不同抗性棉花品種PR基因響應(yīng)大麗輪枝菌的表達分析

何芳，孫琦，李彪，劉政，黃家風

(石河子大學農(nóng)學院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室，新疆 石河子832003)

大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的棉花黃萎病是當前威脅我國棉花生產(chǎn)最主要的病害，每年在發(fā)病嚴重的地區(qū)造成棉花減產(chǎn)高達30%以上[1]。大麗輪枝菌沿植物根部維管組織向上侵染，其形成的微菌核在土壤中長期存活[2]，常規(guī)農(nóng)業(yè)防治和藥劑防治難以奏效，因此針對該病害的防治主要集中在選育和利用抗病品種上。目前推廣應(yīng)用的棉花品種抗黃萎病性能不斷提高，但是黃萎病依然發(fā)生嚴重，究其原因除了陸地缺乏棉抗黃萎病種質(zhì)資源外[3]，病原種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化也是一個重要因素[4]。一般認為棉花黃萎病菌落葉型致病力比非落葉型致病力強[4-5]，落葉型菌系呈現(xiàn)逐年增加趨勢，已逐步取代非落葉型菌系成為棉田的主要致病類型[4,6]。然而不同的棉花品種響應(yīng)大麗輪枝菌的侵染是否存在差異尚不清楚。

植物與病原互作中，植物為抵御病原物侵染，通過細胞膜上的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)識別病原物相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)觸發(fā)基礎(chǔ)免疫反應(yīng)[7-8]，如氣孔關(guān)閉、活性氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)沉積以及病程相關(guān)(Pathogenesis related，PR)基因的表達等，以達到抑制病原物生長,實現(xiàn)植物對病原物的防御[9-10]。植物的PR基因既能響應(yīng)生物脅迫也能響應(yīng)非生物脅迫[11-12]，其編碼的PR蛋白在植物體外表現(xiàn)出潛在的抗菌活性，在植物體內(nèi)的積累與植物的抗性反應(yīng)密切相關(guān)[11]。根據(jù)來源植物、電泳遷移率、氨基酸序列的同源性和生化功能等特性，PR蛋白基因分為17個家族[12-13]。PR1是第1個被發(fā)現(xiàn)的多基因家族，表達PR1基因的轉(zhuǎn)基因煙草和番茄可明顯增強對卵菌和真菌的抵抗能力[14-15]，并且PR1基因已被廣泛用于過敏性反應(yīng)(HR)介導(dǎo)的防御途徑和水楊酸介導(dǎo)的抗性反應(yīng)被激活的指示基因[16]。PR2基因家族編碼β-1,3葡聚糖酶，能催化降解病原真菌細胞壁中的β-1，3葡聚糖成分[17]。PR3、PR4、PR8、PR11基因家族編碼幾丁質(zhì)酶，能夠降解病原真菌細胞壁中的幾丁質(zhì)成分[17-20]。PR5基因家族編碼的蛋白包括 permatins、zeamatins、osmotins和類甜蛋白(thaumamatin like proteins，TLP)，具抗真菌活性[21]，分別過表達煙草和茶樹TLP基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯均表現(xiàn)明顯的抗真菌特性[22-23]。PR6基因家族編碼蛋白酶抑制劑(PI)，其靶標是昆蟲和微生物的蛋白酶，體內(nèi)過表達PR6基因的擬南芥和煙草能增強對灰霉菌的抗性[11,24]。PR7基因編碼的蛋白最早從番茄中提純獲得，是由柑橘裂皮類病毒(Citrusexocortisviroid)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種胞內(nèi)蛋白酶[25]。PR9基因家族編碼過氧化物酶是細胞壁構(gòu)建過程中的關(guān)鍵酶，當植物遭受病原物侵染時，PR9蛋白通過促進木質(zhì)素沉積，增加細胞壁機械性能以抵御病原物入侵[26]。PR10基因家族編碼的蛋白具有核酸酶活性，如甜椒CaPR10基因受煙草花葉病毒(TMV)誘導(dǎo)表達產(chǎn)生的核酸酶，通過降解病毒核酸使甜椒具有更強的抗病毒能力[27]，此外，PR10蛋白還具有配體結(jié)合特性和翻譯后修飾等功能[21]。PR12基因家族編碼植物防御素，通過抑制真菌生長使植物具有抗真菌特性，如過表達蘿卜防御素基因的轉(zhuǎn)基因煙草對長柄鏈格孢產(chǎn)生抗性[11,28]。PR13基因家族編碼硫素蛋白，異源表達擬南芥硫素基因的轉(zhuǎn)基因番茄和異源表達大麥硫素基因的轉(zhuǎn)基因煙草分別對鐮刀菌和丁香假單胞菌產(chǎn)生抗性，表明硫素蛋白對植物病原真菌和細菌都具有抗菌活性[29-30]。PR14基因家族編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(LTPs)，功能包括角質(zhì)素合成、生物氧化、植物系統(tǒng)獲得抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、以及抗真菌和細菌活性；異源表達大麥LTP基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥對丁香假單胞菌和灰霉菌都能產(chǎn)生抗性[11,31]。PR15和PR16基因編碼的蛋白都具有草酸氧化酶活性，在大麥受白粉菌侵染時誘導(dǎo)表達，并通過產(chǎn)生過氧化氫參與植物防御反應(yīng)[32-33]。PR17基因受病原物誘導(dǎo)表達并能與病原物效應(yīng)子直接互作，如煙草NtPRp27基因和小麥WCI-5基因分別受TMV和小麥白粉病菌誘導(dǎo)表達并積累[34-35]，大麥HvPR-17c通過與布氏白粉病菌(Blumeriagraminis)的效應(yīng)子互作阻止病原菌侵染[36]。

杜旋等[37]研究發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌 PAMP誘導(dǎo)處理后GhPR基因普遍上調(diào)表達，但是對于不同抗性陸地棉品種受大麗輪枝菌侵染以及同一個抗性品種受不同致病型大麗輪枝菌誘導(dǎo)后，14個GhPR基因表達是否存在差異，目前尚未明確。本文研究抗、感病棉花品種中GhPR基因響應(yīng)寄主和非寄主來源的落葉型和非落葉型大麗輪枝菌的表達差異，為進一步揭示棉花-大麗輪枝菌互作機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的大麗輪枝菌菌株共有4種，其中棉花黃萎病菌落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6均分離自新疆棉花(棉區(qū)栽培品種)，由本實驗室分離保存；非落葉型菌株V31分離自寧波茄子，由寧波動植物出入境檢驗檢疫局段維軍惠贈；落葉型菌株S1分離自內(nèi)蒙古向日葵，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學景嵐教授惠贈。以上供試菌株的致病力和致病型均得到驗證[38]。

1.2 供試棉花品種

高感黃萎病品種為新陸早1號和軍棉1號，抗黃萎病棉花品種為中植棉2號。

1.3 無菌棉苗的培育

挑選脫絨后籽粒飽滿的棉花種子，剝?nèi)シN皮，用0.1%升汞消毒20 min，期間多次震蕩混勻，無菌水沖洗5或6遍，放入MS培養(yǎng)基中，28 ℃暗培養(yǎng)，3 d后長出的無菌棉苗扶正，放入盛有無菌水小燒杯，再轉(zhuǎn)入大燒杯中封口，28 ℃光照培養(yǎng)備用。

1.4 大麗輪枝菌對棉苗根部的處理

將PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌株用10 mm打孔器取10塊菌餅，放入Czapek-Dox培養(yǎng)基中26 ℃，200 r/min搖培 3 d，4層紗布過濾收集真菌的分生孢子，用無菌水調(diào)整孢子濃度至107cfu/mL。在含200 mL無菌水培養(yǎng)的棉苗中加入1 mL孢子懸浮液，然后分別在接種3、6、12 h剪下棉花根系，無菌水沖洗后液氮速凍保存或直接進行RNA提取。以無菌水處理的棉花作為陰性對照。每一處理3次重復(fù)。

1.5 棉花根組織總RNA提取和實時定量PCR(RT-qPCR)分析

利用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取棉花根組織總RNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆?，每個材料取3株樣品；利用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)系統(tǒng)對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，然后利用PowerUp SYBR Green Master Mix(Life Technologies)試劑盒和7500 Real Time PCR System(Life Technologies)系統(tǒng)對目標基因GhPR的轉(zhuǎn)錄表達通過qPCR進行測定。所用引物見表1，以Ghactin基因(DQ266153)作為內(nèi)參基因[37]對目標基因的轉(zhuǎn)錄水平進行標準化；將無菌水處理對照棉花的GhPR基因表達水平設(shè)為1，將標準化的GhPR基因表達水平與對照GhPR基因表達水平進行比較，獲得各個GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的相對表達量；每個樣品設(shè)3個重復(fù)。qPCR反應(yīng)程序為95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；40 cycles。

表1 檢測陸地棉GhPRs基因轉(zhuǎn)錄表達所用引物[37]

根據(jù)2-ΔΔCt方法對數(shù)據(jù)進行處理，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病棉花品種GhPR基因響應(yīng)棉花黃萎病菌的表達分析

研究感病棉花品種的GhPR基因響應(yīng)不同致病型大麗輪枝菌的表達差異中，數(shù)據(jù)采用Dunnett法進行顯著性差異檢驗(**P<0.01)，誤差線表示3個重復(fù)的標準誤差。首先用棉花黃萎病菌的落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6對感病品種軍棉1號進行誘導(dǎo)處理，結(jié)果見圖1。

圖1 V592和I6菌株誘導(dǎo)處理感病品種軍棉1號后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達情況

圖1顯示：V592菌株誘導(dǎo)9個GhPR基因上調(diào)表達，I6菌株誘導(dǎo)11個GhPR基因上調(diào)表達，多數(shù)GhPR基因在3 h即出現(xiàn)上調(diào)表達，并持續(xù)至6 h或12 h。比較2個菌株誘導(dǎo)的每個GhPR基因的最高相對表達量可知：落葉型菌株V592在3 h誘導(dǎo)GhPR5、GhPR10、GhPR11基因和12 h誘導(dǎo)GhPR15、GhPR16和GhPR17基因的相對表達量達到最大，分別是陰性對照的42.9倍、5.7倍、10.1倍、100.9倍、269.8倍和103.5倍；而I6菌株在3 h誘導(dǎo)GhPR5基因、12 h誘導(dǎo)GhPR10、GhPR11、GhPR15、GhPR16和GhPR17基因的最大相對表達量分別是陰性對照的14.8倍、3.6倍、5.3倍、13.1倍、69.4倍和11.8倍，明顯低于V592誘導(dǎo)處理后的表達量，表明落葉型菌株V592誘導(dǎo)這 6個基因上調(diào)表達的程度比非落葉型菌株I6強。然而經(jīng)I6菌株誘導(dǎo)處理，GhPR1、GhPR4、GhPR8、GhPR9和GhPR145個基因分別在3 h、12 h、12 h、6 h和12 h時相對表達量達到最高，分別是陰性對照的17.2倍、204.3倍、272.4倍、11.1倍和5.1倍，明顯高于經(jīng)V592菌株誘導(dǎo)處理后的表達量，V592菌株誘導(dǎo)GhPR1、GhPR4和GhPR8基因的最高相對表達量分別是陰性對照的2.5倍(3 h)、173.6倍(12 h)和99.5倍(12 h)，而GhPR9和GhPR14基因受V592菌株誘導(dǎo)并不表現(xiàn)上調(diào)表達，表明非落葉型菌株I6誘導(dǎo)GhPR1、GhPR4、GhPR8、GhPR9和GhPR145個基因上調(diào)表達的程度比落葉型菌株V592強。上述結(jié)果表明，在棉花感病品種軍棉1號上，棉花黃萎病菌落葉型菌株和非落葉型菌株均能誘導(dǎo)不同的GhPR基因上調(diào)表達，但2種致病型黃萎病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達的GhPR基因個數(shù)及表達量存在差異。

再用V592菌株和I6菌株對感病品種新陸早1號進行誘導(dǎo)處理，結(jié)果見圖2。

圖2 V592和I6菌株誘導(dǎo)處理感病品種新陸早1號后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達情況

圖2顯示：落葉型菌株V592誘導(dǎo)7個GhPR基因上調(diào)表達，非落葉型菌株I6誘導(dǎo)10個GhPR基因上調(diào)表達。對2個菌株誘導(dǎo)的每個GhPR基因的最高相對表達量進行比較可知：落葉型菌株V592在12 h誘導(dǎo)GhPR5和GhPR10基因、6 h誘導(dǎo)GhPR11基因的最大相對表達量分別是陰性對照的55.3倍、37.4倍和89.1倍；而I6菌株在12 h誘導(dǎo)GhPR5和GhPR10基因、6 h誘導(dǎo)GhPR11基因的最高相對表達量分別是對照的4.5倍、2.1倍和2.6倍，明顯低于V592誘導(dǎo)處理后的表達量，表明在感病品種新陸早1號上，落葉型菌株V592誘導(dǎo)這3個基因上調(diào)表達的程度比非落葉型菌株I6強。然而經(jīng)I6菌株誘導(dǎo)處理，GhPR8、GhPR15和GhPR17基因分別在12、6、12 h時相對表達量達到最高，分別是對照的20.1倍、7.6倍和15.2倍，明顯高于V592菌株對這3個基因的誘導(dǎo)表達，V592菌株均在12 h誘導(dǎo)GhPR8、GhPR15和GhPR17基因達到最大相對表達量，分別是對照的4.5倍、5.3倍和2.5倍。I6在12 h誘導(dǎo)GhPR1基因、3 h誘導(dǎo)GhPR14基因、12 h誘導(dǎo)GhPR16基因的最大相對表達量分別是對照的4.3倍、8.4倍和69.4倍，而這3個基因均不受V592菌株誘導(dǎo)表達。因此在感病品種新陸早1號上，非落葉型菌株I6誘導(dǎo)GhPR1、GhPR8、GhPR14、GhPR15、GhPR16和GhPR176個基因上調(diào)表達的程度比落葉型菌株V592強。

上述結(jié)果表明：在棉花感病品種新陸早1號上，棉花黃萎病菌落葉型菌株V592誘導(dǎo)上調(diào)表達的GhPR基因總數(shù)及相對表達量達到最大的GhPR基因數(shù)都沒有I6菌株誘導(dǎo)的GhPR基因多。

2.2 抗病棉花品種GhPR基因響應(yīng)棉花黃萎病菌的表達分析

為了研究抗病棉花品種的GhPR基因響應(yīng)不同致病型大麗輪枝菌的表達差異，用落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6對抗病品種中植棉2號進行誘導(dǎo)處理，結(jié)果見圖3。

圖3 V592和I6菌株誘導(dǎo)處理抗病品種中植棉2號后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達情況

圖3顯示:V592菌株誘導(dǎo)9個GhPR基因上調(diào)表達，不誘導(dǎo)GhPR7、GhPR9和GhPR11基因表達；I6菌株誘導(dǎo)11個GhPR基因上調(diào)表達，不誘導(dǎo)GhPR9基因表達。對2個菌株誘導(dǎo)的每個GhPR基因的最高相對表達量進行比較可知：雖然I6菌株可誘導(dǎo)11個GhPR基因上調(diào)表達，但每個基因上調(diào)表達的幅度不大，其中GhPR16基因上調(diào)幅度最高，12 h時其最高相對表達量是對照的22.6倍，GhPR5基因上調(diào)幅度最低，12 h時其最高相對表達量是對照的2.5倍。然而V592菌株誘導(dǎo)上調(diào)表達的9個基因，其中8個基因均在誘導(dǎo)6 h時相對表達量達到最高，與陰性對照相比，每個GhPR基因的上調(diào)表達幅度顯著增高，如GhPR5和GhPR16基因的最高相對表達量分別是對照的1928.5倍和1407.3倍，遠遠高于I6菌株誘導(dǎo)GhPR5和GhPR16基因最高相對表達量分別是對照的2.5倍和22.6倍；V592菌株誘導(dǎo)GhPR8、GhPR14和GhPR15基因的最高相對表達量分別是對照的359.4倍、489.8倍和394.7倍；GhPR4、GhPR10和GhPR17基因的最高相對表達量分別是對照的178.1倍、192.6倍和118.7倍；GhPR1基因上調(diào)表達的幅度最小，3 h時其最高相對表達量也是對照的75.9倍。

綜上可知：在棉花抗病品種中植棉2號上，落葉型菌株V592誘導(dǎo)9個GhPR基因上調(diào)表達的程度明顯比非落葉型菌株I6強，且GhPR基因上調(diào)表達的幅度顯著增強。

2.3 感病棉花品種GhPR基因響應(yīng)非寄主來源大麗輪枝菌的表達分析

為了明確感病棉花品種的GhPR基因響應(yīng)非寄主作物來源大麗輪枝菌的表達差異，分別用分離自向日葵的落葉型菌株S1和茄子上的非落葉型菌株V31誘導(dǎo)處理感病棉花品種軍棉1號，結(jié)果見圖4。

圖4 其他寄主來源的大麗輪枝菌誘導(dǎo)處理感病品種軍棉1號后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達情況

圖4顯示：S1和V31菌株均誘導(dǎo)10個GhPR基因上調(diào)表達。比較2個菌株誘導(dǎo)的每個GhPR基因的最高相對表達量可知：落葉型菌株S1在6 h誘導(dǎo)GhPR11和GhPR15基因、12 h誘導(dǎo)GhPR14和GhPR17基因上調(diào)表達幅度最大，其最高相對表達量分別是對照的198.6倍、17.4倍、18.9倍和20.5倍；而V31誘導(dǎo)這4個基因的最大相對表達量分別是對照的2.2倍、3.7倍、2.7倍和6.7倍，因此S1誘導(dǎo)GhPR11、GhPR15、GhPR14和GhPR174個基因達到的最高相對表達量明顯高于V31誘導(dǎo)的表達量。非落葉型菌株V31在3h誘導(dǎo)GhPR9基因、6h誘導(dǎo)GhPR4、GhPR5、GhPR8、GhPR10和GhPR16基因上調(diào)表達的最大相對表達量分別是對照的19.3倍、28.5倍、46.2倍、23.2倍、15.0倍和28.7倍，明顯高于S1誘導(dǎo)這6個基因在不同時段的最高相對表達量，S1誘導(dǎo)GhPR9、GhPR4、GhPR5、GhPR8、GhPR10和GhPR166個基因的最大相對表達量分別是對照的1.8倍、3.2倍、12.0倍、2.4倍、6.0倍和14.8倍。

再用非寄主作物作物來源的2個菌株誘導(dǎo)處理感病品種新陸早1號，結(jié)果(圖5)顯示：S1菌株誘導(dǎo)11個GhPR基因上調(diào)表達，不誘導(dǎo)GhPR5基因上調(diào)表達；V31菌株誘導(dǎo)12個GhPR基因上調(diào)表達。比較各菌株誘導(dǎo)的每個GhPR基因的最高相對表達量可知：S1菌株誘導(dǎo)5個GhPR基因的上調(diào)表達量明顯高于V31菌株，即S1菌株在12h誘導(dǎo)GhPR4基因、6h誘導(dǎo)GhPR1、GhPR9、GhPR10和GhPR15基因上調(diào)表達幅度最大，其最高相對表達量分別是對照的20.7倍、38.0倍、38.0倍、38.0倍和19.6倍；而V31誘導(dǎo)這5個基因達到的最高相對表達量分別是對照的17.4倍、6.2倍、31.8倍、3.4倍和11.1倍。V31菌株誘導(dǎo)7個GhPR基因的上調(diào)表達量明顯高于S1菌株，即V31菌株在6h誘導(dǎo)GhPR5、GhPR7和GhPR14基因、12h誘導(dǎo)GhPR8、GhPR11和GhPR16基因、3h誘導(dǎo)GhPR17基因上調(diào)表達幅度最大，其最高相對表達量分別是對照的4.5倍、7.4倍、15.0倍、137.6倍、14.4倍、152.2倍和9.1倍；而S1誘導(dǎo)這7個基因達到的最高相對表達量分別是對照的1.6倍、4.1倍、3.5倍、10.2倍、9.9倍、54.8倍和7.7倍。

圖5 其他寄主來源的大麗輪枝菌誘導(dǎo)處理感病品種新陸早1號后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達情況

上述結(jié)果表明：大麗輪枝菌非寄主作物來源的落葉型菌株S1和非落葉型菌株V31均可誘導(dǎo)感病品種軍棉1號和新陸早1號不同的GhPR基因上調(diào)表達，非落葉型菌株V31誘導(dǎo)GhPR基因達到最大相對表達量的基因個數(shù)比落葉型菌株S1誘導(dǎo)的多。

2.4 抗病棉花品種GhPR基因響應(yīng)非寄主來源大麗輪枝菌的表達分析

用非寄主作物來源的2個菌株誘導(dǎo)處理棉花抗病品種中植棉2號，結(jié)果(圖6)顯示：S1菌株和V31菌株均誘導(dǎo)12個GhPR基因上調(diào)表達。對2個菌株誘導(dǎo)的每個GhPR基因的最高相對表達量進行比較可知：S1菌株誘導(dǎo)9個GhPR基因的上調(diào)表達量明顯高于V31菌株，即S1菌株在3 h誘導(dǎo)GhPR4、GhPR14、GhPR15和GhPR174個基因上調(diào)表達的最高相對表達量分別是對照的186.0倍、36.9倍、31.5倍和14.4倍；12 h誘導(dǎo)GhPR1、GhPR8、GhPR9、GhPR10和GhPR115個基因上調(diào)表達的最高相對表達量分別是對照的40.6倍、7.6倍、8.5倍、22.2倍和174.8倍；V31誘導(dǎo)這9個基因達到的最高相對表達量分別是對照的8.5倍、21.2倍、3.1倍、1.9倍、13.1倍、3.7倍、1.5倍、5.4倍和14.4倍。而V31菌株僅誘導(dǎo)2個GhPR基因的最大相對表達量明顯高于S1菌株，即V31菌株在3 h誘導(dǎo)GhPR5和GhPR16基因上調(diào)表達的最高相對表達量分別是對照的6.7倍和32倍；S1誘導(dǎo)這2個基因達到的最高相對表達量分別是對照的5.8倍、6.2倍。

圖6 其他寄主來源的大麗輪枝菌誘導(dǎo)處理抗病品種中植棉2號后GhPR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達情況

上述結(jié)果表明，大麗輪枝菌非寄主作物來源的落葉型菌株S1和非落葉型菌株V31均可誘導(dǎo)抗病品種中植棉2號不同的GhPR基因上調(diào)表達，落葉型菌株S1誘導(dǎo)GhPR基因達到最大相對表達量的基因個數(shù)明顯多于V31菌株。

3 結(jié)論與討論

(1)在2個感病棉花品種上，寄主來源的落葉型和非落葉型黃萎病菌均能誘導(dǎo)GhPR基因普遍上調(diào)表達，而在感病品種軍棉1號上，2個菌株誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達的能力相當；在感病品種新陸早1號上，非落葉型菌株I6誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達的能力比落葉型菌株V592強，表明棉花感病品種的GhPR基因?qū)β淙~型和非落葉型黃萎病菌侵染均有一定的響應(yīng)能力。然而感病品種對2種致病類型黃萎病菌的侵染卻表現(xiàn)明顯不同的抗性反應(yīng)：對于非落葉型菌株的侵染表現(xiàn)一定的抗病性，如2000年以前，新疆棉區(qū)黃萎病菌以非落葉型菌系為主[39]，沒有落葉型黃萎病菌的發(fā)生，雖然當時種植的棉花品種多為感病品種，但棉花黃萎病發(fā)生并不嚴重，推測可能與非落葉型菌系能夠誘導(dǎo)感病品種不同的GhPR基因上調(diào)表達，誘導(dǎo)了植物免疫有關(guān)；盡管感病品種的GhPR基因?qū)β淙~型黃萎病菌也有一定的響應(yīng)能力，但是感病品種對于落葉型菌株的侵染卻表現(xiàn)高度敏感[38]，其原因是否與落葉型黃萎病菌比非落葉型黃萎病菌產(chǎn)生更多或更強的效應(yīng)子蛋白，能夠克服感病品種的免疫應(yīng)答有關(guān)，有待進一步研究。

(2)在棉花抗病品種中植棉2號上，落葉型菌株V592誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達的強度明顯比非落葉型菌株I6強，如V592誘導(dǎo)中植棉2號GhPR5和GhPR16基因的最高相對表達量分別是對照的1928.5倍和1407.3倍，表明棉花抗病品種的GhPR基因?qū)γ藁S萎病菌落葉型菌系具有更強的響應(yīng)能力。然而盡管目前推廣應(yīng)用的棉花品種抗病性不斷增強，但是近年棉花主產(chǎn)區(qū)黃萎病卻逐年加重，落葉型黃萎病菌已逐步取代非落葉型菌系成為棉田只要的致病類型[6]，說明隨著品種抗性的不斷增強，病原菌致病性與之協(xié)同進化也在不斷增強。有研究表明，大麥的HvPR17c(PR17蛋白)可以與布氏白粉病菌(Blumeriagraminis)的效應(yīng)子直接互作阻止病原菌侵染[36]；也有研究表明，棉花黃萎病菌產(chǎn)生的效應(yīng)子PevD1可以抑制GhPR5蛋白的抗真菌活性從而克服寄主的防御反應(yīng)[40]。雖然目前在棉花-黃萎病菌中沒有發(fā)現(xiàn)類似于番茄大麗輪枝菌1號生理小種AVe1基因誘導(dǎo)含Ve1基因的番茄產(chǎn)生抗病性的互作關(guān)系[41]，但是棉花抗病品種的GhPR基因響應(yīng)落葉型黃萎病菌表現(xiàn)強烈表達可能與落葉型黃萎病菌產(chǎn)生了更多有效的效應(yīng)子激活了寄主的抗性反應(yīng)有關(guān)，也可能與抗病品種中含有更可以多識別效應(yīng)子的抗病蛋白有關(guān)，但是GhPR蛋白-效應(yīng)子-抗病蛋白之間存在怎樣的互作關(guān)系有待深入研究。

用非寄主作物的2個大麗輪枝菌菌株分別處理2個感病棉花品種和1個抗病棉花品種，結(jié)果表明：非落葉型菌株V31誘導(dǎo)感病品種GhPR基因上調(diào)表達的能力比落葉型菌株S1強；落葉型菌株S1誘導(dǎo)抗病品種GhPR基因上調(diào)表達的能力明顯比V31菌株強。這與寄主來源的V592和I6菌株分別在抗病和感病品種上的誘導(dǎo)結(jié)果基本一致。從基因上調(diào)表達的幅度來看，在抗病品種上，非落葉型菌株I6和V31誘導(dǎo)GhPR基因表達的上調(diào)幅度都比較??；但是對于落葉型菌株，非寄主來源的S1菌株誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達幅度明顯低于寄主來源的V592。表明抗病品種GhPR基因響應(yīng)寄主來源落葉型菌株的能力比響應(yīng)非寄主來源落葉型菌株的能力強。

(3)杜旋等根據(jù)大麗輪枝菌壞死和乙烯誘導(dǎo)蛋白(necrosis and ethylene-inducing peptide 1-like protein，NLP)設(shè)計了3個多肽片段nlp20Vd2、nlp20Vd2和 nlp20Vd2作為PAMP分子誘導(dǎo)處理棉花感病品種新陸早6號，結(jié)果顯示，3個多肽片段都能誘導(dǎo)GhPR基因上調(diào)表達，除了nlp20Vd2誘導(dǎo)的2個GhPR基因上調(diào)幅度與對照相比分別達到13和16倍外，其他GhPRs基因的上調(diào)幅度與對照相比都在2～6倍之間[37]。而本研究直接用大麗輪枝菌處理棉花根系，非落葉型菌株誘導(dǎo)感病品種GhPR基因的上調(diào)幅度和落葉型菌株誘導(dǎo)抗病品種GhPR基因的上調(diào)幅度均普遍高于單個肽段誘導(dǎo)GhPR基因的上調(diào)幅度，尤其是落葉型菌株誘導(dǎo)抗病品種GhPR基因的上調(diào)幅度遠遠超過單個肽段誘導(dǎo)GhPR基因的上調(diào)幅度，這可能與大麗輪枝菌具更多的PAMP分子有關(guān)，因為除了NLP蛋白具有PAMP活性，植物病原真菌的幾丁質(zhì)寡糖、木聚糖酶、多聚半乳糖醛羧酶(PGs)都可作為PAMP分子觸發(fā)PTI[42]，激活包括PR基因表達在內(nèi)的植物免疫反應(yīng)。

(4)比較3個棉花品種響應(yīng)棉花黃萎病菌侵染，GhPR5、GhPR8、GhPR10、GhPR15、GhPR17這5個基因均表現(xiàn)明顯上調(diào)表達，且大多數(shù)在誘導(dǎo)處理 6 h時表達量達到最大，說明這5個基因可作為棉花響應(yīng)棉花黃萎病菌免疫反應(yīng)的指示基因，誘導(dǎo)處理6 h時為最佳測定時間；GhPR4、GhPR5、GhPR8、GhPR10、GhPR14、GhPR15、GhPR16和GhPR17均在誘導(dǎo)處理6 h時表達量最高，可作為抗病品種響應(yīng)落葉型黃萎病菌免疫反應(yīng)的指示基因。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，3個品種的GhPR2和GhPR3基因響應(yīng)大麗輪枝菌侵染均不表現(xiàn)明顯上調(diào)表達，有的甚至是下調(diào)表達，其原因有待進一步研究。