元七膠囊改善小鼠失眠的機(jī)制

隋得志 李 然 李 巖 趙 巖 管 桐 高麗莎 王斌勝

1 濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003； 2 煙臺(tái)市中醫(yī)院 山東 煙臺(tái) 264001；3 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 山東 濱州 256603

失眠主要是指睡眠持續(xù)時(shí)間不足和(或)睡眠質(zhì)量差，其特征為入睡困難和難以保持睡眠[1]。根據(jù)美國(guó)睡眠協(xié)會(huì)公布的數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)有5 000萬(wàn)到7 000萬(wàn)成年人患有睡眠障礙，每年與失眠相關(guān)造成的損失超過(guò)1 000億美元[2]。失眠不僅發(fā)病率高，長(zhǎng)期失眠還會(huì)導(dǎo)致患者對(duì)生活質(zhì)量的感知差，甚至導(dǎo)致抑郁癥、高血壓、2型糖尿病等[3-6]。更有Meta分析顯示，失眠與死亡增加有相關(guān)性[7]。

失眠在《內(nèi)經(jīng)》中稱為“目不瞑”、“不得眠”、“不得臥”，與陰陽(yáng)失衡、營(yíng)衛(wèi)失度、五臟不安等有關(guān)，治療以半夏秫米湯、朱砂安神丸、酸棗仁湯、炙甘草湯、黃連溫膽湯、安神定志丸等為主。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，失眠與γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的代謝異常有明顯的相關(guān)性[8]。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，起著廣泛的抑制調(diào)節(jié)作用，可引起深慢波睡眠量增加，巴比妥類(lèi)和苯二氮卓類(lèi)安眠藥都是基于GABA受體介導(dǎo)的抑制過(guò)程發(fā)揮作用[9-10]。

元七膠囊是王斌勝教授在中醫(yī)理論指導(dǎo)下經(jīng)過(guò)多年的臨床摸索研制而成，該方由三七、元胡兩味藥等比例組成，針對(duì)長(zhǎng)期的、不明原因的失眠可以有效地改善失眠患者的睡眠持續(xù)時(shí)間短、入睡困難、睡眠紊亂等，臨床療效確切。但元七膠囊改善失眠的具體作用機(jī)制尚不清楚，本文擬進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要藥品、試劑和設(shè)備 SPF級(jí)昆明小鼠150只，雄性，體質(zhì)量為18～22 g，購(gòu)買(mǎi)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(魯)20140007。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)原則和濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行。

元胡(批號(hào)為160701，北京同仁堂)、三七(批號(hào)為20160702，北京同仁堂)，4-氯-DL-苯基丙氨酸(批號(hào)為S27337，上海源葉生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液(R0010，索萊寶，北京)，小鼠GABA ELISA試劑盒(ml001894，Mlbio，上海)，兔GABRA1/GABA A受體alpha 1抗體(bs-1232R，Bioss，Beijing)，beta-actin抗體(60009-1-Ig，Proteintech)，羊HRP-結(jié)合Affinipure 抗兔IgG抗體(SA00001-2，Proteintech)。

全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美谷分子儀器，上海)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Clinx，上海)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模及分組 將150只昆明小鼠隨機(jī)分為5組，每組30只，分別為正常組、模型組、元七膠囊低劑量組、元七膠囊中劑量組和元七膠囊高劑量組。除正常組外，其他4組首先采用以下方法將正常昆明小鼠制備成失眠模型小鼠：將50 mg NaHCO3片劑溶于1 mL蒸餾水，配成 5% NaHCO3水溶液，與0.9%NaCl溶液混合，調(diào)整pH值至7～8，加入對(duì)氯苯丙氧酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)并在混勻儀上充分混勻，使PCPA的濃度為30 mg/mL。每日清晨，按照PCPA 300 mg/kg的劑量腹腔注射PCPA混懸液，連續(xù)注射2 d，正常組小鼠注射同等體積的生理鹽水。第一次注射PCPA混懸液36 h后，小鼠出現(xiàn)煩躁不安、飲水增加、進(jìn)食減少、晝夜節(jié)律消失等，提示造模成功。

造模成功后，正常組、模型組給予生理鹽水，元七膠囊低劑量組給予元七膠囊0.39 mg/g，元七膠囊中劑量組給予元七膠囊0.78 mg/g，元七膠囊高劑量組給予元七膠囊1.56 mg/g。每日清晨7∶00—8∶00灌胃，一天一次，連續(xù)5 d。

1.2.2 戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn) 第5天灌胃結(jié)束1 h后，各組隨機(jī)取6只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，給藥劑量為0.04 mg/g，觀察并記錄小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間。

取材

1.2.3 小鼠血清及腦組織提取 各組小鼠摘眼球采血，將血液收集到2 mL EP管中，離心管中，室溫靜置30 min后，12 000 rpm×30 min離心分離血清，-80℃凍存?zhèn)溆茫粚⑿∈筇幩篮?，置于冰面上取腦，同時(shí)迅速剝?nèi)⌒∈竽X組織，液氮快速冷凍，放入-80℃冰箱備用。

1.2.4 ELISA檢測(cè) 采用雙抗體夾心法檢測(cè)小鼠血清中GABA的含量。按照8、4、2、1、0.5、0 μmol/ L的濃度梯度向標(biāo)準(zhǔn)樣品孔加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，取10 μL待測(cè)樣品稀釋5倍后加入樣品孔，向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔中加入100 μL酶標(biāo)試劑后用封板膜將96孔板封好，37℃溫育60 min；用單蒸水稀釋20倍配成的濃縮洗滌液洗滌后向每個(gè)孔中加入50 μL顯色劑A溶液，再加入50 μL顯色劑B溶液，在37℃下避光顯色15 min后每孔加入50 μL終止液，反應(yīng)停止。加入終止液后15 min內(nèi)，空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度值(OD值)。

1.2.5 Western Blot實(shí)驗(yàn) 稱取一定量的腦組織樣品加入適量裂解液，勻漿后冰上裂解30 min，4℃離心，14 000 rpm×10 min，取上清，待用。按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，將25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用0.9%Nacl配制成0.5 mg/mL，定容至100 μL，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用酶標(biāo)儀在562 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。電泳在80 V 30 min和120 V 60 min的條件下進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜在275 mA 90 min條件下進(jìn)行。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。一抗(兔GABRA1/GABA A受體alpha 1抗體，1∶1000)4℃過(guò)夜孵育，TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min，室溫孵育二抗(1∶1000)2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min，用Alpha Imager 2200儀器采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 元七膠囊對(duì)失眠小鼠的睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間的影響 與模型組相比，元七膠囊處理各組小鼠的睡眠潛伏期均縮短，P<0.05；同時(shí)與模型組相比，元七膠囊處理各組小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間均延長(zhǎng)，P<0.01(圖1)。

圖1 A.元七膠囊可縮短失眠小鼠的睡眠潛伏期；圖1 B. 元七膠囊可延長(zhǎng)失眠小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間。A. 正常組；B. 模型組；C. 低劑量組；D. 中劑量組；E. 高劑量組。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 元七膠囊對(duì)失眠小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間的影響

2.2 元七膠囊對(duì)失眠小鼠血清內(nèi)的GABA含量的影響 使用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中GABA含量，結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中GABA的含量低于正常組，P<0.05；低、中劑量元七膠囊治療組小鼠血清中GABA含量較模型組均升高(低劑量組P<0.05，中劑量組P<0.01)；高劑量組小鼠血清中GABA含量也有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

A. 正常組；B. 模型組；C. 低劑量組；D. 中劑量組；E. 高劑量組。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 元七膠囊對(duì)失眠小鼠血清內(nèi)的GABA含量的影響

2.3 元七膠囊對(duì)失眠小鼠的GABA蛋白表達(dá)的影響 使用Western Blot檢測(cè)小鼠GABA蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠GABA蛋白表達(dá)下降；與模型組相比，元七膠囊中、高劑量治療組GABA蛋白表達(dá)明顯增加，這提示元七膠囊可能通過(guò)促進(jìn)GABA蛋白的表達(dá)來(lái)改善模型小鼠的失眠狀況(圖3)。

A. 正常組；B. 模型組；C. 低劑量組；D. 中劑量組；E. 高劑量組。圖3 元七膠囊的失眠小鼠的GABA蛋白表達(dá)的影響

3 討論

GABA為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥的作用，其含量升高可使失眠患者睡眠時(shí)間延長(zhǎng)，從而提高睡眠質(zhì)量[11]。而有關(guān)GABA神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的睡眠調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，GABA受體共有3個(gè)亞型，即GABAA、GABAB、GABAC受體，三種受體在受到刺激時(shí)具有相似的催眠作用[12]。GABAA受體是一個(gè)Cl-孔，具有巴比妥類(lèi)藥物、苯二氮卓類(lèi)藥物和神經(jīng)類(lèi)固醇的結(jié)合位點(diǎn)。而GABAC受體也由包含一個(gè)Cl-孔的三部分組成，對(duì)GABA的敏感性較GABAA受體和GABAB受體更高，且脫敏過(guò)程要慢得多。當(dāng)受到抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA刺激后，Cl-通道開(kāi)放頻率增加，導(dǎo)致大量的Cl-內(nèi)流，引起突觸后膜超極化后抑制神經(jīng)元放電，減少單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)的釋放而導(dǎo)致睡眠。

改善失眠藥物的評(píng)價(jià)通常以戊巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)為主要方法[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，元七膠囊可以縮短失眠小鼠的睡眠潛伏期并能延長(zhǎng)失眠小鼠的睡眠時(shí)間，證實(shí)了元七膠囊的療效。為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，本研究檢測(cè)小鼠血清中GABA的含量發(fā)現(xiàn)，低、中劑量組小鼠血清中GABA含量較模型組均升高，高劑量組小鼠血清中GABA含量也有升高，而Western Blot實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了元七膠囊治療后小鼠腦組織中GABA含量的升高。故本研究認(rèn)為，元七膠囊改善失眠的機(jī)制與調(diào)節(jié)GABA表達(dá)有關(guān)。

元七膠囊臨床療效確切，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示出其良好的效果，但是對(duì)其作用機(jī)制的研究尚不夠深入，后期將運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探究正常小鼠、失眠小鼠以及元七膠囊治療后小鼠蛋白表達(dá)的差異，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行深入分析，以探究元七膠囊的作用途徑。