雙氫青蒿素對Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎和軟骨修復(fù)作用

張俊， 袁映紅， 馮志蔚， 肖濤， 孔亮， 蔣科

（1.南充市中心醫(yī)院嘉陵分院骨科，四川南充 637500；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，四川南充 637000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其主要表現(xiàn)為滑膜炎癥伴關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞等[1]。調(diào)節(jié)免疫異常、消除炎癥反應(yīng)是治療RA的關(guān)鍵[2]。目前對RA的西藥治療主要包括非甾體抗炎藥/糖皮質(zhì)激素等[3-4]，但這些藥物均有較大的副作用；單純中藥治療RA 毒副作用小，但效果并不非常顯著[5]。青蒿素是從菊科植物黃花蒿（Artemisiaannua L.全草）中提取的含有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯（藥用植物的生物活性組分）的藥物。青蒿素及其已上市衍生物是臨床常用的抗瘧藥物?，F(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn)青蒿素及青蒿素衍生物對體液免疫和細(xì)胞免疫均有明顯的抑制作用，同時具有較好的抑制炎癥效果，且安全性高[6-7]，其作為抗炎免疫調(diào)節(jié)藥物越來越受到重視。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin）是青蒿素的衍生物之一，是青蒿素經(jīng)四氫硼鈉還原而成，分子式為C15H24O5，相對分子質(zhì)量為284.35，是青蒿素類藥物在體內(nèi)的主要的活性形式之一。已經(jīng)有研究表明，雙氫青蒿素具有抗RA 作用[8]。本研究建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)RA動物模型模擬RA發(fā)病[8]，進(jìn)一步探討雙氫青蒿素對RA大鼠抗炎反應(yīng)和軟骨修復(fù)的影響，以期為RA 患者臨床治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級6周齡SD雄性大鼠75只，購自廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，粵監(jiān)證字2018A029號，動物許可證號：SYXK2018-0056。于川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心SPF 級動物房中進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，溫度25 ℃，光照/黑暗各12 h。本實驗已經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn)同意且本動物實驗嚴(yán)格遵循動物實驗減少（reduction）、優(yōu)化（refinement）和替代（replacement）-3R原則。

1.2 藥物與試劑 雙氫青蒿素（CAS 號：71939-50-9；商品號：EBD2184717）（上海源葉生物科技有限公司）。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、白細(xì)胞介素17（IL-17）、白細(xì)胞介素23（IL-23）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn) 錄 因 子Osterix（Osx）、Ⅰ型 膠 原 蛋 白α1 鏈（COL1A1）和骨鈣素（OC）等抗體（上海艾博抗有限公司）；蘇木素、伊紅（武漢博士得生物有限公司）；中性福爾馬林、酒精、二甲苯（天津科密歐有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗（美國Thermo公司）。

1.3 儀器 YLS-7C足趾容積測量儀（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）；BS-124s型電子天平（北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司）；415D 離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Dexa Pro-I X 線骨密度儀（徐州品源電子科技有限公司）；LD-66切片機(jī)（長沙益廣制藥機(jī)械公司）；SG-51 正顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（以色列DNR公司）。

1.4 分組與模型建立 將75 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)分組法將大鼠分為假手術(shù)組，模型組，雙氫青蒿素低、中、高劑量組，每組各15 只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均給予膠原誘導(dǎo)法構(gòu)建RA模型，造模方法和判斷造模是否成功的標(biāo)準(zhǔn)參考Fujii 等[9-10]研究。具體操作方法：用乙酸溶液溶解Ⅱ型膠原制成膠原溶液2 g/L，將等體積的膠原溶液和不完全弗氏佐劑充分乳化混勻至滴1滴乳劑于蒸餾水水面凝而不散時，示乳化劑配制成功。取400 μg 膠原乳化劑注射大鼠右足跖部皮下致炎，并于造模第14 天同法給予100 μg膠原乳化劑加強(qiáng)免疫。于造模第20 天，應(yīng)用相機(jī)拍照和X 射線拍攝觀察大鼠足跖部，以出現(xiàn)嚴(yán)重紅腫、連續(xù)低密度影及溶骨現(xiàn)象表明造模成功。

1.5 藥物干預(yù) 于初次免疫21 d，參考文獻(xiàn)[11]中的雙氫青蒿素給藥劑量進(jìn)行干預(yù)，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠分別對應(yīng)給予雙氫青蒿素6.25 、12.5、25 mg/kg（分別相當(dāng)于成人用藥劑量39.06、78.13、156.25 mg）灌胃處理，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥2周。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 大鼠骨指標(biāo)檢測 末次給藥后24 h脫頸處死大鼠，分離出脛骨，置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，依次進(jìn)行脫鈣、脫水處理，石蠟包埋、切片，應(yīng)用雙能X 線骨密度儀測量大鼠骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/total volume，BV/TV）、骨表面積/骨體積（bone surface/bone volume，BS/BV）、骨小梁厚度（trabecular bone thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular bone number，Tb.N）值。

1.6.2 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察 按“1.6.1”項方法制備踝關(guān)節(jié)組織切片，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)表現(xiàn)，阿利新藍(lán)染色法觀察踝關(guān)節(jié)軟骨組織蛋白多糖的表達(dá)，采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法觀察踝關(guān)節(jié)骨組織破骨細(xì)胞情況[12]。

1.6.3 ELISA 法檢測外周血中炎癥因子TNF-α、IL-17、IL-23和IL-10的含量 處死大鼠后，前頸動脈采血0.5 mL，以1 200 r/min 4 ℃離心10 min，收集上清液。具體操作方法嚴(yán)格按照TNF-α、IL-17、IL-23、IL-10 等ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.4 蛋白免疫印跡法檢測踝關(guān)節(jié)組織Osx、COL1A1、OC的表達(dá) 末次給藥后24 h脫頸處死大鼠，取踝關(guān)節(jié)置于液氮快速冷凍，制成踝關(guān)節(jié)勻漿，提取總蛋白并調(diào)節(jié)各組蛋白濃度相同，依次進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白、轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜、以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h、Osx（1∶500）4 ℃孵育過夜、二抗孵育2 h、顯影曝光等步驟。最后應(yīng)用ImageJ 軟件分析目標(biāo)蛋白條帶灰度值。COL1A1、OC等指標(biāo)的檢測方法同上。

1.6.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測踝關(guān)節(jié)組織骨吸收功能相關(guān)基因OSCA、TRAP 的表達(dá)情況 取大鼠踝關(guān)節(jié)標(biāo)本，切片機(jī)切碎后使用胰蛋白酶消化，使用TRIzol 試劑提取總RNA，測定RNA 濃度和純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5 min，95 ℃10 s、65 ℃30 s、72 ℃1 min 進(jìn)行40 個循環(huán)。具體步驟按照試劑盒方法操作。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，以GADPH 為內(nèi)參。OSCAR上游引物序列為5’-TGTTGGCTGCC GCTCACTTTG-3’，下游引物序列為5’-GACGCT GCTCGCTCCATTCAC-3’；TRAP 上游引物序列為5’- CTGTGCTCTGCGGTCTCA-3’，下游引物序列為5’-TTCGTCGTCCCATCAGTC-3’；GADPH 上游引物序列為5’-CTCAGACACCATGGGGAGGTGA-3’，下游引物序列為5’-ATGATCTTGAGGCTGTT GTCATA-3’。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 5 軟件作圖。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD 法。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨指標(biāo)水平比較 圖1 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量顯著降低，骨表面積/骨體積顯著升高（均P ＜0.05）；與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量升高，骨表面積/骨體積降低，且呈劑量依賴性，其中雙氫青蒿素中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。

2.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)表現(xiàn)比較 圖2 結(jié)果顯示：從HE染色結(jié)果可見，假手術(shù)組大鼠踝關(guān)節(jié)無炎癥和軟骨損傷，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤，軟骨損傷嚴(yán)重，使用低、中、高劑量的雙氫青蒿素處理后大鼠踝關(guān)節(jié)炎性浸潤顯著改善，滑膜增生得到了顯著的改善。從阿利新藍(lán)染色結(jié)果可見，假手術(shù)組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨組織蛋白多糖有較強(qiáng)表達(dá)，模型組大鼠軟骨組織基本無蛋白多糖表達(dá)，使用低、中、高劑量的雙氫青蒿素處理后大鼠軟骨組織中蛋白多糖表達(dá)顯著增加。從TRAP染色結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)骨組織破骨細(xì)胞明顯增多，使用低、中、高劑量的雙氫青蒿素處理后大鼠踝關(guān)節(jié)骨組織破骨細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯減少。

圖1 各組大鼠骨指標(biāo)水平比較

Figure 1 Comparison of the levels of bone indexes in rats of various groups

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)表現(xiàn)比較（×400）Figure 2 Comparison of the pathological features of rat ankle tissue in various groups（×400）

2.3 各組大鼠外周血中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-17、IL-23 和IL-10 含量比較 圖3 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠外周血中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-17、IL-23和IL-10含量均顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠外周血中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-17、IL-23含量降低，IL-10含量升高，且呈劑量依賴性，其中雙氫青蒿素中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。

圖3 各組大鼠外周血中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-17、IL-23和IL-10表達(dá)水平比較Figure 3 Comparison of the levels of inflammation-related factor TNF-α，IL-17，IL-23，IL-10 in rat peripheral blood of various groups

2.4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織成骨標(biāo)記物Osx、COL1A1、OC 表達(dá)情況比較 圖4 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織Osx、COL1A1、OC 的相對表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05）；與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)組織Osx、COL1A1、OC 的相對表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性，其中雙氫青蒿素中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。

2.5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織骨吸收功能相關(guān)基因OSCAR、TRAP 表達(dá)情況比較 圖5 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織OSCAR、TRAP mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)組織OSCAR、TRAP mRNA 表達(dá)水平均降低，且呈劑量依賴性，其中雙氫青蒿素中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。

圖5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織骨吸收功能相關(guān)基因OSCAR、TRAP表達(dá)情況比較Figure 5 Comparison of the expression levels of bone resorption function-related gene OSCAR，TRAP in rat ankle tissue of various groups

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受多種因素的影響，這些因素導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)失衡和過度的炎癥反應(yīng)，從而引起關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞。骨體積分?jǐn)?shù)（骨體積/總量）、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量主要反映骨組織的密度[13-15]。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量均顯著降低，骨表面積/骨體積顯著升高（均P ＜0.05）；從HE 染色結(jié)果可見，滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤，軟骨損傷嚴(yán)重；從阿利新藍(lán)染色結(jié)果可見，軟組織基本無蛋白多糖表達(dá)，而經(jīng)雙氫青蒿素干預(yù)后上述情況均得到改善。表明雙氫青蒿素可顯著改善RA軟骨損傷情況并提高骨密度。

RA 滑膜組織中炎癥因子可通過刺激膠原酶和前列腺素E誘導(dǎo)損傷軟骨和骨骼[16]。目前，研究較多的炎癥因子主要包括促炎癥因子和抑炎癥因子，其中，促炎癥因子主要由輔助性T淋巴（TH）1細(xì)胞分泌，主要包括TNF-α、IL-17、IL-23 等。抑炎癥因子主要由TH2 細(xì)胞分泌，主要包括IL-10、IL-4、IL-13等。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠外周血中炎癥相關(guān)因子TNFα、IL-17、IL-23 和IL-10 含量均顯著升高（P ＜0.05），而經(jīng)雙氫青蒿素干預(yù)可以調(diào)節(jié)上述趨勢，有效抑制促炎癥因子TNF-α、IL-17、IL-23 的升高，促進(jìn)抑炎癥因子IL-10的分泌，表明雙氫青蒿素可以改善大鼠滑膜組織炎癥反應(yīng)。

RA 發(fā)病伴隨軟骨、骨質(zhì)損傷。Osx 為鋅指DNA結(jié)合蛋白，在骨組織發(fā)育中呈高表達(dá)，Osx缺失阻礙骨組織形成，是成骨細(xì)胞分化和骨形成過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子[17]。COL1A1 是主要由成骨細(xì)胞合成的1 型膠原蛋白，為骨基質(zhì)組成成分，COL1A1可促進(jìn)膠原成熟、成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)礦物鹽沉積，加速骨組織形成[18]。OC 是由成骨細(xì)胞合成并分泌的骨鈣素，是成熟骨細(xì)胞的主要標(biāo)志物，在成骨細(xì)胞分化、骨基質(zhì)礦化時水平升高[19]。本研究結(jié)果顯示，RA大鼠骨組織Osx、COL1A1和OC 水平顯著降低，而雙氫青蒿素干預(yù)可下調(diào)升高的Osx、COL1A1和OC水平，表明雙氫青蒿素可以促進(jìn)RA大鼠軟骨組織修復(fù)。

發(fā)生RA時，常伴隨著骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)重塑等過程，此過程涉及破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞，兩者分別吸收受損舊骨、形成新骨[20]。當(dāng)破骨細(xì)胞增多、成骨細(xì)胞減少，則會出現(xiàn)骨密度減少、關(guān)節(jié)炎的現(xiàn)象[21]。OSCAR 是破骨細(xì)胞相關(guān)受體，其水平與破骨細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，當(dāng)OSCAR 水平升高時破骨細(xì)胞數(shù)量增加，反之則是破骨細(xì)胞數(shù)量減少。TRAP 是抗酒石酸酸性磷酸酶，是破骨細(xì)胞的標(biāo)志酶，為破骨細(xì)胞所特有，當(dāng)TRAP表達(dá)缺乏或者過度時會出現(xiàn)骨硬化和骨質(zhì)疏松[22]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，RA 大鼠骨組織OSCAR mRNA、TRAP mRNA 相對表達(dá)水平顯著升高，且破骨細(xì)胞增多，而雙氫青蒿素干預(yù)后，OSCAR mRNA、TRAP mRNA相對表達(dá)水平顯著降低，且破骨細(xì)胞呈降低趨勢，表明雙氫青蒿素可以促進(jìn)RA大鼠軟骨生長。

綜上所述，雙氫青蒿素可以通過抑制Ⅱ型膠原誘導(dǎo)RA 大鼠炎癥反應(yīng)，促進(jìn)軟骨修復(fù)，改善RA。