解毒活血方治療冠心病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制研究

劉素麗， 吳輝， 黃龐寧， 陳秋岑

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）已成為當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康最常見的心血管疾病之一。根據(jù)《中國心血管病報(bào)告2018》[1]數(shù)據(jù)顯示，我國冠心病患者已逾1 100萬，加強(qiáng)冠心病的中醫(yī)藥防治研究意義重大。冠心病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”等病證范疇，其病位在心，涉及肝脾腎等臟，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛有氣虛、陽虛、陰虛，標(biāo)實(shí)有痰濁、血瘀、氣滯、寒凝等[2]?！梆龆尽薄岸攫觥辈C(jī)理論是闡釋冠心病發(fā)生發(fā)展的重要學(xué)說[3]。解毒活血方是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科經(jīng)驗(yàn)方，由黃芩、黃連、丹參、赤芍、川芎等中藥組成，具有清熱解毒、活血袪瘀功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、治療冠心病的作用[4]；黃連具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集等作用[5]；丹參具有抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善微循環(huán)等作用[6]；赤芍具有抗炎、抗凝、抗血栓等作用[7]；川芎具有減輕血管內(nèi)皮損傷等作用[8]?？梢姡舛净钛娇蓮亩嘀亟嵌?、多重作用途徑治療冠心病，但具體作用機(jī)制仍不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過數(shù)據(jù)挖掘及分析，探索中藥方劑有效成分與疾病的關(guān)系、展現(xiàn)藥物與疾病間作用機(jī)制的科學(xué)方法。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討解毒活血方治療冠心病的作用機(jī)制，以期為該方的臨床應(yīng)用及進(jìn)一步的藥理作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)和研究思路，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 解毒活血方活性成分及相應(yīng)靶標(biāo)的篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），依次輸入關(guān)鍵詞“黃芩”“黃連”“丹參”“赤芍”“川芎”，檢索收集解毒活血方的活性成分，以生物利用度（OB）＞30%且類藥性（DL）＞0.18 為條件，篩選出利用度及活性偏高的有效活性成分；并從該數(shù)據(jù)庫篩選出解毒活血方中所有中藥對應(yīng)的靶標(biāo)，與已篩選出的活性成分進(jìn)行對比，篩選出該活性成分對應(yīng)的靶標(biāo)。應(yīng)用通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）（http：// www.uniprot.org/uploadlists/），將獲得的藥物活性成分靶標(biāo)進(jìn)行通用名稱注釋。

1.2 冠心病靶標(biāo)的收集及解毒活血方活性成分與冠心病共同作用靶標(biāo)的獲取 借助GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）及在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/），依次輸入關(guān)鍵詞“coronary heart disease”“CHD”，檢索獲得冠心病相關(guān)靶標(biāo)，應(yīng)用Venny 2.1 軟件（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制解毒活血方活性成分靶標(biāo)與冠心病相關(guān)靶標(biāo)關(guān)系的韋恩圖。此交集中的靶標(biāo)，即活性成分與冠心病共同作用的靶標(biāo)。

1.3 構(gòu)建解毒活血方治療冠心病活性成分-共同作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)及共同作用靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò) 借助Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建解毒活血方治療冠心病活性成分-共同作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，將其互作關(guān)系進(jìn)行可視化。將共同作用靶標(biāo)借助STRING數(shù)據(jù)庫在線檢索（物種設(shè)為“Homo sapiens”），繪制成靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，獲取蛋白互作信息，操作過程中將“minimum required interaction score”設(shè)為“highest confidence（0.900）”，并將“display simplifications”設(shè)為“hide disconnected nodes in the network”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。利用R 語言軟件，根據(jù)靶標(biāo)鄰接節(jié)點(diǎn)的多少進(jìn)行排序，獲取核心作用靶點(diǎn)，選取數(shù)量排名前30 位的靶標(biāo)，并以柱狀圖形式展現(xiàn)。

1.4 靶標(biāo)的功能富集分析及相關(guān)通路的富集分析 借助R 語言利用Bioconductor 軟件（http：//www.bioconductor.org/install/），將解毒活血方活性成分與冠心病共同作用的靶行基因本體論（GO）生物功能富集分析，以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，并可視化。

2 結(jié)果

2.1 解毒活血方活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 借助TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B＞30%且DL＞0.18 為條件，篩選出解毒活血方中143 個(gè)活性成分，按OB大小降序排列，選取前20 個(gè)活性成分（見表1）列舉，并篩選出以上143 個(gè)活性成分對應(yīng)的相關(guān)靶標(biāo)，且在UniProt 數(shù)據(jù)庫中找到其相應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行通用名注釋（若未找到相應(yīng)靶標(biāo)，則刪除），共220 個(gè)。

2.2 冠心病相關(guān)靶標(biāo)收集及解毒活血方活性成分與冠心病共同作用靶標(biāo)的獲取 借助GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫篩選冠心病相關(guān)靶點(diǎn)，共10 717 個(gè)，應(yīng)用Venny 2.1 軟件，繪制解毒活血方活性成分靶標(biāo)與冠心病相關(guān)靶標(biāo)關(guān)系的韋恩圖（見圖1），獲得204個(gè)共同作用靶標(biāo)。

2.3 構(gòu)建解毒活血方治療冠心病活性成分-共同作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)及共同作用靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò) 借助Cytoscape 3.7.2 軟件將143 個(gè)活性成分與204 個(gè)共同作用靶標(biāo)的互作關(guān)系以網(wǎng)絡(luò)圖形式進(jìn)行可視化（見圖2），其中外圈三角形節(jié)點(diǎn)代表共同作用靶標(biāo)，內(nèi)圈正方形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，中間菱形節(jié)點(diǎn)代表解毒活血方，圓形節(jié)點(diǎn)代表冠心病，邊（節(jié)點(diǎn)之間的連線）代表節(jié)點(diǎn)之間的互作關(guān)系。從圖2可見，一個(gè)活性成分可作用多個(gè)靶標(biāo)，多個(gè)活性成分可作用一個(gè)靶標(biāo)。

圖1 解毒活血方活性成分靶標(biāo)與冠心病相關(guān)靶標(biāo)的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the targets of the active ingredients of Removing Toxins to Activate Blood Recipe and the targets of coronary heart disease

圖2 解毒活血方治療冠心病活性成分-共同靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Active ingredient-common target interaction network of Removing Toxins to Activate Blood Recipe

按照鏈接靶標(biāo)數(shù)量降序排列，解毒活血方治療冠心病前5位的活性成分主要有槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、丹參酮iia、黃芩素等；按照鏈接活性成分?jǐn)?shù)量降序排列，解毒活血方治療冠心病前5 位的主要靶標(biāo)有PTGS2、PTGS1、SCN5A、NCOA2、ADRB2。將共同作用靶標(biāo)，借助STRING數(shù)據(jù)庫，繪制靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)（見圖3），共顯示177 個(gè)靶標(biāo)（數(shù)據(jù)庫中未找到及離散的靶標(biāo)均不顯示），節(jié)點(diǎn)代表靶標(biāo)，邊代表靶標(biāo)互作關(guān)系。

利用R 語言軟件，根據(jù)靶標(biāo)鄰接節(jié)點(diǎn)的多少進(jìn)行排序，獲取核心靶標(biāo)，選取數(shù)量排名前30 位的靶標(biāo)，包括STAT3、JUN、AKT1、MAPK1、APP等，以柱狀圖（見圖4）形式展現(xiàn)。

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路的富集分析 借助R語言利用Bioconductor軟件對共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，運(yùn)行過程中以P＜0.05 為篩選條件。得到GO 分析結(jié)果184 個(gè)，選取前20位以氣泡圖（見圖5）形式進(jìn)行可視化?？梢娊舛净钛街委煿谛牟〉纳镞^程主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合、核受體的活性、G 蛋白偶聯(lián)受體活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結(jié)合等方面。

得到KEGG分析結(jié)果165個(gè)，選取前20位以氣泡圖（見圖6）形式進(jìn)行可視化?？梢娊舛净钛街委煿谛牟〉腒EGG 通路有磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）-蘇氨酸激酶（Akt）信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、高級(jí)糖化終產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素17（IL-17）信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路等。

圖3 共同作用靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of the common targets

圖4 鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)排名前30位的核心靶標(biāo)Figure 4 The top 30 targets based on the number of adjacent nodes

圖5 解毒活血方對冠心病作用的前20位GO功能富集分析結(jié)果Figure 5 The top 20 of GO biological process enrichment analysis results for effects of Removing Toxins to Activate Blood Recipe on coronary heart disease

圖6 解毒活血方對冠心病作用的前20位KEGG通路富集分析結(jié)果Figure 6 The top 20 of KEGG pathway enrichment analysis results for effects of Removing Toxins to Activate Blood Recipe on coronary heart disease

3 討論

冠心病的主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，在目前有關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的學(xué)說中，炎癥反應(yīng)學(xué)說已得到公認(rèn)[9]，炎癥反應(yīng)參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及斑塊破裂、血栓形成等整個(gè)病理進(jìn)程[10-12]。結(jié)合該炎癥機(jī)制學(xué)說，本課題組針對動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病提出了中醫(yī)“毒瘀”病機(jī)學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的各種致病因素如氧化低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、毒性氧自由基、凝血/纖溶產(chǎn)物和炎性細(xì)胞因子等，相當(dāng)于中醫(yī)之“毒邪”，其損傷血管內(nèi)皮并進(jìn)入內(nèi)膜而啟動(dòng)血管壁內(nèi)的炎癥反應(yīng)，相當(dāng)于“毒邪入侵”，“毒邪”稽留不去蘊(yùn)久化熱，可致毒結(jié)致瘀等病理改變，這些與炎癥激活、斑塊形成、斑塊潰爛/出血、血栓形成等一系列病理改變相關(guān)聯(lián)，此即“毒損脈絡(luò)”之過程。在該病機(jī)學(xué)說指導(dǎo)下，本課題組以解毒活血方為基礎(chǔ)，針對解毒活血法治療冠心病的臨床療效及機(jī)制進(jìn)行了許多有益探索：臨床研究表明，運(yùn)用解毒活血方治療非ST 段抬高急性冠狀動(dòng)脈綜合征（NSTEACS），可顯著改善該類患者臨床癥狀，下調(diào)血清CD40、核因子kappaB（NF-κB）的表達(dá)，提示解毒活血方治療冠心病可能與其抗炎機(jī)制相關(guān)[13]；早期基礎(chǔ)研究顯示，解毒活血方可預(yù)防兔動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的形成，降低易損斑塊內(nèi)及血清TNF-α、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）表達(dá)，抑制易損斑塊底部和肩部的炎癥，調(diào)節(jié)血脂，從而穩(wěn)定斑塊[14-15]?；诖耍M(jìn)一步探索解毒活血方抗冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及穩(wěn)定斑塊的機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，解毒活血方防治冠心病是多成分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制的綜合過程。根據(jù)GO及KEGG 富集分析結(jié)果，其生物過程與細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合、核受體的活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結(jié)合等密切相關(guān)，解毒活血方干預(yù)冠心病涉及的信號(hào)通路主要包括PI3K-Akt 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞因子有介導(dǎo)炎癥、增加血小板數(shù)目及活性等作用，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成、增加粥樣斑塊的不穩(wěn)定性、促進(jìn)冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成和痙攣等，與冠心病密切相關(guān)[16]；膽紅素是一種具有天然抗氧化的四吡咯色素，血紅蛋白的降解為其形成的主要途徑，通過防止LDL-C的氧化修飾而防止動(dòng)脈粥樣硬化的形成[17]；核受體及其配體可參與調(diào)節(jié)血糖、血脂[18]，而血糖、血脂代謝異常是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；PI3K-Akt 通路與炎癥介導(dǎo)、心肌細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮再生等有關(guān)，與冠心病關(guān)系密切相關(guān)[19]；流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關(guān)[20]；HIF-1能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、增殖、血管生成和炎癥，通過多種途徑在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮作用[21]；AGE-RAGE 的激活可以誘導(dǎo)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致炎癥增加、氧化應(yīng)激、鈣沉積增加和血管平滑肌細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，AGE-RAGE 可能是通過這些機(jī)制成為冠心病發(fā)展的重要媒介[22]。

綜上所述，我們認(rèn)為解毒活血方治療冠心病主要與其參與調(diào)控的炎癥介質(zhì)、動(dòng)脈粥樣硬化形成、血栓形成、血管內(nèi)皮損傷、血管平滑肌收縮、調(diào)節(jié)心率等有關(guān)，尤其與參與調(diào)控細(xì)胞因子及PI3K-Akt 通路相關(guān)的炎癥介導(dǎo)、動(dòng)脈粥樣硬化形成、血栓形成、血管內(nèi)皮損傷等密切相關(guān)。而解毒活血方的應(yīng)用進(jìn)一步證實(shí)了“毒瘀互結(jié)”與冠心病的密切相關(guān)性，并證明了解毒活血法是用于治療冠心病重要法則之一。另外值得關(guān)注的是，解毒活血方干預(yù)冠心病涉及的AGE-RAGE 信號(hào)通路在冠心病的病理生理機(jī)制中扮演著重要的角色，作為重要的心臟代謝危險(xiǎn)因素[23]，因此我們提出在下一步應(yīng)用解毒活血方對冠心病的防治研究中，對AGE-RAGE信號(hào)通路的研究應(yīng)有所側(cè)重。