基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討涼血消斑湯治療尋常型銀屑病的作用機(jī)制

湯菲菲， 梁鵬晨， 石涵芬， 張澤涵， 孟慶鴻，程發(fā)峰， 王慶國， 王雪茜

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 北京 100029； 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院， 上海 201203)

銀屑病是T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病, 典型特征是表皮增生、角化過度、炎性細(xì)胞浸潤及新生血管形成[1-2]，其病理主要包括角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化異常，角質(zhì)層Munro微膿瘍形成以及真皮淺層以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤[3]。銀屑病的全球患病率為0.1%～3.0%[4]，根據(jù)一項(xiàng)中國六省市調(diào)研結(jié)果顯示，我國銀屑病患病率達(dá)0.6%，且臨床分型以尋常型銀屑病為主(97.06%)[5]。銀屑病由多個(gè)基因控制，并且還受到諸如遺傳、感染、代謝和免疫功能障礙等因素的影響[6-7]。

涼血消斑湯是王慶國教授治療銀屑病血熱證的代表方，以白虎湯合清營湯為基礎(chǔ)加減而成，由生石膏、知母、水牛角絲、連翹、生地、赤芍和忍冬藤等藥味組成。全方以大劑量石膏為君，聯(lián)合涼血清氣之品，發(fā)揮“透熱轉(zhuǎn)氣”之功，“透熱轉(zhuǎn)氣”法也是臨床上治療銀屑病血熱證的思路之一。但復(fù)方存在復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)和多靶點(diǎn)、多途徑的效應(yīng)模式，為系統(tǒng)研究涼血消斑湯對銀屑病的作用機(jī)制，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來挖掘復(fù)方的作用靶點(diǎn)與通路，在此基礎(chǔ)上利用核心分子-蛋白對的分子對接來進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 藥物潛在靶標(biāo)與疾病基因獲取

在TCMSP(http:∥www.tcmspw.com/tcmsp.php)平臺檢索知母、赤芍及連翹的化學(xué)成分，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到這三味藥的有效成分，同時(shí)在此數(shù)據(jù)庫獲得所有有效成分的作用靶點(diǎn)。通過BATMAN-TCM(http:∥bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)得到生石膏、生地黃、水牛角和忍冬藤的有效成分及對應(yīng)的作用靶點(diǎn)(分?jǐn)?shù)閾值≥20)。

以“psoriasis”作為關(guān)鍵詞，從GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到銀屑病相關(guān)基因。

1.2 交集基因與核心基因篩選

運(yùn)用R語言將該方藥物成分的預(yù)測靶點(diǎn)與銀屑病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到?jīng)鲅邷c銀屑病的交集靶點(diǎn)。將得到的交集靶點(diǎn)上傳到STRING(https:∥string-db.org/)，根據(jù)交集基因之間的相互作用計(jì)算每個(gè)基因的結(jié)點(diǎn)評分，再將評分?jǐn)?shù)據(jù)輸入到Cytoscape 3.7.2軟件中，利用Cytohubba插件和馬修斯相關(guān)系數(shù)(MCC)算法篩選出結(jié)點(diǎn)評分≥2倍中位數(shù)的基因，即核心基因。

1.3 PPI與藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選所得核心基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，蛋白質(zhì)類型定義為“Homo sapiens”，設(shè)定置信度得分≥0.4，去除游離蛋白，得到蛋白的相互作用關(guān)系后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，分別構(gòu)建核心基因之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)以及藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)模型[8]。運(yùn)用R語言基于蛋白間相互作用度值繪制排名前30的基因靶點(diǎn)條形圖。

1.4 通路富集分析

將篩選的核心交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(http:∥metascape.org)，該平臺提供的富集分析包括KEGG、GO、R-HAS(生物學(xué)反應(yīng)及信號通路)、Canonical Pathways(經(jīng)典通路)、hall標(biāo)記基因集等，將所有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集項(xiàng)通過累積超幾何P值和富集因子進(jìn)行篩選過濾，根據(jù)基因間的κ統(tǒng)計(jì)相似性將剩余的富集項(xiàng)分層聚類，以κ值=0.3作為閾值，將分層聚類樹轉(zhuǎn)化為富集項(xiàng)集群。以集群中具有代表性的富集項(xiàng)作為該群集的子集，并通過Cytoscape 3.7.2構(gòu)建可視化子集網(wǎng)絡(luò)。

通過MCODE算法對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行蛋白質(zhì)緊密度識別和模塊劃分。通過富集分析，羅列出每個(gè)模塊P值排名前3位的富集項(xiàng)。

1.5 分子對接

通過PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取化合物的MOL2文件，用Open Babel 2.3.2軟件將MOL2文件轉(zhuǎn)化為PDB文件，從Protein Data Bank (http:∥www.rcsb.org/pdb) 數(shù)據(jù)庫中檢索獲得相應(yīng)的受體蛋白，利用PyMol 2.3.4和AutoDockTools軟件對受體蛋白進(jìn)行系列操作與修飾，利用AutoDock Vina 1.1.2對5個(gè)受體蛋白與9個(gè)配體分子兩兩進(jìn)行分子對接，所得結(jié)合能越低則提示受體與配體的結(jié)合效果越好。本研究假設(shè)結(jié)合能<-8 kcal/mol為結(jié)合具有顯著性，以此驗(yàn)證涼血消斑湯在銀屑病治療中的合理性。利用Ligplus軟件分析化合物與蛋白對接的疏水和氫健作用力。

2 結(jié)果

2.1 藥物-疾病交集基因與核心基因篩選結(jié)果

根據(jù)篩選原則，從TCMSP和BATMAN數(shù)據(jù)庫中獲得涼血消斑湯的有效成分共121個(gè)，可預(yù)測到932個(gè)對應(yīng)的非重復(fù)靶標(biāo)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索“psoriasis”，共發(fā)現(xiàn)3 766個(gè)與銀屑病相關(guān)的基因。通過韋恩圖的繪制發(fā)現(xiàn)，藥物潛在靶標(biāo)與疾病基因之間共有270個(gè)交集基因。將這270個(gè)交集基因在STRING數(shù)據(jù)庫中的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，通過cytohubba插件計(jì)算每個(gè)基因的MCC得分，求得其中位數(shù)為120 444 286，根據(jù)“≥2倍中位數(shù)”的篩選原則，精選得到128個(gè)核心基因。

2.2 PPI與涼血消斑湯-化合物-靶點(diǎn)-銀屑病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將128個(gè)核心基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫得到PPI網(wǎng)絡(luò)及根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值繪制的條形圖(圖1)，網(wǎng)絡(luò)圖由128個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 370條邊構(gòu)成，在PPI網(wǎng)絡(luò)的蛋白中，度值排名前10的分別為胰島素(INS)、蛋白激酶1(AKT1)、白介素6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、表皮生長因子受體(EGFR)、JUN蛋白(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)。

圖1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖與其條形圖

使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建涼血消斑湯-化合物-靶點(diǎn)-銀屑病網(wǎng)絡(luò)(圖2)。圖中共有190個(gè)節(jié)點(diǎn)，613條線。紅色和深藍(lán)色標(biāo)識分別代表疾病和中藥復(fù)方，綠色和淺藍(lán)色分別代表疾病的基因靶標(biāo)和復(fù)方的有效成分，連線反映有效成分效應(yīng)的靶標(biāo)。

圖2 涼血消斑湯-化合物-靶點(diǎn)-銀屑病網(wǎng)絡(luò)

2.3 Metascape平臺分析結(jié)果

利用Metascape平臺對128個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行處理，得到本體集群富集結(jié)果，根據(jù)P值從小到大排列，取P值最小的前20項(xiàng)列舉如下(圖3)。涼血消斑湯在干預(yù)銀屑病的過程中主要涉及的生物學(xué)功能包括：對脂多糖的反應(yīng)、對毒物的反應(yīng)、凋亡信號通路、對無機(jī)物的反應(yīng)、對傷口的反應(yīng)、對肽的反應(yīng)、對胞外刺激的反應(yīng)、血管發(fā)育、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡的積極調(diào)控、對生長因子的反應(yīng)及活性氧代謝過程等，主要涉及的通路包括：白介素信號、癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路、AP1通路和ATF2通路等，與銀屑病密切相關(guān)的生物學(xué)功能與通路主要有凋亡信號通路、血管發(fā)育、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡的積極調(diào)控以及白介素、IL-17、PI3K-Akt等信號通路等。

圖3 本體集群富集條形圖

進(jìn)一步得到子集網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)圓形節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)富集項(xiàng)，不同顏色代表不同的子集，圓形大小與每個(gè)子集所含基因數(shù)成正比，κ相似性>0.3的富集項(xiàng)之間由邊相連，且連線的粗細(xì)與κ值成正比。通過“力導(dǎo)向”的布局模式使每個(gè)子集更加聚集。子集標(biāo)簽是從每個(gè)集群中選擇的一個(gè)富集項(xiàng)的名稱。用顏色的深淺來表達(dá)每個(gè)富集項(xiàng)的P值，顏色越深P值越小，見圖4。

不同顏色代表不同模塊，顏色的深淺代表不同P值圖4 本體集群富集網(wǎng)絡(luò)

將MCODE算法運(yùn)用到PPI網(wǎng)絡(luò)中，識別蛋白緊密相關(guān)的鄰域，每個(gè)顏色代表1個(gè)MCODE網(wǎng)絡(luò)，同一模塊的蛋白聯(lián)系更為緊密，共得到6個(gè)MCODE網(wǎng)絡(luò)(圖5)，MCODE1和MCODE2與艾滋病、乙型肝炎、神經(jīng)酰胺通路和癌癥通路相關(guān)，MCODE3與癌癥、內(nèi)分泌相關(guān)，MCODE4與細(xì)胞凋亡有關(guān)，MCODE5與肽基酪氨酸磷酸化調(diào)控、癌癥中的蛋白聚糖有關(guān)，MCODE6與肽配體結(jié)合受體、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路有關(guān)。每個(gè)模塊單獨(dú)羅列(圖6)。每個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行富集分析，P值排名前3位的富集項(xiàng)被保留(表1)。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)模塊組成

表1 富集項(xiàng)列表

2.4 分子對接結(jié)果

根據(jù)蛋白互作結(jié)果度值排名前10的靶點(diǎn)，再篩選出靶點(diǎn)數(shù)、對應(yīng)成分?jǐn)?shù)最多的成分和靶點(diǎn)，由此得到?jīng)鲅邷委熴y屑病可能的關(guān)鍵成分與靶標(biāo)：薯蕷皂苷元(Diosgenin)、己醛(Hexanal)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、槲皮素(Quercetin)、漢黃芩素(Wogonin)、黃芩素(Baicalein)、油酸(Oleic acid)、水楊酸(Salicylic acid)等9個(gè)成分以及AKT1、IL-6、JUN、PTGS2、VEGFA等5個(gè)靶標(biāo)。分別得到兩兩間的分子對接結(jié)合自由能(表2)，發(fā)現(xiàn)AKT1-Diosgenin、PTGS2-Diosgenin、PTGS2-Kaempferol、PTGS2-Luteolin、PTGS2-Quercetin的結(jié)合能均<-9 kcal/mol，而IL-6-Diosgenin、AKT1-Kaempferol、AKT1-Luteolin、AKT1-Quercetin、AKT1- Wogonin、AKT1-Baicalein的結(jié)合能均<-8 kcal/mol。最后構(gòu)建出AKT1-Diosgenin、PTGS2-Diosgenin、PTGS2-Kaempferol、PTGS2-Luteolin、PTGS2-Quercetin的分子對接模式(圖7)。

表2 化合物與蛋白靶標(biāo)的結(jié)合能 kcal/mol

其中Diosgenin與AKT1蛋白對接中，該化合物與周圍蛋白殘基主要是疏水作用。Baicalein與PTGE2蛋白的對接中，該化合物與周圍蛋白殘基也主要是疏水作用。Luteolin與PTGE2蛋白的對接中，該化合物與周圍蛋白殘基的Ile408、Gln406、Gln405氨基酸成氫鍵作用，與Leu283等成疏水作用。

A： AKT1與薯蕷皂苷元； B： PTGS2與黃芩素； C： PTGS2與薯蕷皂苷元； D： PTGS2與山柰酚； E： PTGS2與木犀草素； F： PTGS2與槲皮素圖7 涼血消斑湯核心成分與PTGS2和AKT1的分子對接模式

3 討論

在尋常型銀屑病中醫(yī)證素診斷量化研究中，血熱證占主導(dǎo)地位，且與血分息息相關(guān)[9-10]。銀屑病急性期表現(xiàn)具有明顯血熱證特征：皮疹色紅，發(fā)展迅速，鱗屑多，點(diǎn)狀出血明顯，伴瘙癢，常伴咽痛、口渴、便干、溲赤、易怒、舌紅絳、苔薄黃和脈弦滑等。急性發(fā)病期的銀屑病患者呈現(xiàn)進(jìn)行性發(fā)展的炎性丘疹、基底浸潤明顯及明顯的出血現(xiàn)象[11]。因此，清熱涼血法成為銀屑病重要的治療思路之一。本研究所選涼血消斑湯以清氣法為主，佐以涼血，在涼血的基礎(chǔ)上清熱透熱于外，清血熱以透外疹。但涼血消斑湯治療銀屑病的機(jī)制尚不清楚，阻礙了該方的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接結(jié)合的模式對其可能機(jī)制進(jìn)行初步探討與驗(yàn)證。

在該項(xiàng)研究中，通過PPI網(wǎng)絡(luò)獲得涼血消斑湯治療銀屑病的核心靶標(biāo)，如INS、AKT1、IL-6、VEGFA、MYC、EGFR、JUN、MAPK、CASP3、PTGS2等。其中大多數(shù)靶標(biāo)已被證實(shí)在銀屑病的各種病理改變中起重要作用，如IL-6、PTGS2參與異常的炎癥因子分泌與炎癥細(xì)胞誘導(dǎo)[12-14]，VEGF是目前所知最重要的生理和病理狀態(tài)下血管新生的調(diào)節(jié)因素[15-16]，AKT、MAPK、CASP3、JUN的細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡相關(guān)功能與成纖維細(xì)胞的過度增殖有關(guān)[17-18]。許多研究證實(shí)銀屑病的發(fā)生可能與胰島素抵抗有密切聯(lián)系[19-20]。在得到PPI核心靶標(biāo)的基礎(chǔ)上，結(jié)合調(diào)控靶點(diǎn)數(shù)和對應(yīng)化合物數(shù)目排序在前的有效成分和靶點(diǎn)，篩選出9個(gè)成分與6個(gè)靶標(biāo)，兩兩進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示，AKT1-薯蕷皂苷元、PTGS2-薯蕷皂苷元、PTGS2-山柰酚、PTGS2-木犀草素、PTGS2-槲皮素之間表現(xiàn)出理想的結(jié)合能力，涼血消斑湯可能是通過薯蕷皂苷元、山柰酚、木犀草素及槲皮素等有效成分，干預(yù)AKT1及PTGS2等靶標(biāo)，從而影響下游通路，繼而改善銀屑病。富集分析結(jié)果表明，銀屑病中的白細(xì)胞介素信號、AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路可能是該方治療銀屑病發(fā)揮主要功能的途徑。另外，涼血消斑湯還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與死亡、血管發(fā)育和細(xì)胞黏附等生物學(xué)功能來干預(yù)銀屑病。血管新生是銀屑病的重要病理環(huán)節(jié)，VEGF是目前所知最重要的生理和病理狀態(tài)下血管新生的調(diào)節(jié)因素，銀屑病患者皮損區(qū)VEGF水平較非皮損區(qū)及正常皮膚明顯增高[21-22]。銀屑病的發(fā)病與角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡情況密切相關(guān)，但是凋亡的促進(jìn)或抵抗在銀屑病中仍沒有統(tǒng)一結(jié)論[23]。另外，銀屑病患者的微脈管系統(tǒng)經(jīng)歷形態(tài)學(xué)改變后，淋巴細(xì)胞通過黏附分子黏附到內(nèi)皮細(xì)胞，穿過內(nèi)皮完成淋巴細(xì)胞遷移，細(xì)胞黏附的發(fā)生是皮損中炎性細(xì)胞聚集的重要因素[23]。

根據(jù)基因表達(dá)譜，在銀屑病患者皮膚中，PGE2信號通路和IL-23/Th17通路呈正相關(guān)。IL-23是Th17細(xì)胞產(chǎn)生和維持IL-17所必需的，其誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的PTGS2編碼COX2，產(chǎn)生PGE2，PGE2作用于這些細(xì)胞的PGE受體,從而放大其上游的IL-23信號，PGE2同時(shí)也可誘導(dǎo)多種炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[25-26]。結(jié)合通路富集與分子對接結(jié)果，將IL-17與PI3K-Akt作為涼血消斑湯可能發(fā)揮作用的兩條重要信號通路。銀屑病的發(fā)生及病情嚴(yán)重程度與IL-23/Th17/IL-17軸相關(guān)細(xì)胞因子的高表達(dá)有關(guān)[27-28]。自噬在銀屑病等自身免疫疾病中主要起四個(gè)作用，即去除胞內(nèi)病原體，淋巴細(xì)胞發(fā)育，促炎信號傳導(dǎo)和分泌途徑[29-30]。激活PI3K/AKT抑制自噬被認(rèn)為是治療IL-17A介導(dǎo)的銀屑病的一種治療方法[31]，而IL-23通過活化AKT/mTOR信號通路抑制細(xì)胞自噬活性[32]。涼血消斑湯可能通過炎癥和自噬兩個(gè)方面治療和緩解銀屑病。

在篩選出的涼血消斑湯重要有效成分中，薯蕷皂苷元已被證實(shí)抑制HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的生長，下調(diào)促炎因子，并抑制血管形成，減輕咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型[33]。山柰酚可減少銀屑病皮損中包括IL-17A在內(nèi)的主要促炎因子，并可降低銀屑病樣小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中的IL-17A+CD4+T細(xì)胞百分比[34]。木犀草素能減輕銀屑病皮膚病變，抑制巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在表皮的浸潤，并降低皮損中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-23和IL-17A等細(xì)胞因子的表達(dá)[35]。槲皮素可通過NF-κB通路在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠中發(fā)揮抗銀屑病作用，其潛在機(jī)制可能是抗氧化劑和抗炎狀態(tài)的改善以及對NF-κB信號傳導(dǎo)的抑制[36]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃芩素具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)功能，在甲型流感中能降低TNF-α、IL-6水平來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[37]。但關(guān)于這些單體與AKT1、PTGS2及IL-17通路、PI3K-Akt通路的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究較少，有待進(jìn)一步探索。

綜上，涼血消斑湯治療血熱型銀屑病可能是通過PTGS2、AKT1等靶標(biāo)對IL-23/Th17軸相關(guān)因子水平的調(diào)節(jié)及機(jī)體自噬水平的干擾來實(shí)現(xiàn)的。目前通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的研究，仍然無法確定涼血消斑湯對這些途徑的抑制或者激活作用?？梢酝ㄟ^部分活性成分的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷涼血消斑湯可能通過抑制或激活白細(xì)胞介素信號、AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路來達(dá)到治療作用。通路的具體調(diào)控過程有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。