HCV單克隆抗體的制備及其應(yīng)用的初步研究

江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （江蘇 南京 210012）

內(nèi)容提要： 目的：丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）感染已成為全球公認(rèn)的健康難題，目前并沒(méi)有很好的疫苗和特效藥，盡早檢出HCV感染者是實(shí)現(xiàn)丙型肝炎早期診斷、阻斷傳播的重要途徑。方法：研究通過(guò)免疫Core-NS4B融合重組蛋白，制備抗HCV單克隆抗體，并獲得5H5和4E7-HRP最優(yōu)的抗體配對(duì)組合，檢測(cè)120例血清，同時(shí)與HCV-RNA檢測(cè)做比較。結(jié)果：陰性血清均未測(cè)出陽(yáng)性，HCV陽(yáng)性標(biāo)測(cè)出23例陽(yáng)性，檢出率77%，HCV-RNA測(cè)出26例，檢出率87%；HCV可疑標(biāo)本測(cè)出15例陽(yáng)性，HCV-RNA測(cè)出17例；單項(xiàng)ALT增高的標(biāo)本測(cè)出2例陽(yáng)性，HCV-RNA測(cè)出1例。結(jié)論：研究所獲得的抗體能夠用于HCV抗原檢測(cè)，具有巨大的潛力，為建立HCV抗原檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)，為臨床檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）屬黃病毒科，是一種主要經(jīng)過(guò)血液傳播的病毒，可引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌，感染后肝硬化發(fā)生率在20年內(nèi)達(dá)30%，30年內(nèi)達(dá)50%，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了極大危害。丙型肝炎（Hepatitis C，HC）呈世界性分布，全球約有近1.8億HCV感染者，每年新增300萬(wàn)到400萬(wàn)人，每年超過(guò)35萬(wàn)人因丙型肝炎相關(guān)疾病死亡，HCV感染已成為全球公認(rèn)的健康難題[1-4]。截至2015年，全球僅20%的慢性HCV感染者得到明確診斷，其中僅7.4%獲得治療[5]。中國(guó)屬于HCV的中流行區(qū)和高流行區(qū)，感染率約為3.2%[6]。

2016年5月28日，第69屆世界衛(wèi)生大會(huì)上世界衛(wèi)生組織（WHO）通過(guò)了《2016-2021年全球衛(wèi)生部門(mén)病毒肝炎戰(zhàn)略》[7]，即“至2030年消除病毒性肝炎的公共健康威脅”。2017年11月我國(guó)發(fā)布了《中國(guó)病毒性肝炎防治規(guī)劃（2017-2020年）》，并于提出了“至2030年徹底消除丙型病毒性肝炎”的政府承諾[8]?！笆濉逼陂g，丙肝高發(fā)地區(qū)的防治工作被列入國(guó)家重點(diǎn)攻關(guān)課題[9]。HCV核心抗原檢出時(shí)間早于抗體，縮短了檢測(cè)“窗口期”，可用于丙型肝較的早期診斷[10]。研究表明，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白4B（Nonstructural Protein 4B，NS4B）可能參與宿主細(xì)胞的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，干擾轉(zhuǎn)錄調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、惡化等過(guò)程[11]。本研究利用HCV核心抗原（Core）和NS4B融合表達(dá)構(gòu)建的Core-NS4B融合重組蛋白備抗HCV單克隆抗體，用所獲得抗體進(jìn)行配對(duì)并篩選，并對(duì)120份血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與HCV-RNA檢測(cè)方法做比較，為HCV臨床檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

雄性Balb/c小鼠（揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），Core-NS4B融合重組蛋白（本室構(gòu)建），HAT、HT、PEG 1500、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑（Sigma公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（北京碧云天生物技術(shù)有限公司），小鼠Sp2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞（本室保存），DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）、細(xì)胞培養(yǎng)板（NUNC公司），Protein A親和層析柱（GE），丙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（廣州達(dá)健生物科技），其他試劑均為分析純。96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板（Corning）、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Thermo）。

1.2 單克隆抗體的制備

1.2.1 動(dòng)物免疫

用Core-NS4B融合重組蛋白免疫5只6周齡雄性Balb/c健康小鼠。首次免疫用弗氏完全佐劑與Core-NS4B抗原溶液1:1混合乳化，在小鼠后頸背部多點(diǎn)注射，其中抗原用量為每只小鼠100μg。第2次免疫在2周后，弗氏不完全佐劑與與Core-NS4B抗原溶液1:1混合乳化，后頸背部多點(diǎn)注射。4周后做第3次免疫，再次頸背部多點(diǎn)注射。5周后，用間接ELISA法測(cè)小鼠血清抗Core-NS4B效價(jià)，在其中挑選1只免疫情況最好的小鼠，在準(zhǔn)備融合的前3d加強(qiáng)免疫，方法：腹腔注射抗原液100μg。

1.2.2 間接ELISA方法的建立

以免疫小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，SP2/0細(xì)胞上清作為陰性對(duì)照，Core-NS4B融合重組蛋白為包被抗原，建立間接ELISA篩選方法。Core-NS4B融合重組蛋白包被濃度為5μg/mL，每孔100μL，37°C孵育1h；PBST清洗5次，每孔加1% BSA 200μL，37°C孵育1h；PBST清洗5次，每孔加融合細(xì)胞上清100μL，每塊酶標(biāo)板各設(shè)一陰陽(yáng)對(duì)照孔，37°C孵育1h；PBST清洗5次，每孔加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 100μL，37°C孵育1h；PBST清洗5次，加入TMB底物顯色液，37°C作用15min，2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為：450nm，判定依據(jù)：OD450≤0.3判斷為陰性，OD450＞0.3，判斷為陽(yáng)性。

1.2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立

取小鼠骨髓瘤Sp2/0-Agl4細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）與免疫脾細(xì)胞按1:5的比例用50% PEG進(jìn)行融合，免疫小鼠血清為陽(yáng)性對(duì)照，Sp2/0-Agl4細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照，用間接ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清。選擇強(qiáng)陽(yáng)性克隆，用有限稀釋法連續(xù)克隆化3～4次，直至有克隆孔的抗體100%陽(yáng)性。將建立的穩(wěn)定分泌高特異、高效價(jià)抗HCV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，置液氮中保存。

1.2.4 腹水抗體的制備

采用小鼠體內(nèi)繁殖法大量制備單克隆抗體。6～8周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟（0.5mL/只），2周后，將已擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔（2×106個(gè)/只），10d后收集腹水，以間接ELISA法對(duì)腹水抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，12000r/min，4°C離心30min，取上清備用。

1.3 抗體的純化及測(cè)定

用Protein A親和純化小鼠腹水，用SDS-PAGE法對(duì)抗體純度進(jìn)行鑒定，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，采用紫外吸收法對(duì)抗體濃度進(jìn)行測(cè)定，將抗體均稀釋到1mg/mL對(duì)其進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。

1.4 ELISA法單克隆抗體配對(duì)

1.4.1 單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)的分析

用ELISA相加實(shí)驗(yàn)測(cè)定OD450值，抗體之間產(chǎn)生相加效應(yīng)的程度用指數(shù)AI=(2A1+2/A1+A2-1)表示，A1，A2表示不同單克隆抗體分別單獨(dú)與抗原作用時(shí)的OD450值，A1+2表示兩種單克隆抗體混合后于抗原作用時(shí)的OD450值，AI＞50%表示兩種單抗針對(duì)不同的抗原表位。

1.4.2 單克隆抗體配對(duì)

采用夾心ELISA法，分別包被HCV單抗，包被濃度10μg/mL，Core-NS4B溶液稀釋到5μg/mL加樣，HRP標(biāo)記抗體按照1:1000稀釋加樣，不同表位的抗體兩兩組合，TMB顯色，測(cè)定OD450值。

1.5 血清標(biāo)本檢測(cè)

標(biāo)本來(lái)源：南京市某醫(yī)院體檢血清標(biāo)本120例，其中體檢合格標(biāo)本30例，HCV陽(yáng)性標(biāo)本30例，HCV可疑標(biāo)本30例，單項(xiàng)ALT增高的標(biāo)本30例。

雙抗夾心檢測(cè)：采用夾心ELISA法，包被HCV單抗，加血清標(biāo)本，加HRP標(biāo)記抗體，TMB顯色，測(cè)定OD450值。

HCV—RNA檢測(cè)：采用廣州達(dá)健生物科技有限公司生產(chǎn)的丙肝病毒PCR檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書(shū)上的方法操作。

2.結(jié)果

2.1 單克隆抗體的制備

細(xì)胞融合篩選，最終獲得10株雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1F8，2E6，2F1，3C5，3H3，3H11，4E7，5F10，5H5，6E5，注射到小鼠腹腔。每株獲取8～12mL的優(yōu)質(zhì)腹水并取5mL進(jìn)行純化，獲得抗體300～800μL。如表1所示，純化后蛋白含量13.1～20.3mg/mL，凝膠成像分析純度達(dá)到89%～92%，抗體效價(jià)為40萬(wàn)～640萬(wàn)。

2.2 單克隆抗體的配對(duì)

2.2.1 單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)的分析

在間接EHSA試驗(yàn)中，當(dāng)Core-NS4B蛋白的包被濃度為5μg/mL時(shí)，10種抗體對(duì)應(yīng)的效價(jià)為其飽和時(shí)的最大稀釋度。保持Core-NS4B融合重組蛋白包被濃度為5μg/mL不變，將各株單抗兩兩以各自飽和時(shí)的最大稀釋度加入同一個(gè)包被有Core-NS4B抗原的孔內(nèi)作為一抗，間接ELISA反應(yīng)后，測(cè)定450nm處的光吸收值，并計(jì)算相加指數(shù)AI。

表1. 10株抗體的濃度、純度及效價(jià)

ELISA相加試驗(yàn)結(jié)果顯示，2F1，3H3，4E7，5F10，5H5分別與其他9株單克隆抗體之間的相加指數(shù)AI大于50%，1F8，2E6，3C5，3H11，6E5五種單克隆抗體相互之間AI指數(shù)小于50%，說(shuō)明2F1，3H3，4E7，5F10，5H5可能與Core-NS4B抗原結(jié)合的位點(diǎn)不同，1F8，2E6，3C5，3H11，6E5可能與Core-NS4B抗原結(jié)合位點(diǎn)相同。結(jié)合抗體效價(jià)等多方面原因，最終選擇2F1，3H3，4E7，5F10，5H5，6E5進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 單克隆抗體配對(duì)

2F1，3H3，4E7，5F10，5H5，6E5六種單抗分別用作包被抗體及酶標(biāo)抗體，交叉檢測(cè)人Core-NS4B抗原。其中抗體包被量均為10μg/mL，酶標(biāo)抗體按1:1000倍稀釋使用。配對(duì)初篩中Core-NS4B融合重組抗原按5μg/mL使用。初步配對(duì)結(jié)果顯示，單抗配對(duì)4E7-5H5在雙抗體夾心法中有最好的檢測(cè)效果（表2），因此選取5H5-4E7-HRP對(duì)進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)血清樣本。

表2. 單抗配對(duì)初篩結(jié)果

2.2.3 血清標(biāo)本檢測(cè)

用篩出的抗體對(duì)5H5-4E7-HRP檢測(cè)120例血清標(biāo)本，結(jié)果顯示，體檢合格的30例血清均未測(cè)出陽(yáng)性。HCV陽(yáng)性標(biāo)本30例測(cè)出23例陽(yáng)性，HCV可疑標(biāo)本30例測(cè)出15例陽(yáng)性，單項(xiàng)ALT增高的標(biāo)本30例測(cè)出2例陽(yáng)性（見(jiàn)表3）。用HCVRNA試劑盒檢測(cè)上述樣本，結(jié)果顯示，HCV陽(yáng)性血清標(biāo)本測(cè)出26例陽(yáng)性，HCV可疑血清標(biāo)本測(cè)出17例陽(yáng)性，單項(xiàng)ALT增高標(biāo)本測(cè)出1例（見(jiàn)表3）。由此可見(jiàn)，5H5和4E7抗體配對(duì)能較好地測(cè)出HCV抗原，為臨床檢測(cè)HCV試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

表3. 配對(duì)抗體5F9+1H11-HRP靈敏度檢測(cè)

3.討論

HCV是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組由3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)和4個(gè)非結(jié)構(gòu)區(qū)組成。HCV核心蛋白（Core）是結(jié)構(gòu)區(qū)的基因編碼的一種結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，抗原性強(qiáng)，具有蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)，在病毒裝配與成熟過(guò)程中起關(guān)鍵作用，具有多種類(lèi)型的生物活性，是與宿主細(xì)胞相互作用的重要環(huán)節(jié)，在HCV感染后的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[12,13]。NS4B是HCV的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒復(fù)制和丙肝病理變化過(guò)程，NS4B相對(duì)于其他非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒進(jìn)化上較為保守[14]。因此，制備Core和NS4B抗體對(duì)HCV檢測(cè)具有重要的意義。

本研究通過(guò)免疫Core-NS4B融合重組蛋白，制備抗HCV單克隆抗體，獲得5H5-4E7最優(yōu)的抗體配對(duì)組合，并用篩出的抗體檢測(cè)120例血清標(biāo)本，同時(shí)與HCV-RNA檢測(cè)做比較。結(jié)果顯示，體檢合格的30例血清均未測(cè)出陽(yáng)性，HCV陽(yáng)性標(biāo)本30例，抗體對(duì)測(cè)出23例陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率77%，HCVRNA測(cè)出26例，陽(yáng)性檢出率87%；HCV可疑標(biāo)本30例，抗體對(duì)測(cè)出15例陽(yáng)性，HCV-RNA測(cè)出17例；單項(xiàng)ALT增高的標(biāo)本30例，抗體對(duì)測(cè)出2例陽(yáng)性，HCV-RNA測(cè)出1例。充分說(shuō)明本研究所建立的雙抗夾心檢測(cè)HCV抗原的體系能夠初步應(yīng)用于臨床HCV抗原檢測(cè)，具有巨大的潛力，為建立HCV抗原檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)，為臨床檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。