基于病證結(jié)合探討虎杖對(duì)濕熱型高脂血癥模型大鼠的作用*

段紅福，連紅兵，張文峰

1.鄭州市中醫(yī)院，河南 鄭州 450007； 2.云南省第二人民醫(yī)院，云南 昆明 650021； 3.仲景宛西制藥股份有限公司，河南 鄭州 450000

高脂血癥是動(dòng)脈硬化最重要的危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅著人們的健康。符合中醫(yī)特點(diǎn)的動(dòng)物模型是高脂血癥證型和藥效研究的基礎(chǔ)，但現(xiàn)有高脂血癥模型[1-2]大多采用高脂飼料喂養(yǎng)的單一造模方法，不能體現(xiàn)中醫(yī)證候因素[3]，不符合中醫(yī)認(rèn)知疾病和藥物的特點(diǎn)。由于種族的差異，中國患者服用的他汀類藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率明顯高于歐洲人群[4]。而病證結(jié)合模型體現(xiàn)了中醫(yī)證候因素已成為中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型發(fā)展的新方向[5]和必然趨勢[6]。濕熱證型高脂血癥在臨床較常見[7-8]。研究表明[9-10]，濕熱體質(zhì)是動(dòng)脈硬化和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的重要危險(xiǎn)因素和發(fā)病基礎(chǔ)，有關(guān)濕熱型高脂血癥的研究未見報(bào)道。本研究采用復(fù)合因素的造模方法，以濕熱證的病因病機(jī)為依據(jù)，建立濕熱型病證結(jié)合高脂血癥大鼠模型，觀察虎杖對(duì)此模型的作用，以期為降脂中藥的藥效及安全性評(píng)價(jià)和高脂血癥的中醫(yī)模型研究提供思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物健康清潔級(jí)SD大鼠，雄性，70只，5周齡，體質(zhì)量(150±20) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：1140070014054。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%。

1.2 藥物及試劑虎杖(鄭州市中醫(yī)院，批號(hào)：180303)；干姜(鄭州市中醫(yī)院，批號(hào)：20190401)；血脂康膠囊(北京北大維信生物科技有限公司，批號(hào)：20190517)；辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)：T010966)。高脂飼料(83.3%基礎(chǔ)飼料，1%膽固醇，0.5%膽酸鈉，10%豬油，0.2%甲基硫氧嘧啶，5%蔗糖)(北京科澳協(xié)力飼料有限公司，批號(hào)：201809190)；白酒(紅星二鍋頭，56度)?？偰懝檀?total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6 IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA檢測試劑盒(上海研盟生物科技有限公司，批號(hào)分別為：19021656、19012358、19023201、19011803、190243、190326)；三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding casstte transporter，ABCA1)、卵磷脂膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterol acyltransferase，LCAT)、羊抗人載脂蛋白A1(goat anti-human apolipoprotein A-I polyclonal，ApoAI)試劑盒(武漢博士德生物工程公司，批號(hào)分別為：BA1541-2、BA3103-2、BM5624)。

1.3 儀器DHP-9012型電熱恒溫培養(yǎng)箱(武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司)；TG-16m型高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司)；RaytoRT-6100型酶標(biāo)儀(美國雷杜公司)；Tianshi988型洗板機(jī)(北京拓普分析儀器有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備將虎杖飲片浸泡30 min后，加10倍量水，煎煮40 min，濾取煎液；繼續(xù)加8倍量水，煎煮30 min，合并兩次水煎液，濃縮至每1 mL藥液分別含原藥材1.5 g、0.75 g，分別作為虎杖高劑量和低劑量組，4 ℃保存?zhèn)溆?；干姜制備方法同虎杖，最后濃縮水煎液使每1 mL藥液含原藥材1.0 g，作為反證治療組藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、造模及干預(yù)方法將SD大鼠以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。除正常組外，其余組飼喂高脂飼料6周，觀察其行為體征。6周后行眼眶靜脈取血檢測血脂指標(biāo)，并稱其體質(zhì)量，選擇與正常組(8只)對(duì)比血脂指標(biāo)具有顯著差異的大鼠共56只納入實(shí)驗(yàn)[11]，其中不合格者6只。將挑選的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(高脂飲食+濕熱環(huán)境組)、模型組(高脂飲食+濕熱環(huán)境+白酒組)、虎杖(高、低劑量)(15、7.5 g·kg-1)組、反證治療(干姜，10 g·kg-1)組、血脂康(0.3 g·kg-1)組、辛伐他汀(干姜，7.5 mg·kg-1)組，每組8只。從第7周，除正常組外，其余各組繼續(xù)飼以高脂飼料，且每天置于人工氣候箱內(nèi)5 h(上午10～12時(shí)，下午14～17時(shí))，氣候箱溫度設(shè)為 33 ℃，濕度為90 %，高脂飼料及人工氣候箱均干預(yù)至第14周[12]。除正常組和模型對(duì)照組給予同等劑量生理鹽水外，其余各組每天下午灌胃白酒 20 mL·kg-1。自第9周開始正常組、模型組和模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，其余各組給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行灌胃。

2.3 標(biāo)本的采集于第14周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組大鼠禁食12 h，稱其體質(zhì)量后水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，室溫條件靜置 30 min，4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，-80 ℃保存。并摘取肝、腎、脾、肺、心臟器組織，稱其質(zhì)量。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 一般體征每天觀察大鼠的活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)顏色、進(jìn)食飲水狀況、大小便顏色質(zhì)地等。

2.4.2 臟器指數(shù)大鼠的體質(zhì)量及肝、腎、脾、肺、心的臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

2.4.3 血脂指標(biāo)測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。

2.4.4 血清生化指標(biāo)測定血清中炎癥因子(IL-6、TNF-α)及ABCA1、LCAT、ApoAI的水平。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況在前6周高脂血癥模型篩選過程中，正常組大鼠精神及活動(dòng)狀態(tài)良好，比較活躍，毛發(fā)順滑有光澤、進(jìn)食、二便無異常；其余組大鼠前期精神狀態(tài)無異常，體型前兩周與正常組相比無差異，最后兩周明顯肥胖，進(jìn)食逐漸減少，精神狀態(tài)尚可，活動(dòng)減少，大便變軟不成形，味臭。分組后在濕熱環(huán)境(人工氣候箱)下的各組大鼠普遍出現(xiàn)毛發(fā)發(fā)黃凌亂、大便溏泄、小便發(fā)黃、精神萎靡、活動(dòng)減少；灌服白酒后出現(xiàn)大便溏泄加重，甚至出現(xiàn)肛周污穢；反證治療組大便粘滯或干結(jié)。與模型組相比，虎杖組、血脂康組、辛伐他汀組大鼠精神狀態(tài)均有所改善，活動(dòng)增加。

3.2 對(duì)大鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組和模型對(duì)照組體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)均顯著增加(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，模型組肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)明顯增加(P<0.05)；虎杖高、低劑量組體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，虎杖高、低劑量組體質(zhì)量、肝質(zhì)量顯著降低(P<0.01)，肝臟指數(shù)明顯降低(P<0.05)，血脂康組、辛伐他汀組體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)明顯降低(P<0.05)?；⒄雀邉┝拷M與血脂康組對(duì)體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)的降低作用相當(dāng)，而虎杖低劑量組的作用優(yōu)于前兩者，辛伐他汀組優(yōu)于虎杖低劑量組。見表1。

表1 對(duì)大鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響

3.3 對(duì)大鼠腎、脾、肺、心臟器指數(shù)的影響經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組大鼠腎、脾、肺、心的臟器指數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 對(duì)大鼠腎、脾、肺、心臟器指數(shù)的影響

3.4 對(duì)大鼠血脂指標(biāo)的影響與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組和模型組TC、TG、LDL-C水平均顯著升高(P<0.01)，HDL-C水平顯著降低(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，模型組TG、LDL-C水平均顯著升高(P<0.01)。與模型對(duì)照組和模型組相比，虎杖高、低劑量組TC、TG、LDL-C水平均顯著降低(P<0.01)，HDL-C水平無顯著差異，但有升高的趨勢(P>0.05)；血脂康組、辛伐他汀組TC、TG、LDL-C水平均顯著降低(P<0.01)，HDL-C水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，反證治療組TC水平升高(P<0.05)，LDL-C水平顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 對(duì)大鼠血脂指標(biāo)的影響

3.5 對(duì)大鼠血清炎性指標(biāo)的影響與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組和模型組IL-6、TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)；虎杖高、低劑量組和血脂康組、辛伐他汀組IL-6、TNF-α水平均顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，虎杖高、低劑量組和血脂康組、辛伐他汀組IL-6、TNF-α水平均顯著降低(P<0.01)；反證治療組血清IL-6、TNF-α 水平均無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 對(duì)大鼠血清炎性指標(biāo)的影響

3.6 對(duì)大鼠血清ABCA1、LCAT、aPoA-I的影響與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組和模型組血清ABCA1、LCAT、aPoA-I均顯著降低(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，虎杖高、低劑量組和血脂康組血清ABCA1、LCAT均明顯升高(P<0.05)，虎杖高劑量組血清aPoA-I有升高的趨勢(P>0.05)，虎杖低劑量組和血脂康組血清aPoA-I明顯升高(P<0.05)，辛伐他汀組ABCA1、LCAT、aPoA-I均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，虎杖高、低劑量組和血脂康組血清ABCA1、LCAT均明顯升高(P<0.05)；虎杖低劑量組和血脂康組aPoA-I明顯升高(P<0.05)；辛伐他汀組ABCA1、LCAT、aPoA-I顯著升高(P<0.01)；反證治療組血清 ABCA1、LCAT、aPoA-I均無顯著差異(P>0.05)。見表5。

表5 對(duì)大鼠血清ABCA1/LCAT/aPoA-I的影響

4 討論

《溫?zé)峤?jīng)緯·薛生白濕熱病》：“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”；《溫?zé)峤?jīng)緯·葉香巖外感溫?zé)帷罚骸坝钟芯瓶?，里濕素盛，外邪入里，與之相搏。在陽旺之軀，胃濕恒多；在陰盛之體，脾濕亦不少，然其化熱則一”。這兩段論述指出，濕熱證“內(nèi)濕”與“外濕”“相搏”合而為患，脾虛導(dǎo)致脾失健運(yùn)(內(nèi)濕)為本，外邪(外濕)入里為標(biāo)。

現(xiàn)有單一高脂飼料喂養(yǎng)的造模方法[1，14-16]只體現(xiàn)了脾虛痰濕[17]的證候特征[11]，不能體現(xiàn)濕熱的“證候”因素，違背了“有是證用是藥”的思想，忽略了中醫(yī)對(duì)疾病本質(zhì)的認(rèn)識(shí)——“證”的動(dòng)態(tài)性和階段性[6]。有關(guān)濕熱證動(dòng)物模型多見于溫病濕熱證的研究[18-24]，但其造模時(shí)間短，如濕熱環(huán)境和灌服白酒多為5～10天[22，24]，其屬于急性證候模型，且使用的致病微生物及細(xì)菌內(nèi)毒從病因?qū)W的角度看多屬于外感病因，從病因、病程[3]或者發(fā)病特征的角度這些方法與濕熱型高脂血癥不相符。

本研究結(jié)合“內(nèi)濕”與“外濕”的致病因素及中醫(yī)“肥甘飲食(或加酒)[18]”傷脾致虛的觀點(diǎn)，加入白酒作為造模因素，使其自身的濕熱的偏性作用于造模大鼠，使模型更加貼合濕熱證的病機(jī)[18]和發(fā)病規(guī)律[19]。濕熱證“外濕”的造模方法大多采用人工氣候箱模擬濕熱環(huán)境[25]，便于溫濕度的控制。故本研究選擇了“內(nèi)濕(高脂飼料+白酒)+外濕(濕熱環(huán)境)”的造模方法，將高脂血癥疾病和濕熱證的證候結(jié)合起來。針對(duì)濕熱證纏綿的特征，本研究延長了造模時(shí)間，如濕熱環(huán)境和灌服白酒的造模時(shí)間延長至8周，使之更貼合濕熱證的發(fā)病特點(diǎn)。總之，本研究選擇高脂血癥疾病模型和濕熱證的證候模型并改良之建立濕熱型高脂血癥病證結(jié)合模型。

本研究設(shè)置了辛伐他汀和血脂康兩個(gè)陽性對(duì)照組，以進(jìn)一步對(duì)比療效和評(píng)價(jià)模型；設(shè)置了模型對(duì)照組(高脂飼料+人工濕熱環(huán)境)，以考察白酒對(duì)模型的影響。本研究顯示，與模型對(duì)照組相比，模型組TG、LDL-C水平均顯著升高，模型組大鼠灌服白酒后出現(xiàn)大便溏泄加重，甚至有肛周污穢的濕熱癥狀，說明白酒加重了濕熱體征和血脂紊亂，但對(duì)血脂的其他指標(biāo)沒有明顯影響。本研究參照他人的觀點(diǎn)[6]，證明模型是否成功僅僅“以方測證”是不夠的，還需要用非適應(yīng)證的藥物治療無效才可以，為此設(shè)置了反證治療組，以溫?zé)嵝再|(zhì)的干姜進(jìn)行反證治療。結(jié)果顯示，反證治療組給予干姜后大便出現(xiàn)黏滯或干結(jié)等不調(diào)的表現(xiàn)，且TC、LDL-C進(jìn)一步升高，說明在模型組的基礎(chǔ)上給予干姜會(huì)進(jìn)一步加重脂質(zhì)代謝紊亂及濕熱體征，反證治療組的加入在一定程度上佐證了模型的成功。通過對(duì)比模型對(duì)照組、模型組、反證治療組的造模因素發(fā)現(xiàn)，其是一個(gè)濕熱因素逐漸加重的過程，便于對(duì)比成模因素對(duì)濕熱模型的影響。但由于造模因素的增加也會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性差、操作難度大的問題，另外反證治療組的作用也僅是對(duì)模型的佐證，而評(píng)價(jià)模型的成功是多角度的，這些問題均需進(jìn)一步研究。

虎杖為清熱利濕藥，對(duì)濕熱證有廣泛的作用，結(jié)果表明造模后大鼠出現(xiàn)肥胖、進(jìn)食減少、精神萎靡大便溏泄、甚至肛周污穢等典型的脾虛、濕熱證的體征，說明“高脂飼料+白酒+人工濕熱環(huán)境”可初步造成濕熱證模型，且出現(xiàn)了血脂及肝質(zhì)量、肝臟指數(shù)升高，說明濕熱型高脂血癥大鼠模型初步制備成功。虎杖高、低劑量組及血脂康組大鼠的精神狀態(tài)及大便溏泄均有所改善；其中虎杖高、低劑量組小便發(fā)黃改善較明顯；血脂方面，虎杖高、低劑量組對(duì)升高的TC、TG、LDL-C的升高均有顯著的降低作用，其作用強(qiáng)度與血脂康相當(dāng)，但弱于辛伐他汀，說明虎杖對(duì)濕熱證高脂血癥大鼠模型的體征和血脂紊亂均有改善。

炎性學(xué)說與血管內(nèi)皮損傷學(xué)說均是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病機(jī)制的重要的學(xué)說，炎性學(xué)說認(rèn)為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是一種慢性炎癥的過程，伴隨著脂質(zhì)沉積和血管內(nèi)皮功能紊亂及損傷，經(jīng)過一系列的趨化誘導(dǎo)[26]，單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞，從而釋放一系列的炎癥因子如IL-6、TNF-α等，引起血管壁的炎癥反應(yīng)。本研究顯示，與模型對(duì)照組相比，模型組IL-6、TNF-α水平升高，炎癥因子和炎癥反應(yīng)會(huì)增加脂質(zhì)斑塊的不穩(wěn)定性和破裂的風(fēng)險(xiǎn)[27]，說明炎癥反應(yīng)隨著濕熱的加重而加重。虎杖高、低劑量及血脂康對(duì)IL-6、TNF-α有明顯的降低作用，且低劑量組作用更好，與血脂康和辛伐他汀作用強(qiáng)度相當(dāng)，說明虎杖對(duì)高脂血癥模型的作用可能是通過抑制炎癥因子的水平，從而提高了脂質(zhì)斑塊的穩(wěn)定性，延緩動(dòng)脈硬化和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的進(jìn)展。

膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)[28]越來越受到重視，RCT是由HDL-C介導(dǎo)的將外周膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，并在肝臟內(nèi)進(jìn)行代謝的過程，從而降低了肝外組織血管壁的膽固醇水平，對(duì)延緩血管壁脂質(zhì)沉積及動(dòng)脈硬化有積極作用。RCT的主要途徑為ABCA1/LCAT/aPoA-I通路[29]，其功能異常在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[30]。ABCA1、LCAT、ApoAI的低表達(dá)會(huì)阻礙游離膽固醇轉(zhuǎn)化為失去極性的膽固醇酯，導(dǎo)致HDL-C介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)效率低下，造成膽固醇在肝外的蓄積[12]。結(jié)果表明，虎杖高、低劑量及血脂康對(duì)造模引起的血清ABCA1、LCAT、ApoAI低表達(dá)有上調(diào)作用，且對(duì)ABCA1的作用與血脂康組相當(dāng)，但弱于辛伐他汀組。這可能是其治療濕熱型高脂血癥的作用機(jī)制之一。

對(duì)中藥藥性和功效的認(rèn)知來源于疾病(證候)狀態(tài)下機(jī)體對(duì)藥物的反應(yīng)[13]，故只有在疾病(證候)狀態(tài)下的療效或安全性評(píng)價(jià)才是準(zhǔn)確的。本研究的高脂血癥大鼠模型結(jié)合了高脂血癥疾病模型和中醫(yī)濕熱證證候模型，體現(xiàn)了病證結(jié)合的思想，突出了方-證的適配性[32]，并觀察了虎杖對(duì)此模型的作用，望能為濕熱型高脂血癥模型的研究和降脂中藥的療效與安全性評(píng)價(jià)做出一些有益的探索。