腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)炎模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)中β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達及意義

徐大偉， 崔勝宇， 薛鵬飛， 朱新輝， 劉巍， 崔志明

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科， 江蘇 南通 226001)

腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)引起的疼痛是成年人下腰痛的常見原因，約占所有下腰痛的15%～45%[1]。腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)引起的下腰痛原因是早期因腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)重復(fù)性應(yīng)力和(或)累積的輕度外傷，逐漸演變成關(guān)節(jié)軟骨退變和關(guān)節(jié)炎癥，最終導(dǎo)致腰腿痛[2-3]。臨床研究表明，腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)軟骨和滑膜含有炎性細胞因子，并且細胞因子水平與腿部癥狀的程度相關(guān)[2，4]。實驗研究表明，腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的炎癥會增加背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)中炎癥細胞因子的表達，當(dāng)炎癥細胞因子與神經(jīng)根接觸時，神經(jīng)組織發(fā)生病理性變化，表現(xiàn)出行為缺陷[3]。β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-I(β-1,4-GalT-I)是關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)，參與疾病中炎癥反應(yīng)的發(fā)生和維持。當(dāng)機體缺失β-1,4-GalT-I時，白細胞膜上的糖蛋白缺少β4-N-乙酰乳糖胺結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致急、慢性炎癥反應(yīng)降低，浸潤到炎癥部位的中性粒細胞減少[5]。有研究報道β-1,4-GalT-I參與了中樞和周圍神經(jīng)損傷后的炎癥過程[6]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是周圍炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，并且在各種神經(jīng)疾病中也有合成和釋放，與神經(jīng)源性疼痛有關(guān)[7]。本研究旨在探討β-1,4-GalT-I和TNF-α在腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)炎(lumbar facet arthritis，LFA)模型大鼠DRG中的表達變化及意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料

雄性SD大鼠54只(南通大學(xué)實驗動物中心)，體重(220～275)g。弗氏完全佐劑、小鼠抗GAPDH和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體(美國Sigma公司)，纖維蛋白膠(上海萊士公司)，Von Frey纖維絲刺激針(美國Stoelting公司)，PVDF膜(美國Millipore公司)，山羊抗β-1,4-GalT-I單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗TNF-α單克隆抗體(英國Abcam公司)，兔抗p-ERK、p-JNK和p-P38單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，小鼠抗神經(jīng)元(NeuN)單克隆抗體(美國Chemicon公司)。

1.2 動物模型

54只雄性SD大鼠隨機分為對照組和實驗組。按造模后取材時間將實驗組分為12 h，1 d，3 d，5 d，7 d，14 d和28 d等7個小組(每小組6只)。制備大鼠LFA模型(n=42)：向大鼠腹腔內(nèi)注射復(fù)合麻醉劑(0.2 mL/100 g)，將大鼠俯臥位固定于實驗臺上。嚴(yán)格無菌操作下，首先在脊柱棘突正中線做一切口，沿左側(cè)的棘上韌帶切開筋膜約20 mm，再在顯微鏡下，切除附著于L5棘突的多裂肌，顯露左側(cè)L5-L6的關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)囊，在關(guān)節(jié)囊上做一個約3 mm的切口，向關(guān)節(jié)囊內(nèi)注入1.2 μL弗氏完全佐劑，關(guān)節(jié)囊上的切口立刻用纖維蛋白膠密封，以防止佐劑泄漏，然后關(guān)上筋膜和皮膚切口。對照組(n=12)：左側(cè)L5-L6的關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)囊切開后，立即用纖維蛋白膠密封，不做其他的操作即關(guān)閉切口。大鼠室溫飼養(yǎng)，自由飲食。于術(shù)后各相應(yīng)時間點，再次麻醉大鼠，取手術(shù)側(cè)節(jié)段對應(yīng)DRG[3]。

1.3 機械性縮足閾值測定

通過確定大鼠足底對Von Frey纖維絲刺激針的縮回反應(yīng)，測試大鼠對非有害機械刺激的敏感性。先將大鼠放置具有金屬絲網(wǎng)底部的塑料籠中適應(yīng)約15 min。將細絲以足夠的壓力施加到左側(cè)L5神經(jīng)支配的左足外側(cè)足底上，使其彎曲并保持6 s。如果大鼠在使用給定的細絲后沒有縮足，則以相同的方式測試下一檔較高的細絲。當(dāng)大鼠確定縮足時，則測試上一檔較低的細絲，間隔幾秒鐘刺激1次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡測定β-1,4-GalT-I、TNF-α和MAPK信號通路相關(guān)蛋白水平

取實驗組LFA大鼠(12 h，1 d，3 d，5 d，7 d，14 d和28 d)和對照組大鼠DRG組織，提取蛋白質(zhì)。蛋白樣品各50 μg上樣，進行SDS-PAGE，分離的蛋白用PVDF膜以350 mA轉(zhuǎn)膜2.5 h，所得PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后加入一抗：β-1,4-GalT-I、TNF-α、p-ERK、p-JNK、p-P38和GAPDH抗體(稀釋比均為1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，ECL發(fā)光、顯影、定影。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)檢測β-1,4-GalT-I/TNF-α與NeuN/GFAP的共定位

于手術(shù)后第5天，用復(fù)合麻醉劑腹腔麻醉大鼠后開胸，經(jīng)左心室向升主動脈插管后，先灌入洗滌液(生理鹽水)200～300 mL，再灌進固定液(4%多聚甲醛)300～500 mL。取左側(cè)L5DRG浸于固定液中，20%、30%蔗糖依次梯度脫水。包埋橫切，冰凍切片機連續(xù)切片，厚度6 μm。以封閉血清37℃孵育切片2 h，分別用封閉液稀釋的一抗：β-1,4-GalT-I、TNF-α抗體(1 ∶100)，NeuN抗體(1 ∶600)和GFAP抗體(1 ∶200)，4℃孵育過夜，PBS洗滌后，加入FITC和TRITC偶聯(lián)的二抗，4 ℃孵育2 h，封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 機械性縮足閾值測定結(jié)果

機械性縮足閾值測定結(jié)果表明，各時間點機械性縮足閾值總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.138，P<0.05)。與對照組相比，實驗組LFA大鼠在第3、5和7天的機械閾值明顯降低(均P<0.05，圖1)，第5天降低最為明顯。

n=6；*：P<0.05，與對照組相比圖1 機械性縮足閾值測定結(jié)果

2.2 LFA大鼠DRG中β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，各時間點β-1,4-GalT-I和TNF-α蛋白水平總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為143.802、166.235，均P<0.05)。實驗組第3、5和7天β-1,4-GalT-I和TNF-α蛋白水平均較對照組明顯升高(均P<0.05)，并在第5天達到峰值，然后逐漸恢復(fù)到正常水平(圖2)。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，β-1,4-GalT-I和TNF-α蛋白水平在實驗組LFA大鼠DRG中有一個暫時的上調(diào)，表明它們可能參與了LFA大鼠DRG的炎癥反應(yīng)過程。

n=3； *：P<0.05，與對照組相比圖2 LFA大鼠DRG中β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達

2.3 β-1,4-GalT-I和TNF-α在LFA大鼠DRG中分布情況

根據(jù)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，選取實驗組第5天和對照組的大鼠DRG切片，運用免疫熒光共定位進一步分析β-1,4-GalT-I和TNF-α在DRG中的表達和分布情況。β-1,4-GalT-I和TNF-α在神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中均有表達，而且β-1,4-GalT-I在LFA大鼠DRG神經(jīng)元細胞(35.60±5.69)%和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(43.60±5.81)%中表達較對照組神經(jīng)元細胞(8.69±1.49)%和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(10.36±1.95)%明顯增加(圖3，t值分別為7.924、9.394，均P<0.05)；TNF-α與β-1,4-GalT-I的結(jié)果相似，在LFA大鼠DRG神經(jīng)元細胞(45.63±7.36)%和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(42.96±5.96)%中表達較對照組神經(jīng)元細胞(14.96±2.39)%和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(18.36±3.59)%明顯增加(圖4，t值分別為6.865、6.124，均P<0.05)。

n=3； *：P<0.05，與對照組相比圖3 β-1,4-GalT-I在LFA大鼠DRG中的分布(×400)

n=3； *：P<0.05，與對照組相比圖4 TNF-α在LFA大鼠DRG中的分布(×400)

2.4 LFA大鼠DRG中β-1,4-GalT-I與TNF-α的共定位情況

在手術(shù)后第5天，當(dāng)DRG中β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達接近峰值時，對β-1,4-GalT-I和TNF-α進行了免疫熒光雙標(biāo)染色。結(jié)果顯示在LFA大鼠DRG中，β-1,4-GalT-I與TNF-α存在共定位(圖5)。

圖5 LFA大鼠DRG中β-1,4-GalT-I與TNF-α的共定位(×400)

2.5 LFA大鼠DRG中的MAPK信號通路活化情況

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，與對照組相比，LFA大鼠手術(shù)后第5天時DRG中的MAPK信號通路(ERK、JNK和P38)被顯著激活(圖6)。

圖6 LFA大鼠DRG中的MAPK信號通路活化

3 討論

在臨床研究中，許多腰椎管狹窄癥的中老年患者都有影像學(xué)證據(jù)顯示神經(jīng)根受壓，但沒有神經(jīng)根的疼痛癥狀。而且，許多接受保守治療的患者癥狀會明顯改善，但影像學(xué)神經(jīng)受壓并無變化[8]。這些現(xiàn)象表明，機械壓迫不是引起神經(jīng)根病的唯一因素。反復(fù)的應(yīng)力或積累性微小創(chuàng)傷可以導(dǎo)致腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)炎癥，引起關(guān)節(jié)積液和腫脹、滑膜增生、軟骨退變，并且產(chǎn)生和釋放TNF-α等炎癥因子，炎癥因子可以直接刺激關(guān)節(jié)囊感覺纖維或通過椎間孔刺激脊髓神經(jīng)和滲透到DRG而導(dǎo)致下腰痛[2-4]。本研究中機械性縮足閾值測定結(jié)果提示腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的炎癥可能會導(dǎo)致下肢疼痛。

本研究結(jié)果表明，LFA大鼠DRG中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達增加。TNF-α在促進神經(jīng)性疼痛的發(fā)展中起著不可或缺的作用，許多使用細胞因子抑制劑、基因敲除小鼠或直接應(yīng)用細胞因子觀察電生理活動和行為后遺癥的研究均支持TNF-α參與神經(jīng)性疼痛的發(fā)展[9-10]。Miyagi等[11]發(fā)現(xiàn)大鼠腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)損傷后DRG衛(wèi)星細胞中產(chǎn)生的TNF-α被軸突轉(zhuǎn)運至DRG神經(jīng)元和脊髓背角。Tachihara等[3]發(fā)現(xiàn)TNF-α在關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的滑膜細胞中產(chǎn)生，然后可能擴散并滲入硬膜外間隙，當(dāng)TNF-α與神經(jīng)根接觸時，會引起神經(jīng)損傷。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在LFA大鼠DRG中的β-1,4-GalT-I與TNF-α存在共定位。有報道，在周圍神經(jīng)施萬細胞中，TNF-α可以誘導(dǎo)β-1,4-GalT-I的產(chǎn)生[6]，且沉默β-1,4-GalT-I可以抑制TNF-α自分泌，而β-1,4-GalT-I的過表達可以促進TNF-α的自分泌[12]。在DRG炎癥過程中，β-1,4-GalT-I可能在TNF-α的表達中起重要作用，從而加劇神經(jīng)根痛。β-1,4-GalT-I和TNF-α可能相互促進，形成正反饋作用，并增強TNF-α在神經(jīng)痛中的作用。

本研究結(jié)果還顯示，LFA大鼠DRG中MAPK信號通路被激活。MAPK信號通路在調(diào)節(jié)炎癥(包括分泌TNF-α)中至關(guān)重要。先前的研究表明，在施萬細胞中，β-1,4-GalT-I可以通過激活MAPK信號通路和TNF受體1促進TNF-α分泌[12]。脂多糖刺激施萬細胞后通過MAPK信號通路可以調(diào)節(jié)β-1,4-GalT-I的表達[13]。MAPK信號通路參與TNF-α誘導(dǎo)的各種炎癥介質(zhì)的表達，包括各種細胞因子、趨化因子和黏附分子。研究表明，TNF-α可以激活MAPK[12]和核因子κB(NF-κB)[14]信號通路，從而誘導(dǎo)Snail家庭轉(zhuǎn)錄因子-2(SNAI2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、細胞間黏附分子-1和血管細胞黏附分子-1等基因和蛋白的表達；當(dāng)TNF-α與TNF受體1結(jié)合時，募集一些信號蛋白到受體的胞質(zhì)域，例如TNF受體1相關(guān)死亡域蛋白(TRADD)、受體相互作用蛋白1(RIP1)、Fas相關(guān)死亡域蛋白(FADD)和TNF受體相關(guān)因子2(TRAF2)[15]。這些信號蛋白的激活導(dǎo)致下游MAPK信號通路如JNK和P38的激活。

總之，大鼠LFA可以導(dǎo)致DRG中神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞β-1,4-GalT-I和TNF-α表達增加，可能與LFA引起的下肢神經(jīng)癥狀密切相關(guān)。研究結(jié)果為LFA引起下腰痛的發(fā)病機制提供了理論依據(jù)。