芪參益氣滴丸對(duì)急性心梗大鼠α7nAChR抗炎通路的影響

嚴(yán)孝花，衛(wèi) 國

AMI因發(fā)病率高、預(yù)后差，嚴(yán)重威脅我國人民的健康[1]。AMI作為世界范圍內(nèi)主要的死亡原因[2]，目前在我國死亡率總體呈上升態(tài)勢(shì)并且趨于年輕化趨勢(shì)，2016年AMI死亡率城市為58.69/10萬，農(nóng)村為74.72/10萬[3]。盡管目前隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，AMI的住院病死率降低了，但AMI后心力衰竭、心率失常及猝死等再發(fā)急性心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)仍非常高，因此AMI防治任務(wù)仍非常艱巨。

中醫(yī)醫(yī)學(xué)很早就有關(guān)于AMI方面的認(rèn)識(shí)和治療方法，并且中醫(yī)藥在防治心血管疾病方面具有自己的臨床優(yōu)勢(shì)[4-5]。隨著現(xiàn)代中藥醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來越多的現(xiàn)代中藥制劑被應(yīng)用于臨床，芪參益氣滴丸作為一款現(xiàn)代中藥制劑，目前廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病，能顯著改善AMI患者的預(yù)后[6]。盡管目前芪參益氣滴丸在AMI防治方面效果顯著，多個(gè)研究也從不同的研究方向?qū)ζ渥饔脵C(jī)制進(jìn)行了探討，但其作用機(jī)制仍不是十分清楚。本研究通過建立大鼠AMI模型，應(yīng)用芪參益氣滴丸予以治療后，觀察其對(duì)AMI大鼠α7nAChR抗炎通路的影響，來探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 無特定病原體（SPF）級(jí)SD健康成年雄性大鼠,體重(280±20)g購自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(批號(hào)：20181113)。IL-6、α7nAChR、NFκB p50、NF-κB p65抗體及RNA提取試劑盒（英國，Abcam）；TakaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒（大連TakaRa）；TUNEL檢測(cè)試劑盒（北京鼎國）；HE染色試劑盒及Masson染色試劑盒（上海江萊生物）；IL-6，TNF-α、NF-κB p50和NF-κB p65的TaqMan探針，由安諾倫（北京）生物科技有限公司代理設(shè)計(jì)。BIO-RAD電泳、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、ChemiDoc TM XRS+膠成像儀器（美國BIO-RAD公司），Nikon Tis型熒光顯微鏡及配套分析軟件NIS-Elements Software BR（日本尼康公司），Vevo2100小型動(dòng)物超聲儀（加拿大Visual Sonics公司）。芪參益氣滴丸購于天士力制藥集團(tuán)股份有限公司(批號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z20030139，規(guī)格為0.5 g/袋)。

1.2 動(dòng)物模型制備及分組 選用45只成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組及治療組，每組15只。模型組及治療組采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立AMI動(dòng)物模型，按文獻(xiàn)報(bào)道的造模方法建立動(dòng)物模型[7]，假手術(shù)組僅手術(shù)不結(jié)扎血管左冠狀動(dòng)脈前降支，余步驟同前。術(shù)后第2 d，治療組灌芪參益氣滴丸40 mg/(kg.d)，假手術(shù)組及模型組給予灌4 ml/(kg.d)等量重量鹽水，連用28 d。各組在第28 d結(jié)束后，戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，先行超聲心動(dòng)圖檢查，而后腹主動(dòng)脈穿刺抽血及摘取心臟，處死大鼠。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)及心功能 按文獻(xiàn)報(bào)道的超聲心動(dòng)圖檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)[8]。

1.3.2 心肌組織病理學(xué)觀察 取處死大鼠心臟，沿左心室長軸中段橫斷面切片，制作4μm厚石蠟切片，分別HE染色及Masson染色，在光鏡下觀察分析心肌組織形態(tài)學(xué)變化情況。

1.3.3 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡 取以上各組制備的石蠟切片，按照TUNEL染色試劑盒提供的方法步驟染色，DAPI細(xì)胞核復(fù)染。熒光顯微鏡下觀察，每張玻片選10個(gè)非重復(fù)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清IL-6及TNF-α的表達(dá) 腹主動(dòng)脈采血后，3000 r/min離心15 min，取血清，艾本德(Eppendof)管分裝凍存于-80℃冰箱備檢。采用ELISA法按試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測(cè)大鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。

1.3.5 蛋白印跡法檢測(cè)心肌組織中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白的表達(dá)取0.2 g心尖部心肌組織，提取心肌蛋白，經(jīng)定量、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗及二抗封閉、發(fā)光，顯影條帶圖像掃描，應(yīng)用Scion Image軟件測(cè)量分析。

1.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA的表達(dá)

根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行操作，TaqMan探針，引物設(shè)計(jì)及PCR條件（表1）。提取心肌組織總RNA，用RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR條件：94℃，4 min，55℃，30 s，60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)，凝膠成像系統(tǒng)攝像掃描并分析。

表1 實(shí)時(shí)定量(PCR）引物設(shè)計(jì)及條件

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以?s表示，多組間均數(shù)比較采用one-wayANOV分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的生存情況比較 造模成功后，觀察各組大鼠的病死率情況，假手術(shù)組，病死率為13.3%，模型組與治療兩組大鼠存活率無明顯差異（圖1）。

圖1 各組大鼠生存情況

2.2 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)及心功能比較 28 d后各組大鼠行超聲心電圖檢查提示，模型組與治療組整體大鼠左室擴(kuò)大，心臟收縮功能降低，與假手術(shù)組比較有明顯差異(P＜0.05)。治療組與模型組比較，治療組大鼠LVDd、LVDs均顯著降低（P＜0.05），LVEF顯著提高（P＜0.05）,見表2。

表2 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能比較(?s)

表2 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能比較(?s)

注:與假手術(shù)組比較,①P ＜ 0.05； 與模型組比較,②P ＜0.05

組別 LVDd（mm） LVDs（mm） LVEF（%）假手術(shù)組 5.78±0.73? 2.73±0.79? 80.35±3.53?模型組 7.15±1.68?? 5.82±1.57?? 42.26±13.74?治療組 6.46±1.49???? 3.90±1.38???? 61.49±16.28????

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察 HE染色及Masson染色顯示假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)基本正常，模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)不規(guī)則，模糊，肌纖維壞死、斷裂、萎縮、排列不整齊，巨噬細(xì)胞等大量炎性細(xì)胞浸潤，心肌間纖維組織增生明顯；治療組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)基本規(guī)則，肌纖維壞死、萎縮及斷裂較少，排列較整齊，有少量的巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，心肌間纖維組織增生不明顯。

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，模型組及治療組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加（P＜0.05）；模型組與治療組比較，治療組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05），見表3。

2.5 各組大鼠血清中IL-6及TNF-α的表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組及治療組血清中IL-6及TNF-α的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；模型組與治療組比較，治療組大鼠血清中IL-6及TNF-α的表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、血清IL(?s)

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、血清IL(?s)

注:與假手術(shù)組比較,①P ＜ 0.05;與模型組比較,②P ＜ 0.05

組別 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（%） IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L）假手術(shù)組 0.58±0.43 7.04±1.24 2.35±0.57模型組 17.35±3.34? 23.42±3.54? 5.22±0.72?治療組 10.59±4.29??? 14.62±4.62??? 3.76±0.85???

2.6 各組大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白的表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組及治療組心肌組織中IL-6、TNF-α、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），而α7nAChR蛋白明顯下降（P＜0.05）；模型組與治療組比較，治療組大鼠心肌中IL-6、TNF-α、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白的表達(dá)顯著下降（P＜0.05），而α7nAChR蛋白表達(dá)顯著升高（表4）。

表4 各組大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白表達(dá)的灰度值比較(?s)

表4 各組大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65蛋白表達(dá)的灰度值比較(?s)

注:與假手術(shù)組比較,①P ＜ 0.05;與模型組比較, ②P ＜ 0.05

組別 IL-6 TNF-α α7nAChR NF-κB p50 NF-κB p65假手術(shù)組 0.81±0.23 0.76±0.26 0.76±0.12 0.54±0.15 0.47±0.21模型組 1.32±1.02? 1.56±0.54? 0.42±0.21? 0.87±0.26?? 0.84±0.31??治療組 1.06±0.62??? 1.22±0.59??? 0.56±0.24??? 0.64±0.21??? 0.71±0.25???

2.7 各組大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA的表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組及治療組心肌組織中IL-6、TNF-α、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），而α7nAChR mRNA明顯下降（P＜0.05）；模型組與治療組比較，治療組大鼠心肌中IL-6、TNF-α、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA的表達(dá)顯著下降（P＜0.05），而α7nAChR mRNA表達(dá)顯著升高（表5）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)程度與AMI預(yù)后密切相關(guān)，抑制炎癥反應(yīng)可以明顯改善AMI預(yù)后[9-10]，也是一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。膽堿能抗炎通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)通路，其作用機(jī)制與刺激通過傳出迷走神經(jīng)未稍釋放乙酰膽堿，并與免疫細(xì)胞表面α7nAChR特異性結(jié)合，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路，減少炎性因子的釋放有關(guān)。NF-κB最先由David Schatz發(fā)現(xiàn)的一種核蛋白因子，不僅存在于免疫細(xì)胞中，也存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中。通常情況下，IκB與NF-κB p65（含DNA結(jié)合位點(diǎn)）、p50（含移位信號(hào)）兩個(gè)亞單位的二聚體以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，兩個(gè)亞單位受IκB抑制分子的調(diào)節(jié)。AMI發(fā)生時(shí)，IL-6、TNF-α等促炎因子表達(dá)增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的IκB激酶被激活，IκB部分被降解，移位信號(hào)和DNA結(jié)合位點(diǎn)顯露，含有兩個(gè)亞單位的二聚體被迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活靶基因，促進(jìn)了多種炎性因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α等基因的表達(dá)，大量炎性介質(zhì)釋放，從而誘導(dǎo)過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生，造成心肌損傷。通過干預(yù)α7nAChR通路，可以加重或減輕AMI損傷引起的炎癥反應(yīng)所致的心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)或加重心室重構(gòu)，改善/惡化心功能。

表5 各組大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度比較(?s)

表5 各組大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α、α7nAChR、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度比較(?s)

注:與假手術(shù)組比較,①P ＜ 0.05;與模型組比較, ②P ＜ 0.05

組別 IL-6 TNF-α α7nAChR NF-κB p50 NF-κB p65假手術(shù)組 0.55±0.16 0.64±0.13 0.73±0.27 0.60±0.21 0.56±0.24模型組 2.12±1.14? 1.76±0.79? 0.32±0.19? 1.37±0.35? 1.11±0.38?治療組 1.26±0.62??? 1.17±0.52??? 0.46±0.31??? 0.84±0.39??? 0.75±0.28???

本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用芪參益氣滴丸可以減輕AMI后心肌細(xì)胞的凋亡，改善心臟結(jié)構(gòu)，提高心功能，減輕AMI損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)。應(yīng)用芪參益氣滴丸進(jìn)行治療AMI的大鼠后，大鼠血清及心臟組織中α7nAChR的表達(dá)顯著升高，炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)明顯減少，提示其抗炎作用的發(fā)揮與α7nAChR抗炎通路有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，芪參益氣滴丸可通過抑制胞質(zhì)型磷脂酶A2（cPLA2）的合成及下調(diào)HMGB1表達(dá)，減少或下調(diào)下游炎性因子的釋放[11-12]；也可通過TLR-4/NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)炎性因子的表達(dá)[13]。由于中藥制劑成份復(fù)雜的特性，在目前的現(xiàn)有的研究中（包括本研究）共同存在不足之處，沒有明確芪參益氣滴丸中所含具體的哪種和/或多種化學(xué)成份單獨(dú)或共同發(fā)揮了抗炎作用。由此可見，芪參益氣滴丸抗炎作用機(jī)制非常復(fù)雜，是通過多因素、多途徑、多靶點(diǎn)啟動(dòng)內(nèi)源性的調(diào)節(jié)機(jī)制，發(fā)揮其強(qiáng)大的抗炎作用。

盡管目前的研究共同顯示了芪參益氣滴丸在大鼠AMI后發(fā)揮的抗炎作用及不同的抗炎機(jī)制，但其相關(guān)機(jī)制中，是否以膽堿能抗炎通路機(jī)制占優(yōu)勢(shì)，還是其他通路機(jī)制占優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)不明確，也未見研究，提示這將是下一步的研究工作的方向。