基于譜效關(guān)系探討貓須草降尿酸物質(zhì)基礎(chǔ)*

陳佩瓊，侯雪茜，許晨，張慶，朱春勝，李方

1.鄭州市第九人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂引起的慢性代謝疾病。隨著含糖飲料、嘌呤及高蛋白類飲食的大量攝入，高尿酸血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。大量流行病學(xué)調(diào)查亦表明，高尿酸血癥不僅是慢性腎臟疾病和心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也與代謝紊亂，如糖尿病、肥胖和高血壓等密切相關(guān)[3-5]。因此，開展高尿酸血癥的預(yù)防和治療具有重要意義。目前，臨床中針對(duì)高尿酸血癥的治療，推薦一線用藥為黃嘌呤氧化酶抑制劑藥物如非布司他、別嘌醇，然而，上述藥物在臨床使用過程中常出現(xiàn)超敏、皮疹、斑丘疹等不良反應(yīng)，限制了其臨床使用[6-7]。因此，開發(fā)安全有效的降尿酸替代藥物具有重要的意義。

貓須草為唇形科植物Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.WuexH.W.Li的全草，我國(guó)傣族民族醫(yī)藥稱之為“雅糯秒”，已有悠久的使用歷史。貓須草性甘、淡，味苦、涼，具有清熱利濕，通淋排石之功效[8]。貓須草主要含黃酮類、酚酸類、二萜類、蒽醌類等成分[9-10]?，F(xiàn)代藥理研究表明，貓須草具有降尿酸、抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖和免疫調(diào)節(jié)作用，臨床主要用于治療高尿酸血癥、痛風(fēng)、尿路結(jié)石、慢性腎炎等疾病[11-13]。然而，貓須草發(fā)揮降尿酸的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未闡明，值得進(jìn)一步深入研究。

中藥譜效學(xué)由李戎等[14]在2002年提出，是在中醫(yī)藥理論研究基礎(chǔ)上，以中藥化學(xué)指紋圖譜為基礎(chǔ)，以藥效學(xué)為主要研究?jī)?nèi)容，應(yīng)用相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理方法，建立中藥指紋圖譜與中藥療效關(guān)系的一門學(xué)科。通過中藥材化學(xué)指紋圖譜信息與藥效信息數(shù)據(jù)處理技術(shù)，篩選出與藥效關(guān)系密切的化學(xué)成分峰，為闡明中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新的研究思路[15-16]。與其他研究方法相比，譜效關(guān)系學(xué)具有高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[17]。因此，本研究將結(jié)合譜效關(guān)系開展貓須草降尿酸物質(zhì)基礎(chǔ)研究，以期明晰貓須草發(fā)揮降尿酸藥物的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)亦為高尿酸血癥的新藥開發(fā)提供參考和借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器安捷倫1290型高效液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫科技有限公司)；Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 色譜柱(沃特世公司)；BS224S-型1/10萬電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；貝克曼CX4 全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)貝克曼公司。

1.2 試劑尿酸檢測(cè)試劑盒(中生北控生物公司，生產(chǎn)批號(hào)：181391)，造模劑D-果糖(英國(guó)Amresco公司，生產(chǎn)批號(hào)：18G3056117)，水為屈臣氏純凈水，甲酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20200310)為質(zhì)譜純，甲醇(賽默飛世爾科技有效公司，生產(chǎn)批號(hào)：204132)為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材10批貓須草樣品通過采集或購買獲得，經(jīng)鄭州市第九人民醫(yī)院李方副主任藥師鑒定為唇形科植物貓須草的干燥全草，具體信息詳見表1。

表1 10批不同產(chǎn)地貓須草信息表

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD雄性大鼠96只，體質(zhì)量(200±20)g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(豫)2015-0004。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件為一級(jí)環(huán)境。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的配備取貓須草樣品600 g，在高速粉碎機(jī)內(nèi)粉碎，首次按照110比例加入蒸餾水，回流提取40 min，收集濾液；第二次按照17比例加入蒸餾水，回流提取30 min，合并上述濾液，濃縮至600 mL(1 g·mL-1)。同時(shí)，取上述粗提取液過 0.22 μm微孔濾膜過濾于液相瓶中，備用。其余9組提取方法同上。

2.2 UPLC指紋圖譜的建立色譜條件：以 (體積分?jǐn)?shù))0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～2 min，5%B；2～5 min，5%→25%B；5～10 min，25%B；10～16 min，25%→40%B；16～22 min，40%B；22～26 min，40%→55%B；26～30 min，55%→5%B；進(jìn)樣體積為 1.0 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm。貓須草UPLC指紋圖譜、對(duì)照指紋圖譜見圖1和圖2，相對(duì)峰面積信息見表2。

2.3各產(chǎn)地貓須草降尿酸藥效實(shí)驗(yàn)雄性SD大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為12組，每組8只，分別為正常組、模型組及模型組+給藥組(10批不同產(chǎn)地貓須草水煎液)。正常組給予普通飲水，其余各組均給予體積分?jǐn)?shù)10%D-果糖飲水復(fù)制大鼠高尿酸血癥。各組均自由飲食、飲水，飼料和水每天更換1次，造模期間10批貓須草灌胃劑量折合原生藥量為5 g·kg-1。實(shí)驗(yàn)周期為2周，于第二周眼眶取血，取血前禁食12 h(不禁水)，3 000 r·min-1，離心 10 min，離心半徑13.5 cm，分離血清，檢測(cè)各組大鼠血清尿酸含量，結(jié)果見表3。

降尿酸藥效值=模型組血清尿酸值-各組血清尿酸值

圖1 10批貓須草的UPLC疊加指紋圖譜

圖2 貓須草藥材的對(duì)照指紋圖譜

表2 不同產(chǎn)地貓須草共有峰面積信息表

表3 各產(chǎn)地貓須草降尿酸藥效分析表

2.4 貓須草降尿酸譜效構(gòu)建為闡明貓須草發(fā)揮降尿酸的活性成分，明晰貓須草指紋圖譜中各共有峰與降尿酸藥效之間的密切程度，本研究采用偏最小二乘法開展貓須草降尿酸的譜效構(gòu)建，篩選出與降尿酸藥效關(guān)系密切的共有峰。本實(shí)驗(yàn)采用SIMCA-P軟件進(jìn)行偏最小二乘法數(shù)據(jù)分析，首先建立一個(gè)自變量X對(duì)輸出因變量Y影響的預(yù)測(cè)模型，R2Y和Q2接近1.0說明建模完美[18]。結(jié)果如圖3所示，該模型93.7% Y變量的變化擁有87.1%的預(yù)測(cè)能力，說明該模型建立良好。

VIP反映的是自變量在解釋因變量作用的重要程度，其中VIP>1時(shí)說明自變量在解釋因變量時(shí)具有顯著差異[17]。偏最小二乘法數(shù)據(jù)分析結(jié)果見圖4和表4，其中共有峰5、9、3、8、2、7、6、1、10對(duì)降尿酸藥效具有顯著影響，而共有峰13、14、11、12、4、6對(duì)降尿酸藥效影響不顯著，初步表明貓須草降尿酸藥效可能是共有峰5、9、3、8、2、7、6、1、10協(xié)同發(fā)揮。

圖3 貓須草降尿酸模型擬合圖

圖4 各共有峰與降尿酸藥效的VIP系數(shù)

表4 偏最小二乘法分析結(jié)果

2.5 貓須草共有峰指認(rèn)采用電噴霧離子源(ESI)，離子掃描方式是正、負(fù)離子全掃描，正離子模式毛細(xì)管電壓4.5 kV，負(fù)離子模式毛細(xì)管電壓3.5 kV；氮?dú)庾鳛楦稍餁夂挽F化氣，霧化溫度為 200 ℃，霧化氣壓力0.8 bar，干燥氣流速率 6.0 L·min-1；質(zhì)量掃描范圍為(m/z)100～1 000。其余條件同2.2項(xiàng)下，獲得貓須草水煎液在正(A)、負(fù)離子(B)模式下的離子圖，結(jié)果見圖5。通過比對(duì)各共有峰的碎片離子信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)2.4項(xiàng)下篩選出的貓須草共有峰VIP值>1的特征峰進(jìn)行初步指認(rèn)，結(jié)果見表5。

注：A：正離子模式；B：負(fù)離子模式

表5 UPLC-MS貓須草特征峰指認(rèn)表

3 討論

近年來，我國(guó)學(xué)者對(duì)貓須草進(jìn)行大量研究，陳旭潔等[25]比較了貓須草儲(chǔ)存2年前后的化學(xué)成分和抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)常規(guī)室溫倉儲(chǔ)2年內(nèi)貓須草中多酚類及黃酮類化合物無顯著變化，且抗氧化能力也未顯著降低。陸應(yīng)彩等[26]采用紫外分光光度法對(duì)不同產(chǎn)地貓須草進(jìn)行了總黃酮含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品中總黃酮含量有差異。藍(lán)倫禮等[27]采用HPLC法對(duì)15批不同產(chǎn)地的貓須草進(jìn)行了指紋圖譜及含量測(cè)定研究，發(fā)現(xiàn)云南西雙版納產(chǎn)的質(zhì)量最佳。本研究采用體積分?jǐn)?shù)10% D-果糖飲水復(fù)制大鼠高尿酸血癥模型，同時(shí)開展了不同產(chǎn)地貓須草降尿酸藥效實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)云南西雙版納地區(qū)采收時(shí)間8月份的貓須草降尿酸藥效最佳，而河北安國(guó)的貓須草藥效最弱。這可能是產(chǎn)地氣候、海拔、光照、降雨量等因素影響貓須草有效成分的積累。

中藥指紋圖譜信息與藥效信息需要通過一定的數(shù)據(jù)處理才能實(shí)現(xiàn)二者之間的聯(lián)系，進(jìn)而構(gòu)建真正意義上的譜效關(guān)系。因此，選擇適合的數(shù)據(jù)處理方法或者數(shù)學(xué)模型對(duì)譜效的有效構(gòu)建至關(guān)重要。目前譜效數(shù)據(jù)還沒有統(tǒng)一的處理方法，文獻(xiàn)報(bào)道采用的數(shù)據(jù)處理方法主要有相關(guān)分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、多元回歸分析、偏最小二乘法分析等[28]，其中偏最小二乘法是集相關(guān)分析、主成分分析、多元線性回歸為一體，且具有計(jì)算量小、預(yù)測(cè)精度高、無須剔除樣本、易于定性解釋等優(yōu)點(diǎn)[29-31]，因此，本研究采用偏最小二乘法數(shù)據(jù)處理方法開展貓須草降尿酸的譜效構(gòu)建。結(jié)果顯示，貓須草UPLC指紋圖譜中共有峰1、2、3、5、7、8、9、10在解釋貓須草降尿酸藥效時(shí)具有顯著差異(VIP>1)，表明上述成分可能是貓須草發(fā)揮藥效的等效組分群。

同時(shí)，本研究還結(jié)合UPLC-MS對(duì)上述峰進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)貓須草發(fā)揮降尿酸的化學(xué)成分可能與咖啡酸、香草醛、迷迭香酸等成分有關(guān)。孫影[32]在開展咖啡酸和迷迭香酸體外降尿酸活性篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)，二者對(duì)黃嘌呤氧化酶均具有一定的抑制作用，且咖啡酸的抑制作用最強(qiáng)，其IC 50為2.82 g·L-1，進(jìn)一步采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，咖啡酸具有顯著的降尿酸藥效，上述研究亦初步佐證了譜效構(gòu)建篩選結(jié)果的合理性。而峰7、8、9結(jié)構(gòu)還未明確，后期將采用高速逆流色譜技術(shù)對(duì)上述3個(gè)成分進(jìn)行分離和富集，通過波譜數(shù)據(jù)分析以明確各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)上述成分進(jìn)行降尿酸藥效驗(yàn)證，從而明晰貓須草發(fā)揮降尿酸藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為貓須草的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，也為降尿酸新藥的開發(fā)提供依據(jù)。