miR-133b、miR-495在骨肉瘤組織中表達(dá)的臨床意義及相關(guān)性分析

李名武，王勤志，孫法瑞

(鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，湖北 黃石 435000)

骨肉瘤是骨骼系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，惡性程度高，早期可發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。相關(guān)報(bào)道顯示轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)骨肉瘤患者5年總體生存率不到20%[1]。微小RNA(micro RNA，miRNA)在惡性腫瘤中發(fā)揮致癌基因或抑癌基因作用[2]。miR-133b是一種抑癌基因，通過調(diào)節(jié)抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)基因或蛋白表達(dá)抑制腫瘤進(jìn)展[3]。miR-495可調(diào)控免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、骨細(xì)胞分化、骨代謝等，在多種惡性腫瘤中亦發(fā)揮抑癌基因作用[4]。本研究擬通過檢測(cè)骨肉瘤患者瘤組織中miR-133b、miR-495表達(dá)，探討其與骨肉瘤病理特征和預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床診治、病情和預(yù)后判斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年8月～2019年8月黃石市中心醫(yī)院腫瘤外科收治的79例行手術(shù)治療的骨肉瘤患者為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①典型骨骼、關(guān)節(jié)疼痛，局部有腫塊，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，經(jīng)術(shù)后病理診斷為骨肉瘤；②行手術(shù)治療，術(shù)前未接受放化療、生物治療；③骨肉瘤組織標(biāo)本保存完好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤；②惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移者；③風(fēng)濕或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨外傷、骨結(jié)核等其他骨骼疾??；④隨訪失聯(lián)者。男49例，女30例，年齡17～39歲，平均(24.56±5.19)歲；腫瘤部位：股骨遠(yuǎn)端26例，脛骨近端21例，肱骨近端19例，其他13例。腫瘤直徑2～7 cm，平均(4.62±2.35)cm；Enneking分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期30例，Ⅲ期28例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移19例。以手術(shù)切除的骨肉瘤組織為骨肉瘤組，以距離瘤組織>5 cm的組織為對(duì)照組。本研究通過書面申請(qǐng)并獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 取骨肉瘤組及對(duì)照組組織液氮冷凍標(biāo)本，先置于2～8℃冰箱使之溶解，后置于室溫下使之全溶，組織研磨儀研磨后離心1 min，加入裂解液充分混勻，采用TRIzol試劑(美國Ambio 公司)提取總RNA，采用CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR 儀(美國Bio-Rad公司)M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre 公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系共18 μL，包括RNA 模板5 μL，1 μL OligodT，反轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μL)1 μL，RNA酶抑制劑(20 U/μL)0.5 μL，dNTPs(100 mmol/L)1 μL，buffer液1.5 μL，DEPC水5 μL，U6及miRNA引物3 μL。引物合成及序列測(cè)定由上海基康公司完成，序列如下，miR-133b上游引物：5′-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3′，下游引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′，miR-495上游引物：5′-TCCGATTCTTCACGTGGTAC-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95℃ 10 s，65℃ 20 s;75℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)，共做3 次平行試驗(yàn)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-133b、miR-495表達(dá)水平。

1.3 隨訪 所有患者均定期接受電話隨訪和門診復(fù)查，電話隨訪每3個(gè)月1次，統(tǒng)計(jì)患者隨訪期間生存情況，所有患者隨訪至2020年8月。門診復(fù)查內(nèi)容包括病變部位X線片、骨掃描、淋巴結(jié)B超等，評(píng)估有無復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組、對(duì)照組miR-133b、miR-495表達(dá)比較 骨肉瘤組中miR-133b、miR-495表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 骨肉瘤組、對(duì)照組miR-133b、miR-495表達(dá)

2.2 不同臨床病理參數(shù)骨肉瘤患者miR-133b、miR-495表達(dá)比較 Enneking分期 Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者骨肉瘤組織中miR-133b、miR-495表達(dá)低于Enneking分期Ⅰ期、Ⅱ期，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，Enneking分期Ⅰ期、Ⅱ期之間miR-133b、miR-495表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑之間miR-133b、miR-495表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同臨床病理參數(shù)骨肉瘤患者miR-133b、miR-495表達(dá)

2.3 不同miR-133b、miR-495表達(dá)骨肉瘤患者生存差異 所有患者隨訪截止2020年8月，中位隨訪15(12～36)個(gè)月，隨訪期間死亡36例。根據(jù)骨肉瘤組miR-133b、miR-495表達(dá)均數(shù)將患者分為高miR-133b表達(dá)組(miR-133b≥0.33，26例)、低miR-133b表達(dá)組(miR-133b<0.33，53例)、高miR-495表達(dá)組(miR-495≥0.43，29例)、低miR-495表達(dá)組(miR-495<0.43，50例)。制作生存曲線(圖1)，經(jīng)Log-Rank檢驗(yàn)低miR-133b表達(dá)組骨肉瘤患者生存率為49.06%(26/53)，低于高miR-133b表達(dá)組的65.38%(17/26)(Log-Rankχ2=5.900，P=0.015)，低miR-495表達(dá)組骨肉瘤患者生存率為44.00%(22/50)，低于高miR-495表達(dá)組的72.41%(21/29)(Log-Rankχ2=5.342，P=0.021)。

圖1 不同miR-133b、miR-495表達(dá)骨肉瘤患者生存曲線

2.4 影響骨肉瘤患者預(yù)后的Cox回歸分析 以骨肉瘤患者隨訪期間是否死亡為因變量，納入年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、Enneking分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、miR-133b、miR-495為自變量。單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析顯示腫瘤直徑、Enneking分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、miR-133b、miR-495與骨肉瘤患者死亡有關(guān)(P<0.05)。多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析顯示淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、低表達(dá)miR-133b、miR-495是骨肉瘤患者死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.001)，見表3、4。

表3 影響骨肉瘤患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析

表4 影響骨肉瘤患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討論

骨肉瘤是一種高度惡性和侵襲性骨腫瘤，約15%～20%患者在確診時(shí)已發(fā)現(xiàn)有肺轉(zhuǎn)移，僅20%～30%的患者可長期存活[5]。盡管臨床治療手段不斷改進(jìn)，患者生存率有所提高，但是復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移患者生存率仍較低，預(yù)后非常差[6]。miRNA 是一類非編碼小分子RNA，參與細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡等病理生理行為過程，與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，現(xiàn)有研究顯示多種miRNA參與骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展[7]。

miR-133b是一種典型的肌肉特異性miRNA，在哺乳動(dòng)物骨骼、心肌細(xì)胞發(fā)育中具有重要的作用[8]，miR-133b可通過阻斷細(xì)胞周期，促使凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]，并通過抑制靶向基質(zhì)金屬蛋白酶、肌束素結(jié)合蛋白1或腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化降低癌細(xì)胞侵襲和遷移[10]，在胃癌、肺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中扮演抑癌基因角色[11]。本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中miR-133b低表達(dá)是骨肉瘤患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素之一，miR-133b參與骨肉瘤發(fā)病、病情進(jìn)展的機(jī)制為：①Kruppel 樣因子4(Kruppel like factor 4，KLF-4)通過促使血管生成、細(xì)胞增殖分化參與骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，miR-133b可抑制KLF-4表達(dá)，進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]；②miR-133b還可直接靶向成纖維細(xì)胞生長因子受體1[14]或通過Wnt/catenin信號(hào)通路靶向抑制Sirt1表達(dá)[13]，降低腫瘤細(xì)胞活力，抑制骨肉瘤細(xì)胞生長、侵襲和遷移。

miR-495是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡、免疫炎癥反應(yīng)、骨細(xì)胞分化等作用[14]。越來越多證據(jù)表明miR-495異常表達(dá)與多種惡性腫瘤進(jìn)展有關(guān)，miR-495通過胰島素樣生長因子-1 /AKT信號(hào)軸調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]；還可通過上皮和內(nèi)皮酪氨酸激酶促使上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-495表達(dá)降低與骨肉瘤惡性進(jìn)展行為和不良預(yù)后有關(guān)，分析機(jī)制為：首先，高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)是miR-495調(diào)控靶點(diǎn)，其通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞增殖，并通過MAPK信號(hào)通路促進(jìn)間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化[17]。miR-495靶向抑制HMGA2抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。其次，C1q/ TNF相關(guān)蛋白3 (C1q/TNF-related protein 3，CTRP3)作為miR-495靶點(diǎn)負(fù)調(diào)控破骨細(xì)胞形成，miR-495通過抑制CTRP3表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[19]。

綜上所述，骨肉瘤組織中miR-133b、miR-495表達(dá)均降低，miR-133b、miR-495低表達(dá)與骨肉瘤發(fā)生、惡性進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。miR-133b、miR-495有望成為骨肉瘤診斷、預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)指標(biāo)。