa 滅菌20 min。

    1.1.3 主要試劑和儀器 乳酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、酒石酸、草酸均為色譜純級,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;PCR 試劑,生工生物工程(上海)有限公司;PCR 引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

    紫外可見分光光度計(jì)(UV-9100),北京瑞利分析儀器公司;酸度計(jì)(PB-21),賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;液相色譜儀(戴安U3000)、氣相色譜儀(Trace1300)、質(zhì)譜分析儀(TraceISQ),賽默飛世爾科技有限公司;Eppendorf 離心機(jī),艾本德中國有限公司;PCR 儀(T100),美國Bio-Rad 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 山西老陳醋大曲中霉菌的分離鑒定 用稀釋涂布平板法[13]在PDA 培養(yǎng)基上分離不同霉菌,30 ℃培養(yǎng)3 d,純化菌種接種至PDA 培養(yǎng)基上,觀察并記錄菌落顏色及形態(tài)[14],通過形態(tài)描述對篩選出的菌株進(jìn)行初步鑒定。

    采用改良的CTAB 法[15]提取基因組,并以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系和條件見參考文獻(xiàn)[16],PCR 反應(yīng)以ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')為ITS 基因序列的上下游引物。擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    1.2.2 山西老陳醋大曲中霉菌的篩選 用生理鹽水沖洗PDA 培養(yǎng)基上的霉菌孢子,制備孢子懸液,調(diào)整孢子懸液的濃度使其孢子濃度為106個(gè)/mL。將調(diào)整好孢子懸液濃度的霉菌均按2%接種量接種于裝有30 g 麩皮培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中,30 靜置培養(yǎng)3 d。

    將發(fā)酵3 d 的10 g 樣品置于90 mL 緩沖液中,40 ℃下浸提1 h,4 ℃4 000 r/min 離心20 min取上清,采用福林比色法[17]、DNS 比色法[17]、DNS比色法[15]測定上清液中蛋白酶、糖化酶和纖維素酶的活力。

    1.2.3 霉菌之間相互作用研究 將篩選出的高產(chǎn)糖化酶優(yōu)良菌株——黑曲霉186 與大曲中的另1株優(yōu)勢優(yōu)良高產(chǎn)蛋白酶菌株——米根霉774-2,按照1∶0,0∶1,1∶0.1,1∶0.5,1∶1,1∶5,1∶10(體積比),總接種量為2%(體積分?jǐn)?shù))接入大麥豌豆培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng),30 ℃靜置培養(yǎng)8 d 后,測定不同比例共培養(yǎng)體系下的生物量、酶活[15,17]、總酸[18]、總酯[18]、有機(jī)酸和揮發(fā)性香氣成分。

    1)有機(jī)酸的測定 取5 g 發(fā)酵培養(yǎng)物樣品,加入超純水并定容至50 mL,浸泡3 h 后抽濾,于12 000 r/min 條件下離心10 min,取上清液于0.22 μm 微孔濾膜濾樣,進(jìn)樣檢測。色譜條件:液相色譜儀UItimate 3000;色譜柱選擇Agilent ZORBAXC184.6 mm×150 mm,5 μm;流動(dòng)相為pH 2.7 的20 mmol/L NaH2PO4;進(jìn)樣量20 μL;流動(dòng)速度0.8 mL/min;紫外檢測波長210 nm;柱溫30 ℃。

    2)揮發(fā)性香氣成分測定 將萃取頭在進(jìn)樣口于270 ℃老化至無雜峰,將1 g 發(fā)酵培養(yǎng)物樣品于45 ℃孵化爐中平衡30 min,頂空吸附30 min,將萃取頭插入進(jìn)樣口,270 ℃解析5 min。色譜條件:色譜柱為VF-5MS(30 mm×0.25 mm×0.25 mm),載氣:氦氣,純度99.999%,流量1 mL/min,不分流。程序升溫:起始溫度40 ℃,保持3 min,以4 ℃/min 的速度升至160 ℃,保持1 min。再以10℃/min 的速度升至270 ℃保持5 min。質(zhì)譜條件:接口溫度280 ℃,離子源溫度280 ℃,電子能量70 eV,掃描質(zhì)量范圍41~500 u。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 山西老陳醋大曲中霉菌的分離鑒定

    從大曲中共分離到75 株霉菌菌株,根據(jù)其菌落形態(tài)可主要分為10 類,典型菌落形態(tài)見圖1。提取75 株霉菌基因組,擴(kuò)增ITS 序列,測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對,鑒定結(jié)果及菌落形態(tài)描述見表1。

    10 株典型霉菌的ITS 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示,菌186 與黑曲霉(Aspergillus niger strain)B4/1/VF(KX901281.1)和黑曲霉(Aspergillus niger)isolate NJDL-12(KT832690.1)的相似度最高,可達(dá)99%,可鑒定為黑曲霉。最終,75 株霉菌中,總狀橫梗霉(Lichtheimia ramosa)25 株,米根霉(Rhizopus oryzae)21 株,草莖點(diǎn)霉(Phoma herbarum)3 株,輪枝樣鐮刀菌(Fusarium verticillioides)3 株,黃曲霉(Aspergillus flavus)5 株,藍(lán)狀菌(Talaromyces stollii)3 株,煙曲霉(Aspergillus fumigatus)1 株,極細(xì)鏈格孢菌(Alternaria tenuissima)1 株,黑曲霉(Aspergillus niger)10 株,小孢根霉(Rhizopus microsporus)3 株。

    可見,黑曲霉和米根霉在大曲中所占比例較高,分別為13%和28%,根霉具有很強(qiáng)的淀粉酶活性,是一種常用的糖化菌,能夠產(chǎn)生一些有機(jī)酸,如乳酸、琥珀酸、蘋果酸和延胡索酸等,還可以產(chǎn)生一些芳香性的風(fēng)味物質(zhì),如酯類物質(zhì)和乙醛、乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯、乙酸、苯乙醇等;曲霉菌主要有黑曲霉、黃曲霉、煙曲霉等,它們的習(xí)性與根霉相同,富含淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶系,黑曲霉是α-淀粉酶與酸性蛋白酶的主要來源,在釀造的高溫和酸性或強(qiáng)酸性環(huán)境下,這2種酶依舊可以發(fā)揮作用,還可以產(chǎn)生活性較高的糖化酶,它們是釀造原料中淀粉質(zhì)與蛋白質(zhì)的主要降解酶;煙曲霉在釀造中能夠分泌α-葡萄糖酐酶,可以將葡萄糖釋放,并將葡萄糖轉(zhuǎn)移給其它的受體[19]。

    圖1 山西老陳醋大曲中典型霉菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of typical molds isolated from Daqu of Shanxi aged vinegar

    表1 75 株從山西老陳醋大曲中分離的霉菌鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of 75 molds isolated from Daqu of Shanxi aged vinegar

    圖2 山西老陳醋大曲中霉菌的種類分布Fig.2 The distribution of mold species of Daqu of Shanxi aged vinegar

    2.2 山西老陳醋大曲中霉菌的篩選

    糖化酶是淀粉糖化酶(Glucoamylase EC.3.2.1.3)的簡稱,又稱γ-淀粉酶(γ-amylase),它可以從淀粉的非還原性末端依次切下一個(gè)葡萄糖單位,并將淀粉水解成葡萄糖[14]。糖化酶不斷催化淀粉質(zhì)原料為葡萄糖,使之作為酒精發(fā)酵階段酵母菌的營養(yǎng)源。在食醋釀造過程中添加糖化酶可以將酒精發(fā)酵液快速升溫,提高原料的利用率,大大縮短發(fā)酵時(shí)間[20]。

    蛋白酶在食醋釀造過程中極其重要,蛋白酶具有水解作用,可以將原料與大曲中的蛋白質(zhì)分解為可溶性含氮物,如多肽、氨基酸等,蛋白酶的活性越高,食醋中可溶性含氮物就越多,原料中蛋白質(zhì)利用率越高,食醋的營養(yǎng)越豐富,除此之外,一些氨基酸是山西老陳醋中某些風(fēng)味的前體物質(zhì),在經(jīng)過豐富的微生物酶系的代謝后,還可以產(chǎn)生多種芳香物質(zhì);更加重要的是,近年來研究表明,生產(chǎn)蛋白酶高活性霉菌的應(yīng)用有助于解決食醋的沉淀問題[20-21]。

    纖維素酶是一種復(fù)合酶,包括外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,在纖維素酶的作用下,食醋釀造原料中的纖維素能夠轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性的糖,從而增加了原料中可利用的碳源,纖維素酶還可以破壞原料中的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),促進(jìn)淀粉溶出,這有利于糖化酶更好地進(jìn)行糖化。纖維素酶應(yīng)用于食醋生產(chǎn)中,可提高其出醋率[18]。

    圖3 10 株典型霉菌的ITS 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS gene of 10 typical molds isolated from Daqu of Shanxi aged vinegar

    山西老陳醋大曲中分離的75 株霉菌菌株,經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)酶篩選,最終得到糖化酶、蛋白酶和纖維素酶3 種酶活均較高的菌株有29 株,這29 株霉菌產(chǎn)酶具體數(shù)據(jù)見圖4,其中黑曲霉186 的糖化酶、纖維素酶活力最高,采用麩皮培養(yǎng)基30 ℃下培養(yǎng)3 d 的糖化酶活力可達(dá)4 279.11 U/g,顯著高于王旭亮等[11]和程偉等[10]從釀酒大曲中分離的黑曲霉在25 ℃或30 ℃下培養(yǎng)7 d(708.5 U/g)或4 d(1 050 U/g)的糖化酶活力。并且,黑曲霉186 的纖維素酶活力高達(dá)到4 476.60 U/g,顯著高于程偉等[10]從濃香型大曲中篩選出的黑曲霉Mxzd-001采用麩皮培養(yǎng)基30 ℃下培養(yǎng)4 d 的纖維素酶活力(411 U/g)。

    2.3 黑曲霉186 和米根霉774-2 之間相互作用研究

    2.3.1 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)中霉菌生物量變化 米根霉(Rhizopus oryzae)774-2 在大曲中占28%(圖2),為山西老陳醋大曲中的優(yōu)勢菌,其蛋白酶活力較高,為158.19 U/g。將篩選出的高產(chǎn)酶活的黑曲霉186 和大曲優(yōu)勢優(yōu)良菌株米根霉774-2 共培養(yǎng)進(jìn)行互作研究。以黑曲霉186、米根霉774-2 純培養(yǎng)為對照(即1∶0 和0∶1),研究共培養(yǎng)相互作用對霉菌生物量的影響。如圖5所示,在不同比例下共培養(yǎng),2 株菌的生長趨勢與純培養(yǎng)條件下的生長趨勢接近,表明在不同比例下共培養(yǎng),各菌的生長均無顯著影響。

    圖4 山西老陳醋大曲中霉菌酶活力測定結(jié)果Fig.4 Determination results of enzyme activity of molds isolated from Daqu of Shanxi aged vinegar

    圖5 純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)體系中黑曲霉186、米根霉774-2 生長曲線Fig.5 The growth curve of Aspergillus niger 186,Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

    2.3.2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)產(chǎn)酶差異 將黑曲霉186和米根霉774-2 共培養(yǎng),檢測純培養(yǎng)與共培養(yǎng)下產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、纖維素酶的能力。如圖6所示,不同比例下共培養(yǎng)蛋白酶活力均不同程度地高于2 株菌純培養(yǎng)的蛋白酶活力。當(dāng)黑曲霉186和米根霉774-2 的比例為1∶5 時(shí),蛋白酶活力最高,為282.04 U/g,顯著高于黑曲霉186 純培養(yǎng)(即1∶0)和米根霉774-2 純培養(yǎng)(即0∶1)的蛋白酶活力(115.88 U/g 和158.19 U/g),表明適當(dāng)添加米根霉774-2 可有效提高體系中蛋白酶的活力。徐丹等[22]比較了黃曲霉和米曲霉純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系下的產(chǎn)蛋白酶活性,結(jié)果表明二者共培養(yǎng)10 d后,其酸性蛋白酶活性、中性蛋白酶活性和堿性蛋白酶活性比米曲霉純培養(yǎng)分別降低了3.1,3.2 和4.1 倍,證明黃曲霉對米曲霉的產(chǎn)蛋白酶活性具有抑制作用。

    圖6結(jié)果證明,共培養(yǎng)體系下,同樣在二者比例為1∶5 時(shí)糖化酶和纖維素酶活力相對其它比例要高,分別達(dá)1 874.21 U/g 和300.67 U/g,然而遠(yuǎn)低于黑曲霉186 純培養(yǎng)(1∶0)時(shí)的糖化酶和纖維素酶活力。分析原因:在總接種量一定的情況下,由于添加了米根霉從而減少了高產(chǎn)糖化酶和纖維素酶菌株186 的接種量,因此造成共培養(yǎng)體系下糖化酶和纖維素酶低于黑曲霉186 純培養(yǎng)體系。然而霉菌間的產(chǎn)酶互作機(jī)制非常復(fù)雜,需進(jìn)一步系統(tǒng)深入研究。

    2.3.3 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)產(chǎn)酸差異 在制曲過程中,大曲酸度的形成來源于生酸微生物的有機(jī)酸代謝,比如乳酸菌及醋酸菌均提供一些有機(jī)酸,主要是醋酸、乳酸;脂肪的降解,生成脂肪酸等;蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉降解之后,即進(jìn)入三羧酸循環(huán)系統(tǒng),可生成各類酸類物質(zhì)[18],大曲酸度的高低也可以定性地將大曲復(fù)合曲香物質(zhì)的強(qiáng)弱反映出來,而霉菌是大曲中的優(yōu)勢菌,霉菌不僅僅有產(chǎn)酶的能力,同時(shí)也可產(chǎn)生有機(jī)酸,提供風(fēng)味前體。關(guān)叢笑[23]從基因、蛋白表達(dá)的角度闡釋黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸機(jī)理的同時(shí)發(fā)現(xiàn)黑曲霉可產(chǎn)生乙醛酸、琥珀酸、乳酸等多種有機(jī)酸。分析霉菌互作對大曲有機(jī)酸產(chǎn)生等風(fēng)味的影響[24]尤為重要。

    如圖7所示,不同比例下共培養(yǎng)總酸差異較大。當(dāng)黑曲霉186 和米根霉774-2 的比例為1∶5時(shí),產(chǎn)酸最高,為0.48 g/100 g,高于黑曲霉186 純培養(yǎng)(1∶0)的產(chǎn)酸量(0.36 g/100 g)。

    山西老陳醋的重要組成部分之一就是有機(jī)酸,其中的不揮發(fā)酸可以中和乙酸的刺激性,從而使得醋中的酸味柔和,大曲中的有機(jī)酸在食醋生產(chǎn)過程中直接或間接進(jìn)入醋體,對食醋的品質(zhì)產(chǎn)生重大影響,檢測純培養(yǎng)與共培養(yǎng)下乳酸、丙酮酸、草酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸等有機(jī)酸的含量。如圖8所示,不同比例下共培養(yǎng)產(chǎn)有機(jī)酸差異較大,共培養(yǎng)比例為1∶10,1∶5,1∶1的有機(jī)酸譜相似,聚為一簇,比例為1∶0.5,1∶0.1及純培養(yǎng)的有機(jī)酸譜聚為另一簇。當(dāng)二者比例為1∶5 時(shí),有機(jī)酸含量最高,為4.7260 mg/g,比黑曲霉186 純培養(yǎng)顯著提高了25.13%,其中草酸、丙酮酸、琥珀酸的含量與黑曲霉186 純培養(yǎng)相比分別提高了1.9514,0.0340,0.0048 mg/g;而米根霉774-2 的比例低于黑曲霉186 時(shí),則共培養(yǎng)體系相對于黑曲霉186 純培養(yǎng)減少了有機(jī)酸的生成,證明米根霉774-2 對黑曲霉186 產(chǎn)有機(jī)酸有一定的影響。

    圖6 純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)體系中黑曲霉186、米根霉774-2 產(chǎn)酶差異Fig.6 The enzyme production of Aspergillus niger 186,Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

    2.3.4 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)產(chǎn)香差異

    圖7 純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)體系中黑曲霉186、米根霉774-2 產(chǎn)酸差異Fig.7 The acid production of Aspergillus niger 186,Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

    2.3.4.1 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)產(chǎn)酯差異 霉菌在產(chǎn)酯生香方面亦具有極其重要的作用,是發(fā)酵食品中一類重要的功能性微生物,例如:霉菌中的根霉能夠產(chǎn)生乙醇、2-甲基-1-丁酮、3-甲基-1-丁酮等,紅曲霉則能夠產(chǎn)生脂肪酶等,這些代謝產(chǎn)物以及酶類可對發(fā)酵食品的風(fēng)味和口感產(chǎn)生重要影響[24]。霉菌在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生各種呈香物質(zhì),比如高級醇、醛、酮、酯等,這些物質(zhì)對于大曲、食醋風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味前體物質(zhì)的形成起著重要作用。圖9顯示不同比例共培養(yǎng)體系下產(chǎn)酯能力差異較大。當(dāng)黑曲霉186 和米根霉774-2 的比例為1∶0.5時(shí),產(chǎn)酯含量最高,為6.12 g/100 g,相較于黑曲霉186 純培養(yǎng)提高了6.07%;而在其它比例下,共培養(yǎng)的產(chǎn)酯能力均低于黑曲霉186 和米根霉774-2純培養(yǎng)的產(chǎn)酯能力。

    2.3.4.2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)揮發(fā)性香氣成分研究霉菌可以產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,例如:乙醇、苯乙醇、3-甲基丁醇、十六酸乙酯、油酸乙酯、2-甲基-1-丁酮、3-甲基-1-丁酮、乙酸、苯乙酸、3-甲基丁酸、亞麻油酸、α-亞乙基-苯乙醛等物質(zhì),其中,許多物質(zhì)為食品中的風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味前體,也是大曲中眾多呈香、呈味物質(zhì)的組成成分,對發(fā)酵食品的風(fēng)味和口感有重要影響[25-26]。因此,研究霉菌純培養(yǎng)與共培養(yǎng)的揮發(fā)性香氣成分的意義重大。

    分析在大麥豌豆培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵8 天后,黑曲霉186 和米根霉774-2 純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)體系中揮發(fā)性香氣成分,選取大曲及食醋中典型的41 種風(fēng)味物質(zhì)繪制熱點(diǎn)圖(圖10),其中選取酯類10 種,醇類12 種,酸類1 種,酮類6 種,醛類5 種和其它類物質(zhì)7 種。檢測結(jié)果顯示,黑曲霉186 生成的醛類和醇類物質(zhì)的種類較豐富,其中,大曲中典型的具有果香茉莉氣息的辛醛,蜜蠟花香的壬醛的含量均大于0.0080 mg/100 g,1-辛烯-3-醇的含量達(dá)到1.4618 mg/100 g。

    圖8 黑曲霉186、米根霉774-2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)有機(jī)酸含量熱圖Fig.8 Heat map of organic acid compounds of Aspergillus niger 186 and Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

    圖9 純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)體系中黑曲霉186、米根霉774-2 產(chǎn)酯差異Fig.9 The ester production of Aspergillus niger 186,Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

    純培養(yǎng)和不同比例的共培養(yǎng)體系的揮發(fā)性香氣成分含量差異較為明顯。當(dāng)黑曲霉186 和米根霉774-2 的比例為1∶0.5 時(shí),共培養(yǎng)體系中酮類、醛類、醇類、酸類的含量最高,種類最豐富,酯類物質(zhì)的含量相對較高,種類較豐富,其中,大曲中重要的風(fēng)味化合物,如呈強(qiáng)烈蘋果皮、菠蘿皮和未成熟李子皮香氣的2-甲基丁酸乙酯,有干甜而尖銳的脂蠟香氣又帶有柑橘、橙皮和玫瑰樣氣息的辛醇,帶有蘑菇和泥土味的1-辛烯-3-醇,呈強(qiáng)烈油脂、果仁和草藥香味的3-辛醇,具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣的苯乙醇含量分別達(dá)到0.0098,0.1131,16.5057,9.3499,0.3005 mg/100 g,顯著高于純培養(yǎng)。

    結(jié)合PCA 分析(圖11),S1(黑曲霉186 純培養(yǎng))、S2(米根霉774-2 純培養(yǎng))、S3(黑曲霉186 與米根霉774-2 的比例為1∶0.1) 三者相距接近,表明產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類和含量相似。S4,S5,S6 和S7 相距較遠(yuǎn),說明其它比例下的共培養(yǎng)對揮發(fā)性香氣成分的產(chǎn)生影響差異顯著,主要體現(xiàn)在醇類、酸類及酮類上。從載荷圖上可以看出,對差異有重要貢獻(xiàn)的成分都集中分布于PC1 和PC2 的正向,S4(1∶0.5)集中于此,與許多揮發(fā)性香氣物質(zhì)顯著相關(guān),即黑曲霉186 和米根霉774-2的比例為1∶0.5 共培養(yǎng)對風(fēng)味貢獻(xiàn)很大,可見大曲風(fēng)味物質(zhì)與霉菌代謝活動(dòng)有重要相關(guān)性。

    綜上可知,與純培養(yǎng)時(shí)相比,黑曲霉186 和米根霉774-2 在混合培養(yǎng)體系中,一些揮發(fā)性香氣成分的含量和種類會(huì)有所增加,這些揮發(fā)性香氣成分為大曲中主要的呈味物質(zhì),其含量變化會(huì)影響大曲的質(zhì)量及品質(zhì),同時(shí)說明在不同比例下,兩菌株相互作用產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)差異較大,深入研究霉菌之間相互作用機(jī)制,并有目的性地應(yīng)用于大曲強(qiáng)化對于山西老陳醋的風(fēng)味顯得十分重要。

    3 結(jié)論

    本文主要從山西老陳醋大曲來源的75 株霉菌中篩選出1 株高產(chǎn)糖化酶的菌株-黑曲霉186,將其與大曲中的優(yōu)勢優(yōu)良高產(chǎn)蛋白酶菌株-米根霉774-2 進(jìn)行共培養(yǎng)互作研究,結(jié)果表明當(dāng)二者比例為1∶5 時(shí),其蛋白酶、有機(jī)酸產(chǎn)量顯著高于黑曲霉186 純培養(yǎng);當(dāng)比例為1∶0.5 時(shí)產(chǎn)酯量較純培養(yǎng)有所提高,揮發(fā)性香氣成分的種類和含量也高于純培養(yǎng)。本研究對霉菌共培養(yǎng)互作機(jī)制的揭示,強(qiáng)化大曲的生產(chǎn),老陳醋的提質(zhì)增效,具有十分重要的意義。

    圖10 黑曲霉186、米根霉774-2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)揮發(fā)性香氣成分含量熱圖Fig.10 Heat map of volatile flavour compounds of Aspergillus niger 186 and Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

    圖11 黑曲霉186、米根霉774-2 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)風(fēng)味PCA 分析Fig.11 PCA analysis of the flavor of Aspergillus niger 186 and Rhizopus oryzae 774-2 in pure and mixed culture

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