及己根、莖、葉醇提取物誘導肺毒性的比較研究

杜云艷，孫淑萍，楊 梅，董婷玉，吳成華，朱恩澤

(皖南醫(yī)學院 1.研究生學院；2.藥學院；3.天然日化研究所，安徽 蕪湖 241002)

及己(ChloranthusserratusRoem.et Schalt.)為金粟蘭科金粟蘭屬植物，產(chǎn)于安徽、浙江、云南等省，常以根或全草入藥?！墩憬耖g常用草藥》記載：及己能殺菌消炎、活絡舒筋，主要用于治療跌傷、扭傷、骨折等。研究表明及己水分離部位能劑量依賴性地抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的炎癥反應[1]，其根醇提取物還能緩解弗氏佐劑誘導的大鼠關節(jié)炎炎癥[2]。但過量使用及己可出現(xiàn)中毒，甚至導致死亡。中毒者表現(xiàn)為兩肺淤血、水腫，肺毛細血管擴張等[3]。多項指征均表明及己可引起肺損傷，但這種損傷在及己的根、莖、葉提取物中的差異未見報道，且其毒性機制尚不明確。調查發(fā)現(xiàn)及己在民間和臨床應用中有水煎和酒浸兩種方式，市售成方制劑“三七藥酒”中含有及己藥材，屬酒浸方式。因此，本研究通過觀察及己根、莖、葉醇提物誘導的肺毒性大小并探討相關機制，以篩選毒性較小的用藥部位，為臨床上安全合理使用及己提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物 及己(ChloranthusserratusRoem.et Schalt.)為金粟蘭科金粟蘭屬植物，采于安徽黃山，由皖南醫(yī)學院朱建華教授根據(jù)《中藥大辭典》鑒定為真品。分離出及己的根、莖和葉，粉碎成粗粉并保存。

取及己根粗粉，用12倍量的75%乙醇浸泡0.5 h后分別用不同體積量的乙醇回流提取3次(12倍量的75%乙醇回流提取1.5 h，10倍、8倍量的75%乙醇分別回流提取1 h)，將3次濾液合并，減壓濃縮、真空干燥、粉碎，得及己根醇(GC)提取物。同法制備及己莖醇(JC)、葉醇(YC)提取物，于室溫保存。醇提取物得率(%)=醇提取物重量/粗粉重量×100%。

1.1.2 動物 將鼠齡6周，體質量為(200±10)g的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠[購自山東省實驗動物中心，SCXK(魯)2014-0007]飼養(yǎng)在通風良好、溫度(23±2)℃、相對濕度50%～60%的可控條件下適應性喂養(yǎng)1周，期間自由攝入飼料與飲用水。

1.1.3 試劑 丙二醛(MDA，20190613)、谷胱甘肽(GSH，20190615)、總超氧化物歧化酶(T-SOD，20190616)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BeyoECL plus化學發(fā)光試劑盒(030519190603，上海碧云天生物技術有限公司)；Mouse Anti-β-Actin(66240-1-lg)、Goat Anti-Mouse IgG(BST12F21C50)、Rabbit Anti-HO-1(ZP1039BP39)、Goat Anti-Rabbit IgG(BST12L05A54)、免疫組化三步法試劑盒(12H25C)購自武漢博士德生物工程有限公司；0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，20180122)購自天津市百世化工有限公司等。

1.1.4 儀器 CKX3OLYMpUS顯微鏡(昆山諾普森實驗室用品科技有限公司)；全自動生化分析儀(深圳市庫貝爾生物科技有限公司)；伯樂電泳儀(Bio-Rad)(上海啟步生物科技有限公司)；Amersham Imager600超靈敏多功能成像儀(General Electric Company)等。

1.2 急性毒性實驗 GC、JC和YC組大鼠分別以劑量為41.4、32.2、11.6 g/kg的對應組醇提取物灌胃。如果未出現(xiàn)死亡，則各組另選兩只大鼠給予上述劑量的GC、JC或YC，在48 h內(nèi)觀察大鼠的大體情況變化和死亡率。

1.3 分組及用藥 將32只SD雄性大鼠隨機均分為正常(KB)組、GC組、JC組和YC組。根據(jù)預實驗結果和種屬間等效劑量折算表[4]，大鼠日給醇提取物量(g/kg)= 3×0.018×5×不同部位醇提取物得率(GC、JC、YC得率分別為15.35%、11.90%、4.31%)× 50，即GC、JC、YC的日給藥量分別為2.07、1.61、0.58 g/kg。各提取物組大鼠分別用0.5% CMC-Na溶液配制的相應醇提取物的混懸液灌胃，KB組大鼠用等量0.5% CMC-Na溶液灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃14 d。

1.4 大鼠一般狀態(tài)觀察及臟器指數(shù)計算 給藥期間每日觀察大鼠一般狀況(飲食、飲水、活動、皮毛色澤變化等)，每隔兩天稱重大鼠，計算體質量變化率。體質量變化率=(測量體質量-原體質量)/原體質量×100%。末次給藥1天后，腹腔注射劑量為0.5 mL/100 g的20%烏拉坦溶液麻醉大鼠，并處死大鼠，分離肺組織，稱其質量，計算臟器指數(shù)，并保存于-80℃，備用。臟器重量與體質量之比的百分數(shù)為臟器指數(shù)。

1.5 HE染色法檢測肺組織病理學變化 取適量肺組織固定在10%甲醛溶液中，脫水后石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后，由不了解本實驗的兩名病理學專家從以下3項病理學改變觀察各組大鼠肺組織的病理變化，并評分[5]：①肺毛細血管及肺內(nèi)出血；②炎性細胞集聚、浸潤；③肺泡壁增厚。每項4個評分：0分=無損傷；1分=損傷達觀察視野25%；2分=損傷達觀察視野50%；3分=損傷達觀察視野75%；4分=整個視野彌漫性肺損傷，根據(jù)各項評分之和評定病理損傷程度。

1.6 大鼠肺勻漿相關指標檢測 取適量肺組織稱重，放入勻漿器中，并將組織質量(g)和生理鹽水(mL)按1∶9的比例，在冰水浴中勻漿，將勻漿液在4℃、2 500 r/min條件下離心20 min，取上清液，分別按照CAT、T-SOD、GSH、MDA試劑盒說明書測定4個指標的含量。

1.7 免疫組化法檢測大鼠肺組織中ICAM-1的表達 按照規(guī)定步驟制作切片，脫蠟，依次在100%、95%、85%、75%和50%的酒精中梯度復水。將切片置于純水中一定時間，滅活、抗原熱修復、封閉，與一抗(ICAM-1)孵育過夜、二抗孵育1 h，用SABC試劑處理30 min后滴加DBA顯色劑，進行蘇木素復染，在顯微鏡下觀察染色程度并拍照，用Image J軟件統(tǒng)計陽性表達百分率。

1.8 Western blotting檢測大鼠肺組織HO-1的表達 在冰水浴中用裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)將適量肺組織研磨至勻漿狀，并在4℃、12 000 r/min條件下離心20 min。取上清液，加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，通過SDS-PAGE分離蛋白并轉移到NC膜上。將NC膜用5%脫脂奶封閉2 h，孵育一抗HO-1(1∶200)過夜，室溫孵育二抗β-actin(1∶400)1 h，滴入ECL顯影液曝光后用Image J軟件讀取灰度值，進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 急性毒性實驗分析 在口服劑量高達41.4、32.2和11.6 g/kg時，及己GC、JC和YC未引起大鼠死亡。由此發(fā)現(xiàn)GC、JC和YC的LD50分別高于41.4、32.2和11.6 g/kg。因此，選擇GC 2.07 g/kg、JC 1.61 g/kg和YC 0.58 g/kg作為評估及己不同部位醇提取物誘導大鼠肺損傷的劑量。

2.2 對大鼠一般體征的影響 各組大鼠均存活，無死亡現(xiàn)象。其中，KB組大鼠活動、飲食和排泄均正常，皮毛光澤。GC組大鼠活動狀態(tài)較好，其皮毛光澤度以及飲水、飲食量也較為正常。JC組大鼠皮毛失去光澤，手感粗糙，且其活動，飲水、飲食量較KB和GC組均減少。YC組大鼠活動度差，嗜睡，脫毛，飲食消耗量和以上幾組相比減少。

2.3 對大鼠體質量的影響 給藥期間KB組大鼠體質量正常增長，GC組體質量增長速度較快，其次是JC和YC組。從第3天到第13天，各組大鼠體質量變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而在第15天，JC和YC組大鼠的體質量變化相比于KB和GC組均降低(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠體質量變化情況 g

2.4 對大鼠肺大體形態(tài)的影響 肉眼可見KB組肺為淡粉紅色，表面較光滑，無其他異常；GC組肺表面有少量出血點；YC組、JC組出血點較明顯，表面較粗糙，臟器呈深紅色，且YC組出血點更多，如圖1。

圖1 各組大鼠肺大體形態(tài)

2.5 對大鼠肺指數(shù)的影響 與KB組相比，GC、JC及YC組肺指數(shù)均降低，但差異無統(tǒng)計學意義(F=3.407，P=0.074)，見圖2。

圖2 各組大鼠肺指數(shù)的變化

2.6 對大鼠肺組織形態(tài)學的影響 HE染色結果顯示KB組大鼠肺泡結構完整且清晰可見。GC組肺泡結構清晰完整，有少量炎細胞浸潤、肺泡及間質內(nèi)輕微出血。JC和YC組可見大量炎細胞浸潤、肺水腫及淀粉樣變性，壁間質、細支氣管壁明顯增厚，YC組甚至出現(xiàn)纖維排列紊亂，細胞質間隙出血等。病理學評分中JC、YC組肺組織病理評分較GC組均升高(P<0.05)，且YC組更明顯，見圖3、表2。

表2 各組大鼠肺組織病理學評分

圖3 各組大鼠肺組織形態(tài)學的變化(KB×200，GC、JC、YC×100)

2.7 對大鼠肺勻漿指標MDA、GSH、SOD和CAT含量的影響 與空白組相比，GC組各指標含量變化差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與KB和GC組相比，JC和YC組MDA含量均升高(FA=16.157，P<0.01)；GSH含量均降低(FB=5.348，P<0.05)。與KB和GC組相比，JC和YC組SOD和CAT含量均降低(FC=16.262，F(xiàn)D=16.576，P<0.01)。除此之外，YC組SOD和CAT的含量較GC組也降低(P<0.01)，見圖4。

與KB組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與GC組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

2.8 對肺組織中ICAM-1表達的影響 與KB組相比，GC組ICAM-1陽性表達率的升高無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而JC和YC組ICAM-1陽性表達率升高(P<0.05)。與GC組相比，JC、YC組大鼠肺組織中ICAM-1陽性表達均升高(P<0.05)，但YC組更明顯，見圖5。

與KB組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與GC組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

2.9 對肺組織中HO-1蛋白表達的影響 與KB組相比，GC組大鼠肺組織內(nèi)HO-1蛋白表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；JC和YC組HO-1蛋白表達均下降(P<0.05)，且其下降幅度較GC組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖6。

與KB組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與GC組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

3 討論

體質量變化率和器官指數(shù)是評估藥物毒性的基本指標。通常各臟器指數(shù)數(shù)值相對恒定，但其可因臟器萎縮而降低，充血或增生而升高[6]。在本實驗中，JC和YC組大鼠活動減少，體質量增長緩慢，且肺指數(shù)下降較明顯，提示JC和YC對大鼠的健康產(chǎn)生了一定的影響。結合病理組織學結果，進一步表明及己JC和YC可明顯誘導雄性大鼠的肺病理學損傷。

氧化應激損傷是細胞或組織損傷的重要途徑之一，由氧化/抗氧化平衡穩(wěn)態(tài)被打破造成[7]。MDA是脂質氧化損傷指標的最佳“生物標志物”[8]。GSH為一種能抵抗氧化應激損傷的細胞保護劑和抗氧化劑[9]，其體內(nèi)含量的變化可反映機體清除自由基和抗脂質過氧化損傷的能力[10]。機體內(nèi)的保護酶CAT及SOD含量也可作為判斷組織是否受損的指標。SOD能有效清除體內(nèi)的O2-，其含量降低，則細胞清除自由基的水平降低，造成氧化應激損傷[11]。本研究中JC和YC能增加大鼠肺勻漿MDA水平，降低SOD、GSH和CAT水平，但GC對4個指標的變化均不明顯，這在一定程度上佐證及己JC、YC具有肺毒性的觀點，以YC最為突出。

ICAM-1能輔助白細胞到達炎癥部位，從而調整免疫防御系統(tǒng)。在有肺部炎癥的肺組織中ICAM-1含量會明顯增加。因此，ICAM-1水平的高低是指示肺組織是否受損的重要指標之一[12]。在本研究中，與肺勻漿各指標結果相一致，JC、YC組大鼠肺組織中ICAM-1陽性表達水平升高，而GC組變化幅度較小，這表明YC、JC組大鼠肺組織均嚴重受損，且YC組損傷更嚴重。

HO-1為保護性蛋白，但長時間的毒物刺激會使得其水平降低[13]。本實驗中，GC組HO-1表達水平略微上升，可能是由于GC組具有較好的抗炎效果[1-2]，JC、YC組均明顯降低，說明JC、YC均能引起氧化應激損傷，且YC誘導的損傷更明顯。

綜上所述，及己YC、JC可能通過氧化應激引起較嚴重的大鼠肺損傷，而GC引起的肺損傷不明顯，說明及己根是較好的藥用部位。今后我們會對肺損傷的具體機制和根部藥用部位作進一步的研究，進而為及己在臨床的廣泛應用提供基礎，大大降低及己用藥中毒的可能性。

(致謝：感謝皖南醫(yī)學院病理學教研室黃小梅副教授和蕪湖市第五人民醫(yī)院副主任醫(yī)師李勝利老師對實驗中病理評分的指導。)