糞便中病原微生物快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

傅子鵬，劉成斌，李秋菊，毛 舜

(同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院/ 污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200092)

人體糞便中含有眾多微生物，其中病原微生物包括志賀氏菌(Shigellaspp.)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、諾如病毒(Norwalk virus)等。這些病原體通過(guò)污染食物或水源感染人類，引發(fā)腹瀉、腸胃炎、敗血癥等疾病，發(fā)病率高[1]。另外，糞便中的腸道微生物組與人體健康直接相關(guān)，影響著從代謝疾病到胃腸道疾病和結(jié)腸直腸癌等慢性疾病的發(fā)展[2]。不衛(wèi)生的如廁條件、糞便等污染物的不安全排放導(dǎo)致全球每年約150萬(wàn)兒童感染疾病，是非洲地區(qū)引起兒童死亡的主要因素[3]。國(guó)內(nèi)很多農(nóng)村地區(qū)廁所環(huán)境不佳，雨天污染物容易溢出致使病原菌擴(kuò)散；同時(shí)，廁所生物污染物容易傳播疾病，增加人群發(fā)病率[4]。近年來(lái)，隨著國(guó)家和社會(huì)對(duì)農(nóng)村廁所環(huán)境的愈發(fā)關(guān)注，國(guó)家大力推動(dòng)“廁所革命”，將農(nóng)村廁所改造成無(wú)害化衛(wèi)生廁所[5]。在改廁的過(guò)程中仍然存在糞便污染物的分布及風(fēng)險(xiǎn)不明、資源化轉(zhuǎn)化過(guò)程(如堆肥)中污染物遷移轉(zhuǎn)化機(jī)理不清的問(wèn)題。因此，對(duì)糞便中的病原微生物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)推動(dòng)農(nóng)村廁所環(huán)境改善和廁所糞便的資源化利用具有重要的意義。

針對(duì)糞便中病原微生物的檢測(cè)，傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)法一般使用紙片、紙膜、膠片等作為培養(yǎng)基載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在上面，通過(guò)微生物的生長(zhǎng)、顯色來(lái)進(jìn)行測(cè)定。以糞便中的沙門氏菌檢測(cè)為例，首先對(duì)糞便進(jìn)行采樣制備，在適宜條件下培養(yǎng)增菌，之后進(jìn)行分離觀察鑒定[6]。培養(yǎng)檢測(cè)法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是全世界用于檢測(cè)微生物的基本工具；但其缺點(diǎn)在于需要專業(yè)人員操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)材料有特定要求，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，通常需要5～7 d[7]。因此，培養(yǎng)檢測(cè)法往往不能滿足快速檢測(cè)的需要。

近年來(lái)，糞便中病原微生物的快速檢測(cè)方法受到環(huán)境分析領(lǐng)域的關(guān)注。根據(jù)檢測(cè)原理，病原微生物的快速檢測(cè)方法可分為基于核酸的檢測(cè)方法、基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法和基于生物傳感器的檢測(cè)方法。基于核酸的檢測(cè)方法通常對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行放大擴(kuò)增，可以檢測(cè)目標(biāo)病原體的特定基因，檢測(cè)準(zhǔn)確度高；基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法利用抗原-抗體雜交反應(yīng)，據(jù)此開(kāi)發(fā)的試劑盒能夠快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)目標(biāo)物；基于生物傳感器的檢測(cè)方法主要依靠光學(xué)原理和電化學(xué)原理，樣品制備簡(jiǎn)單，能夠?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的微型化、模塊化和集成化。

1 糞便樣品的前處理

糞便樣品中除了腸道細(xì)菌外，還有腐殖質(zhì)、腸道內(nèi)壁脫落細(xì)胞及碎片、各種有機(jī)物和無(wú)機(jī)物等[8]。糞便樣品作為一種生物樣品，成分復(fù)雜多樣，在分析之前需要進(jìn)行前處理，去除干擾物，使待測(cè)物純度達(dá)到儀器要求[9]。糞便樣品的前處理目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化程序[10]，通常取樣后在低溫環(huán)境下保存樣品，經(jīng)過(guò)離心、破碎、稀釋等步驟后，依據(jù)商用試劑說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取操作和后續(xù)分析。較為常用的商用DNA提取試劑盒處理方法有E.Z.N.A Bacterial DNA Kit法、E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA Kit法、FastDNA Spin Kit for Soil法、QIAamp DNA Stool Mini Kit法、QIAamp Powerfecal DNA Kit法、TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒法和Wizard?Genomic DNA Purification Kit法等[11]。BECKMAN等[12]檢測(cè)糞便中的幽門螺桿菌時(shí)，首先將糞便樣品于-20 ℃條件下冷凍保存，之后使用QIAamp快速糞便試劑盒提取DNA進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。ZHANG等[13]使用TIANGEN公司生產(chǎn)的TIANamp stool DNA試劑盒從46個(gè)臨床樣品中提取DNA，然后利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)進(jìn)行分析，成功檢出糞便樣品中的志賀氏菌。ZHAO等[14]開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)聲流處理糞便樣品的微流控芯片，借助聲換能器件產(chǎn)生的渦流將糞便樣品緩沖液以高達(dá)30 μL·min-1的流速進(jìn)行均質(zhì)化，并過(guò)濾掉碎屑，通過(guò)100 mm寬的微柱陣列進(jìn)一步純化糞便樣品(圖1)。通過(guò)該方法制備的糞便樣品能夠保證細(xì)菌具備一定的形態(tài)完整性和生存力，便于后續(xù)檢測(cè)。

2 基于核酸的快速檢測(cè)方法

核酸檢測(cè)在疾病診斷、基因表達(dá)和生物鑒定等領(lǐng)域應(yīng)用較廣。由于核酸通常是痕量的，基于核酸的檢測(cè)方法一般需要通過(guò)有效地放大目標(biāo)序列來(lái)擴(kuò)增其含量，即核酸擴(kuò)增技術(shù)。核酸擴(kuò)增技術(shù)根據(jù)操作時(shí)溫度的差別可大致分為2類：熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[15]。在熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)方面，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是用于檢測(cè)微生物最為常用和成熟的技術(shù)，該方法可用于分離，擴(kuò)增和定量短DNA序列。

在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上拓展出一些其他的擴(kuò)增方法，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)，該方法通過(guò)熒光標(biāo)記的探針能夠在擴(kuò)增過(guò)程中檢測(cè)靶標(biāo)PCR，結(jié)合光學(xué)傳感器使其具有更高的靈敏度，比常規(guī)的PCR更容易進(jìn)行定量檢測(cè)。BECKMAN等[12]評(píng)估了使用糞便標(biāo)本檢測(cè)幽門螺桿菌的可能性，使用qPCR檢測(cè)294個(gè)糞便標(biāo)本，227個(gè)樣本為陽(yáng)性，表明在人類糞便樣本中可以檢測(cè)到幽門螺桿菌，因此無(wú)需進(jìn)行胃活檢就可以確定該細(xì)菌的存在。逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)可以區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR無(wú)法檢測(cè)活細(xì)胞的缺點(diǎn)，并且可以檢測(cè)處于生長(zhǎng)期的細(xì)菌。巢式PCR(nested PCR)能夠在提取RNA后借助DNA庫(kù)對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，大大加快了病毒的測(cè)序速度，被用于檢測(cè)糞便中的脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)[16]。作為熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，以上的方法需要昂貴的測(cè)試平臺(tái)，并且需要設(shè)計(jì)合適的引物，且過(guò)程繁瑣耗時(shí)，不適合在缺乏相關(guān)設(shè)備的地區(qū)對(duì)糞便中病原微生物進(jìn)行快速檢測(cè)。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)省去了熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)中的變性、退火步驟，無(wú)需特殊的控溫設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)靶序列循環(huán)擴(kuò)增，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，能夠方便地用于病原微生物的高效檢測(cè)。其中較為成熟的技術(shù)是LAMP技術(shù)。該技術(shù)基于鏈置換原理[17]，通過(guò)DNA聚合酶催化進(jìn)行反應(yīng)，可分為以啞鈴狀模板構(gòu)造的形成過(guò)程和擴(kuò)增循環(huán)2個(gè)步驟[14]。該方法簡(jiǎn)單快速，與PCR技術(shù)相比，不需要復(fù)雜的設(shè)備和專業(yè)人員進(jìn)行操作，甚至可以在簡(jiǎn)單的水浴裝置中進(jìn)行。在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，ZHANG等[13]結(jié)合磁敏免疫分析技術(shù)(magnetic immunocaptured-loop-mediated isothermal amplification assay，IC-LAMP)來(lái)檢測(cè)糞便樣品中的志賀氏菌，該方法能夠比傳統(tǒng)LAMP技術(shù)更有效地富集病原體細(xì)胞而無(wú)需提取基因組DNA，檢測(cè)限為8.7 cfu·mL-1，比PCR技術(shù)對(duì)志賀氏菌的檢測(cè)更為靈敏、特異且可靠。除此以外，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)還包括雜交鏈反應(yīng)技術(shù)(hybridization chain reaction)[18]、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification)[19]和鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(strand displacement amplification)等，這些技術(shù)對(duì)某些影響分子擴(kuò)增效率的抑制物質(zhì)的耐受性優(yōu)于PCR[20]。

3 基于免疫學(xué)的快速檢測(cè)方法

基于免疫學(xué)的快速檢測(cè)方法利用了特異性抗原-抗體反應(yīng)，針對(duì)目標(biāo)物的抗原或抗體對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量、定性檢測(cè)[21]。該類方法包括酶聯(lián)免疫法，生物發(fā)光免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法等，具有檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。

在免疫學(xué)方法中，酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是在病原體檢測(cè)方面使用最為廣泛方法之一。為了滿足測(cè)定需求，ELISA通?？煞譃橹苯覧LISA、夾心ELISA和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA(圖2)。直接ELISA首先將目標(biāo)分析物(抗原)粘附于平板表面，然后將酶標(biāo)記的抗原特異性結(jié)合，最后引入該酶的生色試劑產(chǎn)生顏色變化；夾心ELISA通常使用2種抗體，一種作為吸附劑固定以捕獲抗原，另一種通過(guò)酶標(biāo)記的抗體作為信號(hào)標(biāo)記產(chǎn)生顯色反應(yīng)；競(jìng)爭(zhēng)性ELISA主要應(yīng)用于抗原缺乏抗體的結(jié)合位點(diǎn)，原理是標(biāo)記的抗體與樣品競(jìng)爭(zhēng)抗原的結(jié)合位點(diǎn)[22]。在沙門氏菌、李斯特菌(Listeriaspp.)和大腸桿菌等多種食源性致病微生物的檢測(cè)中均借助了酶聯(lián)免疫方法，取得了很好的檢測(cè)效果。BOLTON等[23]研究了沙門氏菌的ELISA檢測(cè)，試劑盒的檢出限低至0.04 cfu·g-1。相比于培養(yǎng)法，基于免疫學(xué)的病原微生物檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，是病原菌檢測(cè)中常用的方法；然而這些方法有耗時(shí)長(zhǎng)、存在交叉反應(yīng)、產(chǎn)生假陰性等缺點(diǎn)。

4 基于生物傳感器的快速檢測(cè)方法

近年來(lái)，各種新型微生物檢測(cè)方法發(fā)展迅速，基于納米材料的生物傳感器在微生物快速檢測(cè)中表現(xiàn)出優(yōu)異性能，受到廣泛的研究關(guān)注。納米材料尺寸小、結(jié)構(gòu)可控、具有良好的生物相容性，可以利用其優(yōu)異的光學(xué)、電化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)微生物的蛋白質(zhì)、DNA或RNA。此外，將納米材料與傳感器結(jié)合對(duì)微生物的目標(biāo)信號(hào)物進(jìn)行特異性識(shí)別檢測(cè)和信號(hào)傳遞有利于提高檢測(cè)的特異性和靈敏性[24-25]?；诳贵w、適配體等對(duì)細(xì)菌或病毒特定結(jié)構(gòu)的親和力，結(jié)合納米材料的信號(hào)放大和轉(zhuǎn)換作用，生物傳感器可實(shí)現(xiàn)對(duì)病原微生物的實(shí)時(shí)、原位、高靈敏度檢測(cè)。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)方法相比，該方法檢測(cè)速度快，多數(shù)情況下能在1 h左右得到結(jié)果。但該類技術(shù)仍處于發(fā)展階段，需要與可靠性強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，以獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

4.1 光學(xué)生物傳感器

光學(xué)生物傳感器通過(guò)熒光、散射、吸收等光學(xué)現(xiàn)象，借助信號(hào)轉(zhuǎn)換器將生物信號(hào)轉(zhuǎn)化為可分析的光信號(hào)；將與病原微生物特征物具有特異性反應(yīng)的抗原、抗體或適配體(檢測(cè)探針)修飾于光學(xué)材料上，通過(guò)檢測(cè)探針與特征物的結(jié)合引起光學(xué)特性變化，以此定量檢測(cè)病原微生物的濃度。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，光學(xué)生物傳感器檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、無(wú)需具備專業(yè)知識(shí)的人員便可進(jìn)行快速檢測(cè)操作。光學(xué)生物傳感器按檢測(cè)原理可分為比色光學(xué)生物傳感器、表面離子共振生物傳感器、熒光生物傳感器等。

4.1.1比色光學(xué)生物傳感器

比色光學(xué)生物傳感器的檢測(cè)原理基于比色分析法。比色分析法是通過(guò)溶液本身的顏色對(duì)光的選擇性吸收，在特定波長(zhǎng)范圍產(chǎn)生吸收并用肉眼觀察或光學(xué)儀器進(jìn)行分析的一種方法。利用這種方法可以通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，簡(jiǎn)化鑒定步驟。在比色生物傳感器中最具代表性的是側(cè)流層析技術(shù)(lateral flow assay，LFA)，該方法能夠在短時(shí)間內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。LFA技術(shù)雖作為一種即時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)手段被廣泛運(yùn)用，但仍存在靈敏度較低、定量檢測(cè)能力有限、無(wú)法重復(fù)利用等缺陷。在溶液樣品檢測(cè)方面，TRAM等[26]開(kāi)發(fā)了一種試紙比色傳感方法，利用細(xì)菌的DNA酶探針作為分子識(shí)別元件，檢測(cè)過(guò)程中尿素通過(guò)脲酶水解增加溶液pH值；通過(guò)將脲酶與磁珠上的DNA酶偶聯(lián)，通過(guò)pH值的變化可檢測(cè)細(xì)菌的存在和濃度。由于其快速、簡(jiǎn)單、結(jié)果易觀測(cè)，能夠適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但該方法靈敏度較低，若要進(jìn)行更為準(zhǔn)確的檢測(cè)需要增加富集培養(yǎng)步驟。

4.1.2表面離子共振(surface plasmon resonance，SPR)生物傳感器

SPR傳感器通常由光源、接收器、棱鏡、偏振片、金屬膜以及能夠與檢測(cè)目標(biāo)物特異性結(jié)合的識(shí)別元件組成，光源發(fā)射入射光透過(guò)偏振片，以一定的角度射入棱鏡，激發(fā)金屬膜上的等離子體，當(dāng)負(fù)載在金屬膜表面的識(shí)別元件結(jié)合了目標(biāo)物后會(huì)引起表面的折射率發(fā)生變化，在檢測(cè)器中產(chǎn)生信號(hào)響應(yīng)，以此定量檢測(cè)目標(biāo)物的含量[27](圖3)。TORUN等[28]利用磁性納米顆粒對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離，采用SPR傳感器對(duì)大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限低至3 cfu·mL-1。將SPR技術(shù)與納米材料和其他檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用能夠提高檢測(cè)靈敏度、響應(yīng)速度，優(yōu)化傳感器性能。ZHOU等[29]將免疫磁分離、免疫磁性試紙與SPR技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)免疫磁分離富集副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，與PCR技術(shù)相比大幅提高了檢出限和檢出速度，檢測(cè)限為10 cfu·mL-1，能在55 min內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果。EL等[30]將MoS2-石墨烯復(fù)合材料與局部表面等離振子共振(localized surface plasmon resonance)生物傳感器相結(jié)合，大幅提高了傳感器的靈敏度。SPR生物傳感器是食源性致病菌檢測(cè)中應(yīng)用較多的一類生物傳感器，然而細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)與水的折射率相似，在一定程度上限制了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，且SPR生物傳感器在實(shí)驗(yàn)室分析中仍需要大型設(shè)備，可與微流控技術(shù)相結(jié)合來(lái)減小設(shè)備尺寸和降低檢測(cè)的復(fù)雜性[31]。

4.1.3熒光生物傳感器

熒光生物傳感器是基于熒光發(fā)生原理，當(dāng)目標(biāo)分析物受到紫外光照射時(shí)，原子被激發(fā)產(chǎn)生能級(jí)躍遷從而產(chǎn)生熒光，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定量分析。熒光生物傳感器設(shè)備簡(jiǎn)單且響應(yīng)速度快，結(jié)合新型納米材料能消除背景熒光，提升信噪比[32]。SRINIVASAN等[33]設(shè)計(jì)了2種無(wú)標(biāo)記的熒光適體傳感器檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)。第1種采用“熒光淬滅”方式，首先將適體插入SYBR核酸染料(SYBR GREEN I,SG)，產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)；加入鼠傷寒沙門氏菌，與適配體特異性結(jié)合并釋放SG，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度線性下降，這種方法獲得的最低檢測(cè)限為733 cfu·mL-1。第2種采用“熒光增強(qiáng)”方式，當(dāng)適體和金納米顆粒與羅丹明B(rhodamine B，RB)混合時(shí)，羅丹明的熒光通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(forster resonance energy transfer，F(xiàn)RET)并被顯著淬滅；加入鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)，與適配體特異性結(jié)合，導(dǎo)致淬滅的羅丹明B的熒光恢復(fù)，從而通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度變化對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限為464 cfu·mL-1。

HU等[34]設(shè)計(jì)了一種納米熒光微球用于快速檢測(cè)大腸桿菌O157:H7，通過(guò)化學(xué)方法將熒光素固定于SiO2納米微球內(nèi)，并將針對(duì)大腸桿菌O157:H7的抗體修飾于磁珠和SiO2納米微球表面，從而用于識(shí)別和捕獲大腸桿菌O157:H7。通過(guò)磁分離富集后加入NaOH以釋放SiO2微球中的熒光素來(lái)檢測(cè)大腸桿菌O157:H7的濃度。在最優(yōu)條件下，該方法的檢測(cè)限低至3 cfu·mL-1，檢測(cè)過(guò)程可在75 min內(nèi)完成。熒光生物傳感器在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中常以試劑盒和試紙條的形式出現(xiàn)，靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便。

4.2 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)傳感器一般由換能器和識(shí)別元件等組成，其中識(shí)別元件與病原體微生物的目標(biāo)檢測(cè)物特異性結(jié)合，引發(fā)電化學(xué)系統(tǒng)中的阻抗、電流等的變化，通過(guò)電信號(hào)的測(cè)量來(lái)檢測(cè)病原微生物的濃度，其組件與檢測(cè)模式如圖4所示[35]。

4.2.1安培型/伏安型生物傳感器

安培型傳感器檢測(cè)病原微生物的基本工作原理是在給定的電勢(shì)下測(cè)定電極表面由氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生的電流，分析物濃度與電流值呈線性關(guān)系[36]，與之對(duì)應(yīng)的伏安型生物傳感器則在電勢(shì)掃描下測(cè)定對(duì)應(yīng)的電流，生成的伏安圖中電流強(qiáng)度與分析物的濃度成正比。另外，伏安法的類型根據(jù)電勢(shì)的控制形式可分為差分脈沖伏安法、循環(huán)伏安法和方波伏安法[37]。

根據(jù)安培型生物傳感器的檢測(cè)原理，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一系列用于檢測(cè)病原微生物的相關(guān)傳感器。SAVAS等[38]開(kāi)發(fā)了一種能夠檢測(cè)糞便樣本中痕量的鼠傷寒沙門氏菌的傳感器，基于免疫學(xué)原理對(duì)DNA探針和目標(biāo)物菌用辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase)標(biāo)記，在固定電勢(shì)下連續(xù)測(cè)量電流，以檢測(cè)固定在傳感器表面的DNA探針與目標(biāo)物之間發(fā)生的雜交反應(yīng)，從而定量檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的DNA濃度，檢測(cè)限低至1 cfu·mL-1。在安培型生物傳感器中，石墨烯也常被用做通道材料將生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為電學(xué)信號(hào)。HUANG等[39]設(shè)計(jì)了一種基于石墨烯的生物傳感器，能夠以高靈敏度和特異性檢測(cè)大腸桿菌。通過(guò)化學(xué)氣相沉積法生長(zhǎng)大尺寸石墨烯薄膜，通過(guò)連接子將大腸桿菌抗體修飾于石墨烯薄膜上，未防止非特異性反應(yīng)，使用乙醇胺將未反應(yīng)的連接子分子猝滅，同時(shí)使用吐溫20將未涂覆石墨烯的區(qū)域覆蓋，最后利用抗體與大腸桿菌的抗原-抗體特異性反應(yīng)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行特異性識(shí)別，檢測(cè)限低至10 cfu·mL-1(圖5)。ODUNDO等[40]根據(jù)免疫學(xué)原理研發(fā)了一種能夠檢測(cè)糞便樣本中血吸蟲抗原的伏安型生物傳感器，由納米帶、金納米顆粒以及血吸蟲抗原組成。將血吸蟲抗原負(fù)載在金納米顆粒上，在檢測(cè)過(guò)程中抗原與血吸蟲抗體特異性結(jié)合，利用循環(huán)伏安法進(jìn)行分析，檢測(cè)限低至8.4×10-2ng·mL-1。

4.2.2阻抗型生物傳感器

阻抗型生物傳感器利用電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)對(duì)電化學(xué)系統(tǒng)施加一個(gè)頻率變化的交流信號(hào)，通過(guò)測(cè)量交流信號(hào)中電壓與電流的比值，即阻抗值來(lái)分析目標(biāo)物。EIS對(duì)檢測(cè)界面非常敏感，因此可以用于表征生物傳感器構(gòu)建過(guò)程中各種反應(yīng)的特性[37]。在生物傳感器中通常利用能夠與目標(biāo)檢測(cè)物特異性結(jié)合的探針增強(qiáng)傳感器的靈敏性和特異性。MALVANO等[41]設(shè)計(jì)了一種基于乳鏈菌肽的阻抗型生物傳感器。乳鏈菌肽是一種抗微生物肽，可以攻擊細(xì)菌并破壞其細(xì)胞膜，在生物傳感器中可用作分子識(shí)別元件。將乳鏈菌肽分子固定在金電極上，利用電化學(xué)阻抗譜研究該傳感器對(duì)不同細(xì)菌的響應(yīng)情況。在檢測(cè)沙門氏菌細(xì)胞時(shí)檢測(cè)限低至1.5×101cfu·mL-1。SHI等[42]采用對(duì)大腸桿菌O157:H7具有高親和力的聚合肽作為識(shí)別原件，經(jīng)修飾后在金電極上進(jìn)行自組裝，之后利用阻抗譜分析大腸桿菌O157:H7，其檢測(cè)限低至20 cfu·mL-1。在阻抗型生物傳感器中，石墨烯由于其高比表面積、優(yōu)異的導(dǎo)電性能以及可修飾性，也常被用作檢測(cè)材料。JAISWAL等[43]將羧基化的石墨烯與氧化鋅納米棒結(jié)合，并在電極表面固定大腸桿菌O157:H7的特異性DNA探針，以檢測(cè)大腸桿菌O157:H7。GUPTA等[44]利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)，將氧化石墨烯制備成電極，并在其表面用2-氨基對(duì)苯二甲酸進(jìn)行功能化，利用抗原-抗體反應(yīng)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)。該傳感器檢測(cè)限低至2 cfu·mL-1，且響應(yīng)速度快(檢測(cè)時(shí)間少于4 min)，穩(wěn)定性好(2個(gè)月)。

4.3 微流控技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用

近年來(lái)，微流控技術(shù)發(fā)展迅速，廣泛運(yùn)用于生物樣品的快速檢測(cè)。生物傳感器與微流體集成的檢測(cè)系統(tǒng)能夠在單一設(shè)備上進(jìn)行樣品的添加、分離、制備和分析，具有檢測(cè)時(shí)間短、多通量、自動(dòng)化、便攜性，多功能性和所需樣品量小等多種優(yōu)點(diǎn)[45]。ZHAO等[14]開(kāi)發(fā)的微流控芯片可以與樣品分析單元相結(jié)合(如生物傳感器等)，簡(jiǎn)化樣品處理步驟，在設(shè)計(jì)便攜式糞便診斷平臺(tái)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。MCGUIRE等[46]對(duì)糞便樣品進(jìn)行加熱揮發(fā)處理，通過(guò)氣相色譜方法并結(jié)合電子鼻技術(shù)，對(duì)艱難梭菌(Clostridiumdifficile)進(jìn)行檢測(cè)。微流控技術(shù)能夠從復(fù)雜樣品中有效分離致病菌，進(jìn)而便于病原體的精確檢測(cè)。將微流控技術(shù)與生物傳感器技術(shù)相結(jié)合，有望開(kāi)發(fā)更為實(shí)用的便攜式現(xiàn)場(chǎng)病原微生物檢測(cè)設(shè)備，滿足疾病控制、食品、環(huán)境監(jiān)控等方面的需求。

5 檢測(cè)方法對(duì)比

前文介紹了糞便中病原微生物快速檢測(cè)方法，表1對(duì)這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)。傳統(tǒng)的培養(yǎng)鏡檢法能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)常見(jiàn)微生物種類，但缺點(diǎn)在于微生物培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，通常在5～7 d內(nèi)才能給出檢測(cè)結(jié)果。相較于培養(yǎng)鏡檢法，核酸檢測(cè)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法和生物傳感器檢測(cè)方法往往能夠快速得到檢測(cè)結(jié)果。其中光學(xué)生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)尤為方便，結(jié)合微流控技術(shù)能夠快速分析成分復(fù)雜的糞便樣品。

表1 糞便中病原微生物快速檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of fast detection methods for pathogenic microorganisms in faeces

表2總結(jié)了糞便中病原微生物快速檢測(cè)方法的各項(xiàng)指標(biāo)，表中提到的檢測(cè)方法均能在2 h內(nèi)完成檢測(cè)。生物傳感器由于檢測(cè)結(jié)構(gòu)、識(shí)別元件、換能器等各不相同，其性能相差明顯，對(duì)不同目標(biāo)檢測(cè)物的檢測(cè)時(shí)間由2 min到2 h不等。通過(guò)設(shè)計(jì)不同的識(shí)別元件，生物傳感器能夠檢測(cè)不同的微生物；另外選擇合適的納米材料作為換能器能夠大幅提高傳感器的檢測(cè)性能。因此，生物傳感器在病原微生物檢測(cè)方面有望得到進(jìn)一步研究和推廣。

表2 糞便中病原微生物檢測(cè)方法對(duì)比Table 2 Comparison of detection methods for pathogenic microorganisms in faeces

6 總結(jié)與展望

針對(duì)糞便中病原微生物的檢測(cè)，傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)法依然是常用且準(zhǔn)確有效的檢測(cè)方法。但由于該方法需要耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行微生物培養(yǎng)，操作步驟繁多，難以滿足快速檢測(cè)需求。該文根據(jù)檢測(cè)原理，介紹了核酸檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法和生物傳感器檢測(cè)法。相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)法，這些方法通常能在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。

核酸檢測(cè)法主要依靠核酸的擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)于特定的基因片段擴(kuò)增最終得到基因序列，與已知的目標(biāo)微生物的核酸序列比對(duì)便可鑒定檢測(cè)微生物類別[47]。近年來(lái)，核酸檢測(cè)法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)得到了充分的實(shí)踐應(yīng)用，在新冠疫情的鑒定排查方面，許多國(guó)家也運(yùn)用該方法研制了相應(yīng)的核酸試劑盒來(lái)對(duì)疑似感染者進(jìn)行篩查。核酸檢測(cè)技術(shù)作為微生物檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，有著特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，但需要在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。免疫學(xué)檢測(cè)方法基于抗原-抗體反應(yīng)原理，檢測(cè)結(jié)果較為可靠，但同樣依賴實(shí)驗(yàn)室條件，這限制了其在現(xiàn)場(chǎng)原位檢測(cè)的應(yīng)用。生物傳感器基于光學(xué)、電學(xué)分析原理，能夠特異性檢測(cè)目標(biāo)病原微生物，同時(shí)具備高靈敏度，并且具有成本低、檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單、無(wú)需專業(yè)人員操作，可現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。但目前多數(shù)生物傳感器對(duì)糞便樣品的檢測(cè)仍處于研究階段，沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各種不同的傳感器設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其性能差異巨大。如何提高傳感器的重復(fù)性、穩(wěn)定性和抗干擾能力，使其能夠方便地應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)當(dāng)中是需要解決的問(wèn)題。另外，生物傳感器往往對(duì)分析樣品的條件狀態(tài)有一定限制，因此糞便樣品的快速前處理方法也是亟需研究的問(wèn)題之一。生物傳感器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活，通過(guò)結(jié)合性能優(yōu)異的納米功能材料，這類傳感器顯現(xiàn)出極高的檢測(cè)能力，具有巨大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。