花后DA-6處理調(diào)控小麥種子活力的機理

許晨，王文靜，曹珊，李如雪，張貝貝，孫愛清，張春慶

花后DA-6處理調(diào)控小麥種子活力的機理

許晨，王文靜，曹珊，李如雪，張貝貝，孫愛清，張春慶

山東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/作物生物學國家重點實驗室/山東省作物生物學重點實驗室，山東泰安 271018

高活力的種子萌發(fā)迅速整齊，抗逆性強，具有很大的生產(chǎn)優(yōu)勢。己酸二乙氨基乙醇酯（DA-6）作為叔胺類植物生長調(diào)節(jié)劑，可以提高植物的光合速率，調(diào)節(jié)碳氮代謝，提高作物品質(zhì)和產(chǎn)量?！尽糠治龌ê髧娛〥A-6對小麥籽粒物質(zhì)積累、物質(zhì)代謝和抗逆關(guān)鍵基因表達、種子千粒重、化學成分與種子活力的影響，明確DA-6調(diào)控小麥種子活力的機理，為DA-6在小麥高活力種子生產(chǎn)調(diào)控中的應用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。以小麥品種良星77和山農(nóng)23號為材料，于花后2和6 d進行DA-6田間噴施。試驗于2017—2018年、2018—2019年在山東農(nóng)業(yè)大學馬莊試驗基地（117°E；36°N）進行，設(shè)置2個處理濃度（0和6 g·L-1DA-6）和2個處理時期（花后2和6 d），設(shè)置3個區(qū)組，每個小區(qū)面積6 m×3 m。于籽粒灌漿前期和中期（花后12和22 d）取籽粒、穗下節(jié)和旗葉鮮樣，用于物質(zhì)代謝關(guān)鍵酶基因表達的檢測。于籽粒發(fā)育的不同天數(shù)取樣（花后25、30、35和40 d），自然曬干后脫粒測定千粒重和蛋白質(zhì)含量、淀粉含量等；對于成熟期收獲的小麥穗，取小麥整穗、不同穗位（上部、中部和下部）、不同粒位（下位粒和上位粒）的種子測定發(fā)芽活力指標。花后6 d噴施6 g·L-1DA-6可大幅度提高千粒重及種子蛋白質(zhì)含量，使2個小麥品種的穗上部和上位粒種子的單株干重顯著增加，顯著提高種子的活力指數(shù)?；ê? d噴施DA-6有效降低了不同穗粒位之間的種子活力差異，使小麥不同穗位、粒位種子的活力得到整體提高，尤其以穗上中部籽粒及上位粒的種子活力提高更為明顯。而花后2 d噴施DA-6則使種子活力顯著降低，千粒重及種子蛋白質(zhì)含量也有降低。良星77和山農(nóng)23號的千粒重均表現(xiàn)為隨著籽粒灌漿期的延長，千粒重先升高后降低；但相對蛋白及絕對蛋白含量則表現(xiàn)為隨著時間的延長而漸升。同時，兩品種均表現(xiàn)為花后6 d噴施6 g·L-1的DA-6時千粒重及蛋白質(zhì)含量最高。此處理下，良星77花后40 d收獲時，千粒重與對照相比無顯著差異，但相對蛋白質(zhì)含量、絕對蛋白質(zhì)含量分別較對照顯著提高；山農(nóng)23號花后6 d噴施6 g·L-1DA-6后千粒重、絕對蛋白含量均顯著提高。兩品種花后2 d噴施DA-6對千粒重、相對蛋白質(zhì)含量、絕對蛋白含量及淀粉含量無顯著影響。實時熒光定量PCR表明，花后6 d噴施DA-6可誘導葉片蛋白磷酸酶和蔗糖磷酸合成酶基因表達水平顯著上調(diào)，莖稈中Ⅰ類和表達量顯著提高，籽粒中蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和的表達也顯著上調(diào)。花后6 d噴施DA-6處理的小麥種子萌發(fā)期α-淀粉酶活性檢測表明，山農(nóng)23號的對照和處理組均表現(xiàn)為其α-淀粉酶活性隨著萌發(fā)時間的延長逐漸增強，噴施DA-6可顯著提高2個品種的種子萌發(fā)72 h的α-淀粉酶活性?；ê? d噴施DA-6促進小麥中蛋白和蔗糖代謝關(guān)鍵酶基因及熱激蛋白基因的表達，有利于促進種子貯藏物質(zhì)合成，使種子蛋白質(zhì)含量升高，最終導致千粒重提高；同時還顯著增加2個小麥品種穗上中部及上位粒種子萌發(fā)過程中的單株干重，提高種子的活力指數(shù)，降低不同穗粒位之間種子活力的差異，提高種子萌發(fā)過程中的α-淀粉酶活性和物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，促進幼苗干物質(zhì)積累，最終提高種子活力。小麥種子花后6 d噴施6 g·L-1DA-6是提高小麥種子活力的有效途徑。

小麥；己酸二乙氨基乙醇酯；種子活力；實時熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要基礎(chǔ)，種子的品種品質(zhì)和播種品質(zhì)的高低則是農(nóng)業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展的關(guān)鍵，而種子活力更是重中之重。高活力種子不僅快速突破種皮，使出苗整齊，而且還具有較強的抗逆性，產(chǎn)生明顯的生長優(yōu)勢和生產(chǎn)潛力[1-4]。己酸二乙氨基乙醇酯（N,N-diethyl aminoethyl hexanoate，DA-6）是一種具有較高生物活性、人工合成的植物生長調(diào)節(jié)劑，俗稱胺鮮酯[5-6]，目前，DA-6已被廣泛應用于農(nóng)作物、果蔬、花卉等領(lǐng)域[7-11]，具有增產(chǎn)、抗逆、抗病、改善品質(zhì)等功效。因此，研究不同濃度DA-6對種子活力及產(chǎn)量的調(diào)控機理，對利用植物生長調(diào)節(jié)劑處理提高小麥種子活力及產(chǎn)量具有重要的理論意義和實踐價值?！厩叭搜芯窟M展】關(guān)于DA-6對種子活力及產(chǎn)量的影響，前人用不同方法做了大量研究。Xie等[12]研究發(fā)現(xiàn)外源噴施DA-6可以提高玉米根系導水率、促進幼苗的生長，增加植株葉面積，增加根和葉干重。而在其他作物上如番茄[13]、辣椒[14]、艾納香[15]、生菜[16]等噴施DA-6可促進生長，增加干重。聶樂興等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)拔節(jié)期噴施DA-6增產(chǎn)效果明顯，處理后玉米的葉面積指數(shù)、光合速率、RuBP羧化酶和PEP羧化酶活性均顯著上升。Zhou等[19]研究發(fā)現(xiàn)200mmol·L-1的DA-6可通過提高脂肪酸和甘油向糖類的轉(zhuǎn)化而促進老化大豆種子幼苗的形態(tài)建成，提高種子活力。研究還發(fā)現(xiàn)DA-6浸種可提高番茄[20]、水稻[21-22]、玉米[23-25]等作物的發(fā)芽率及活力指數(shù)。Wen等[26]對小麥和玉米種子活力的研究表明種子內(nèi)的蛋白質(zhì)含量與種子活力顯著相關(guān)。多項研究表明在小麥、大麥、燕麥等作物中種子活力與種子大小和蛋白質(zhì)含量顯著相關(guān)[27-30]?！颈狙芯壳腥朦c】前人研究主要采用外源噴施DA-6提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)，采用DA-6溶液浸種的方式提高種子活力，且多集中于玉米、水稻等作物，而外源噴施DA-6提高小麥種子活力的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過測定DA-6噴施處理后小麥生長進程中粒重、化學成分、籽粒物質(zhì)代謝關(guān)鍵酶基因表達的變化，收獲后不同穗位、粒位種子發(fā)芽活力的差異，以期明確DA-6調(diào)控小麥種子活力和產(chǎn)量形成的機理，為DA-6在小麥高活力種子生產(chǎn)調(diào)控中的應用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥品種良星77購自山東良星種業(yè)有限公司，半冬性，多穗型；山農(nóng)23號購自濟南鑫瑞種業(yè)科技有限公司，半冬性，大穗型。己酸二乙氨基乙醇酯粉劑（DA-6），有效含量為98.5%，由常州金壇茂盛精細化工廠生產(chǎn)。DA-6溶液配制時添加0.1%有機硅助劑（液體，河北農(nóng)迅生物科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017—2018年、2018—2019年在山東農(nóng)業(yè)大學馬莊試驗基地（117°E；36°N）進行，常規(guī)栽培管理。田間試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理3個區(qū)組，花后噴施DA-6。

2017—2018年，選擇1個小麥品種（良星77），設(shè)置2個處理濃度（0和6 g·L-1DA-6）、2個處理時期（花后2 d、花后6 d）和3個區(qū)組，小區(qū)面積為6 m×3 m。將良星77的盛花期記為開花0 d，分別于花后2 d（2018年4月26日）、花后6 d（4月30日）進行DA-6噴施處理，噴施量為750 L·hm-2。于籽粒發(fā)育的不同天數(shù)取樣（開花后25、30、35和40 d），每次取樣1 m2，自然曬干后測定粒重和蛋白質(zhì)含量、淀粉含量等；對成熟期收獲的小麥穗，取小麥整穗、不同穗位（上部、中部和下部）、不同粒位（下位粒和上位粒）的種子測定發(fā)芽活力指標。

2018—2019年，選擇2個小麥品種（良星77和山農(nóng)23號），設(shè)置2個處理濃度（0和6 g·L-1DA-6）、2個處理時期（花后2和6 d）和3個區(qū)組，小區(qū)面積為6 m×3 m。兩品種各自盛花期記為開花0 d，分別于花后2 d（良星77為2019年5月2日，山農(nóng)23號為5月3日）、花后6 d（良星77為5月6日，山農(nóng)23號為5月7日）進行DA-6噴施處理，噴施量為1 800 L·hm-2。于籽粒發(fā)育的不同天數(shù)取樣（花后25、30、35和40 d），每次取樣1 m2，自然曬干后脫粒測定粒重和蛋白質(zhì)含量、淀粉含量等；對成熟期收獲的小麥穗，取小麥整穗、不同穗位（上部、中部和下部）、不同粒位（下位粒和上位粒）的種子，測定發(fā)芽活力指標。于籽粒灌漿前期和中期（花后12和22 d）取樣，分別取籽粒、穗下節(jié)和旗葉的鮮樣，迅速液氮冷凍，-80℃保存，用于物質(zhì)代謝關(guān)鍵酶基因表達的檢測。

1.3 千粒重測定

參照國家標準法（GB 5519-2008），測定小麥千粒重，據(jù)種子實際含水量換算至標準水分（13%）條件下的千粒重，3次重復，取平均值。

標準水分（13%）千粒重（g）=實測千粒重（g）×（1-實測含水量，%）/（1-13%）。

1.4 籽?；瘜W成分

采用Perten DA7200近紅外谷物品質(zhì)分析儀測定籽粒的含水量、蛋白質(zhì)、淀粉百分數(shù)含量，換算為規(guī)定水分（13%）條件下的化學成分含量，3次重復，取平均值。

相對蛋白質(zhì)含量（relative content of protein，RCP，%）=實測蛋白質(zhì)%×（1-13%）/（1-實測含水量，%）；

絕對蛋白質(zhì)含量（absolute content of protein，ACP，mg/seed）=實測千粒重（g）×實測蛋白質(zhì)（%）/100；

相對淀粉含量（relative content of starch，RCS，%）=實測淀粉（%）×（1-13%）/（1-實測含水量，%）；

絕對淀粉含量（absolute content of starch，ACS，mg/seed）=實測千粒重（g）×實測淀粉（%）/100。

1.5 種子發(fā)芽活力指標的測定

參照國家標準農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程（GB/T 3543.4-1995），進行標準發(fā)芽試驗，測定種子發(fā)芽勢（germination energy，GE）、發(fā)芽率（germination percentage，GP）、發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）和活力指數(shù)（vigor index，VI）。其中，VI=GI×S，S為一定時期內(nèi)正常幼苗單株干重。

1.6 α-淀粉酶活性的測定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法測定α-淀粉酶活性[31-32]，略作改進。

1.7 RNA提取及qRT-PCR

采用天根公司DP441試劑盒（天根，中國北京）提取總RNA，用TaKaRa試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser）合成cDNA，ABI Stepone plus熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR，參考Wen等[33]方法設(shè)計引物（表1）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013計算試驗數(shù)據(jù)平均值并作圖，用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，LSD法比較處理之間的差異顯著程度。

表1 qRT-PCR引物

2 結(jié)果

2.1 噴施DA-6對不同穗位、粒位種子發(fā)芽活力的影響

標準發(fā)芽試驗結(jié)果表明，2018年花后6 d噴施DA-6顯著提高了良星77穗上部種子的單株干重及活力指數(shù)，分別為3.92%和5.22%。良星77花后2 d噴施DA-6，顯著降低了穗上部和穗中部種子的單株干重及活力指數(shù)，其中，穗上部種子的單株干重與活力指數(shù)與對照相比分別顯著降低4.49%和2.87%，穗中部種子的單株干重與活力指數(shù)與對照相比分別顯著降低7.11%和8.37%。對不同粒位的小麥來說，花后6 d噴施DA-6使上位粒的單株干重及活力指數(shù)顯著提高，分別提高8.54%和10.61%；對下位粒的單株干重無顯著影響，但可使其活力指數(shù)顯著提高3.37%?；ê? d噴施DA-6使下位粒的種子活力顯著降低，與對照相比，單株干重和活力指數(shù)分別顯著降低3.05%和2.45%（圖1）。

2019年，對良星77不同穗位種子來說，花后6 d噴施DA-6可顯著提高穗上部、穗中部種子的單株干重及活力指數(shù)，其中，對穗上部種子的單株干重及活力指數(shù)分別提高6.53%和4.40%，對穗中部種子的單株干重及活力指數(shù)分別提高6.18%和5.33%?；ê? d噴施DA-6使穗上部種子的單株干重和活力指數(shù)顯著降低，與對照相比，分別顯著降低4.90%和2.51%。對不同粒位的小麥種子來說，花后6 d噴施DA-6顯著提高了下位粒、上位粒的單株干重及活力指數(shù)，其中，下位粒種子的單株干重及活力指數(shù)分別提高2.84%和2.38%，下位粒種子的單株干重及活力指數(shù)分別提高7.30%和4.06%；花后2 d噴施DA-6未見顯著影響（圖2）。

同年，對山農(nóng)23號來說，花后6 d噴施DA-6則使3個穗部位種子的單株干重與活力指數(shù)均顯著提高。對穗上部種子的單株干重和活力指數(shù)分別顯著提高8.44%和13.50%，對穗中部種子的單株干重和活力指數(shù)分別顯著提高13.85%和11.55%，對穗下部種子的單株干重及活力指數(shù)則分別提高5.62%和5.24%?；ê? d噴施DA-6使穗上部、中部種子的活力顯著降低，其中，穗上部種子的單株干重和活力指數(shù)分別極顯著降低8.55%和10.52%，穗中部種子的單株干重和活力指數(shù)分別極顯著降低5.78%和6.52%。對山農(nóng)23號不同粒位的小麥種子來說，與良星77一樣，花后6 d噴施DA-6顯著提高了上位粒的單株干重與活力指數(shù)，分別提高5.75%和5.50%；花后2 d噴施DA-6未見顯著影響（圖3）。

綜上所述，花后6 d噴施DA-6可顯著提高種子活力，并且種子活力的提高主要表現(xiàn)在穗上部、穗中部及上位粒的種子上，DA-6噴施有效降低了不同穗粒位種子之間的活力差異，使小麥不同穗位、粒位種子的活力整體均勻提高。

A：單株干重；B：活力指數(shù)。D2：花后2 d；D6：花后6 d；*表示差異達5%顯著水平；**表示差異達1%顯著水平。下同

A：單株干重；B：活力指數(shù) A: Plant dry weight; B: Vigor index

2.2 DA-6噴施對小麥籽粒發(fā)育進程千粒重和化學成分的影響

2018年良星77各處理組與對照組的千粒重及蛋白質(zhì)含量均表現(xiàn)為隨時間延長而上升（圖4-A和圖5），結(jié)果表明，花后6 d噴施6 g·L-1DA-6的效果最好，與對照相比，千粒重、相對蛋白含量及絕對蛋白含量在花后40 d時分別提高了4.53%、4.79%和10.57%，同時在相對淀粉含量無顯著變化的情況下絕對淀粉含量提高4.52%。而花后2 d噴施6 g·L-1DA-6則使千粒重、相對蛋白及絕對蛋白含量分別降低2.37%、6.15%和8.41%。

A：2018年良星77千粒重；B：2019年良星77千粒重；C：2019年山農(nóng)23號千粒重。D2：花后2 d；D6：花后6 d；D25：花后25 d；D30：花后30 d；D35：花后35 d；D40：花后40 d。下同

A：相對蛋白質(zhì)含量；B：絕對蛋白質(zhì)含量；C：相對淀粉含量；D：絕對淀粉含量

2019年良星77和山農(nóng)23號的千粒重均表現(xiàn)為隨著籽粒灌漿期的延長，千粒重先升高后降低；但相對蛋白及絕對蛋白含量則表現(xiàn)為隨著時間的延長而漸升。同時，兩品種均表現(xiàn)為花后6 d噴施6 g·L-1的DA-6時千粒重及蛋白質(zhì)含量最高。此處理下良星77花后40 d收獲時，與對照相比，千粒重無顯著差異，但相對蛋白質(zhì)含量、絕對蛋白質(zhì)含量分別顯著提高2.42%和2.46%；淀粉含量略有下降但未達顯著水平；而良星77花后2 d噴施DA-6的千粒重、相對蛋白、絕對蛋白含量、相對淀粉、絕對淀粉含量無顯著差異（圖4-A、圖4-B、圖5—圖6）。山農(nóng)23號花后6 d噴施6 g·L-1DA-6后千粒重、絕對蛋白含量均顯著提高，提高幅度分別為2.28%和3.23%，淀粉含量無顯著變化；花后2 d噴施DA-6對千粒重、相對蛋白質(zhì)含量、絕對蛋白含量及淀粉含量無顯著影響（圖4-C、圖7）。因此，兩品種花后6 d噴施DA-6的小麥種子，最終收獲時蛋白質(zhì)含量顯著高于對照。

2.3 DA-6噴施對種子發(fā)育過程中物質(zhì)代謝酶基因表達的影響

為了驗證DA-6噴施對種子發(fā)育過程中物質(zhì)代謝酶基因表達的影響，選取前期轉(zhuǎn)錄組分析中噴施DA-6后顯著上調(diào)的6個差異表達基因（莖稈、葉片和籽粒中各有2個），這些基因分別與蛋白質(zhì)、蔗糖代謝及抗逆性相關(guān)，對2019年花后6 d噴施6 g·L-1DA-6的處理組和對照組所取樣品進行熒光定量PCR分析。

由圖8可知，花后6 d噴施DA-6使得良星77和山農(nóng)23號葉片中蛋白磷酸酶和蔗糖磷酸合成酶基因的表達量均極顯著提高，其中良星77花后12 d所取葉片蛋白磷酸酶和蔗糖磷酸合成酶基因表達量提高幅度更大，而山農(nóng)23號則表現(xiàn)為花后22 d所取葉片2個基因表達量大幅度提高。

由圖9可知，對莖稈中Ⅰ類和表達量測定表明，在良星77中2個基因均表現(xiàn)為花后12 d表達量極顯著提高，而花后22 d DA-6噴施處理與對照無顯著差異；山農(nóng)23號表現(xiàn)為花后22 d 2個基因表達量大幅度提高，而花后12 dⅠ類表達量與對照相比也顯著提高。

A：相對蛋白質(zhì)含量；B：絕對蛋白質(zhì)含量；C：相對淀粉含量；D：絕對淀粉含量

A：相對蛋白質(zhì)含量；B：絕對蛋白質(zhì)含量；C：相對淀粉含量；D：絕對淀粉含量

A：良星77葉片中蛋白磷酸酶基因；B：山農(nóng)23號葉片中蛋白磷酸酶基因；C：良星77葉片中蔗糖磷酸合成酶基因；D：山農(nóng)23號葉片中蔗糖磷酸合成酶基因

A：良星77莖稈中Ⅰ類hsp；B：山農(nóng)23號莖稈中Ⅰ類hsp；C：良星77莖稈中hsp70；D：山農(nóng)23號莖稈中hsp70

籽粒中蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和表達量測定表明，2個小麥品種在2個DA-6噴施后的取樣期中均表現(xiàn)為顯著提高，其中，以山農(nóng)23號花后22 d蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因的提高幅度為最大；而對于，兩品種均表現(xiàn)為花后22 d提高幅度最大（圖10）。

因此，良星77和山農(nóng)23號DA-6噴施后葉片蛋白磷酸酶和蔗糖磷酸合成酶基因表達水平顯著上調(diào)，莖稈中Ⅰ類和表達量顯著提高，籽粒中蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和也顯著上調(diào)，表明花后6 d噴施6 g·L-1DA-6可以顯著促進蛋白、蔗糖代謝關(guān)鍵酶基因和熱激蛋白基因的表達，有利于種子貯藏物質(zhì)的合成，使其具有更強的適應性。

2.4 DA-6噴施對小麥種子萌發(fā)期代謝酶的影響

以良星77和山農(nóng)23號2019年花后6 d噴施DA-6的樣品（CK，6 g·L-1）為材料，檢測種子萌發(fā)期α-淀粉酶活性差異。

對山農(nóng)23號萌發(fā)過程中8個時間點α-淀粉酶活性的檢測表明，山農(nóng)23號對照和處理組均表現(xiàn)為隨著萌發(fā)時間的延長其α-淀粉酶活性會逐漸增強（圖11-A），大部分時間點的α-淀粉酶活性表現(xiàn)為噴施DA-6后的小麥種子酶活性高。由圖可以看出，萌發(fā)72 h后，山農(nóng)23號噴施DA-6的種子α-淀粉酶活性顯著高于對照，與對照相比酶活性提高了15.67%。

2個品種種子萌發(fā)72 h后的α-淀粉酶活性比較結(jié)果表明，花后6 d噴施可顯著提高α-淀粉酶活性，其中良星77比對照的α-淀粉酶活性提高了27.02%，山農(nóng)23號只提高15.67%（圖11-B、圖11-C）。綜上所述，對種子萌發(fā)期酶活性測定表明，噴施DA-6后的種子α-淀粉酶的活性顯著提高，說明幼苗物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力較強。

3 討論

3.1 DA-6噴施對小麥不同穗粒位種子活力的影響

李孟良等[34]、劉旭歡等[35]研究表明小麥中穗下部種子活力高于穗上部的種子活力，且下位粒的活力要大于上位?；盍?。本研究前期對小麥DA-6噴施的適宜時期和適宜濃度開展了連續(xù)2年的研究，表明DA-6適宜噴施濃度為6 g·L-1，適宜噴施時期為花后6 d。本研究證明，花后適時噴施合適濃度的DA-6確實可通過提高單株干重來提高種子活力，即提高了幼苗的干物質(zhì)積累。進一步通過不同穗位種子的發(fā)芽試驗證明，DA-6對本來活力最高的穗下部種子其提高幅度不明顯，但對活力相對較低的穗中部和穗上部種子提高幅度明顯；而對不同粒位種子的發(fā)芽試驗也說明，DA-6更能提高上位粒的種子活力。2年的試驗結(jié)果略有差異，2018年度花后2 d噴施DA-6后使下位粒的種子活力降低，而2019年花后2 d噴施DA-6則未出現(xiàn)下位粒種子活力降低的現(xiàn)象；花后6 d噴施DA-6則均表現(xiàn)為提高上位粒種子活力，2年結(jié)果的差異究其原因可能為2年氣候不同使結(jié)果出現(xiàn)波動，但對整體結(jié)果影響不大。另外2019年度加大噴施量，噴施更均勻，噴施效果更好。本研究表明，花后6 d噴施DA-6通過調(diào)節(jié)不同穗粒位種子活力，最終使收獲的不同部位的種子間活力差異更小，使小麥不同穗位、粒位種子的活力整體均勻提高。

A：良星77籽粒中蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因；B：山農(nóng)23號籽粒中蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因；C：良星77籽粒中hsp82；D：山農(nóng)23號籽粒中hsp82

A：山農(nóng)23號；B：良星77；C：山農(nóng)23號 A: Shannong 23; B: Liangxing 77; C: Shannong 23

此外，有研究指出，萌發(fā)72 h的α-淀粉酶活性可以用來快速評價小麥種子活力的高低[36]。本研究對2個小麥品種的種子萌發(fā)72 h后的α-淀粉酶活性比較表明，花后6 d DA-6噴施可顯著提高種子萌發(fā)過程中的α-淀粉酶活性，表明DA-6促進了淀粉的分解利用和種胚萌動，為種子萌發(fā)提供物質(zhì)與能量來源，從而促進種子的萌發(fā)，達到苗強苗壯的目的。

3.2 DA-6噴施對小麥生育過程中千粒重及化學成分的影響

任紅等[37]在玉米第8—10葉全展期2次噴施DA-6使玉米產(chǎn)量提高。楊學舉[38]研究發(fā)現(xiàn)對小麥增施氮肥可提高其蛋白質(zhì)含量，降低直鏈淀粉含量，可改良小麥的淀粉特性。本研究中，花后6 d噴施DA-6使小麥從花后30 d開始千粒重及絕對蛋白含量、絕對淀粉含量比對照高，生長到花后35 d時提高幅度最大，而相對淀粉含量則成相反趨勢，表明花后適宜時期噴施DA-6可提高千粒重，同時使蛋白質(zhì)所占比例升高，使其營養(yǎng)價值提高，這與前人研究結(jié)果相符。

3.3 DA-6噴施提高小麥種子活力的機理

Wen等[33]研究表明，山農(nóng)23號在花后一周噴施4和6 g·L-1DA-6處理，籽粒千粒重和籽粒蛋白質(zhì)含量均顯著高于對照。花后24 d取樣進行RNA-seq分析表明，6 g·L-1DA-6處理的樣品中參與旗葉蔗糖合成、莖中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、種子中淀粉合成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工的差異表達基因均比對照有顯著上調(diào)。本研究通過qRT-PCR分析，表明花后噴施DA-6調(diào)節(jié)了莖中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)合成、旗葉中蔗糖合成，籽粒中淀粉和蔗糖代謝，符合前人研究結(jié)果，DA-6使小麥在生育過程中籽粒的蛋白質(zhì)含量升高，千粒重提高，最終使噴施DA-6后的小麥種子千粒重、蛋白質(zhì)含量和種子活力提高。

4 結(jié)論

花后6 d噴施6 g·L-1DA-6可以促進蛋白、蔗糖代謝關(guān)鍵酶基因和熱激蛋白基因的表達，有利于種子貯藏物質(zhì)合成，使種子蛋白質(zhì)含量升高，千粒重提高；顯著提高收獲種子穗上部、穗中部及上位粒的活力，降低了不同穗位粒位之間的種子活力差異，并使種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性提高，物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力提高，促進幼苗干物質(zhì)積累，最終提高了種子活力。

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Mechanism of DA-6 treatment regulating wheat seed vigor after anthesis

XU Chen, WANG WenJing, CAO Shan, LI RuXue, ZHANG BeiBei, SUN AiQing, ZHANG ChunQing

College of Agriculture, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology/Shandong Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong

【】High-vigor seeds germinate quickly and efficiently, and they are highly stress resistant and advantageous during crop production. Diethyl aminoethyl hexanoate (DA-6), as a tertiary amine plant growth regulator, increases plant photosynthetic rates, regulates carbon and nitrogen metabolism and improves crop quality and yield. However, there are limited studies on its effects on seed vigor. 【】This study analyzed the effects of spraying DA-6 post-flowering on the compounds accumulated in grains, expression levels of key genes associated with metabolism and stress-resistance, 1000-grain weights, chemical compositions and seed vigor to determine DA-6’s mechanism for regulating wheat seed vigor, which has important theoretical and practical significance in the production of high-vigor wheat seeds.【】Wheat varieties, Liangxing 77 and Shannong 23, grown in fields of the Mazhuang Experimental Base of Shandong Agricultural University in 2017-2018 and 2018-2019 (117°E, 36°N) were sprayed with DA-6. Two treatment concentrations (0 and 6 g·L-1DA-6), two treatment periods (2 and 6 days after anthesis) and three zone groups, each having an area of 6 m × 3 m, were used. Fresh samples of grains, stems below spikes and flag leaves were collected at the early and middle stages of grain filling (12 and 22 days after anthesis, respectively), and the expression levels of key metabolism-related enzymes were analyzed. Samples were taken on different days of grain development (25, 30, 35 and 40 days after anthesis), and the 1000-grain weights, protein contents and starch contents were determined after natural drying and threshing. For wheat spikes harvested at the maturity stage, the germination and vigor indices of the whole ear, different spike positions (upper, middle and lower) and different grain positions (lower and upper grain) were measured.【】Spraying 6 g·L-1DA-6 at 6 days after anthesis significantly increased the 1000-grain weights, seed protein contents, and plant dry weights of the upper spikes and upper grains in both wheat varieties, and it significantly improved the seed vigor indices. DA-6 spraying at 6 days after anthesis effectively reduced the seed vigor difference between different spike and grain positions, and it improved the seed vigor of different spike and grain positions in wheat as a whole, especially those of upper and middle spikes, as well as the upper grain. However, DA-6 spraying at 2 days after anthesis significantly reduced seed vigor, 1000-grain weights and seed protein contents. The 1000-grain weights of Liangxing 77 and Shannong 23 increased first and then decreased as the grain-filling period was extended. However, relative and absolute protein contents increased with time. Additionally, both varieties showed the highest 1000-grain weights and protein contents after spraying 6 g·L-1DA-6 at 6 days after anthesis. While the 1000-grain weight of Liangxing 77 was not significantly different from that of the control group, the relative and absolute protein contents were significantly greater. The 1000-grain weight and absolute protein content of Shannong 23 significantly increased after spraying 6 g·L-1DA-6 at 6 days after anthesis. DA-6 spraying at 2 days after anthesis had no significant effects on 1000-grain weights, relative and absolute protein contents or starch contents. Real fluorescence quantitative PCR showed that DA-6 spraying at 6 days after anthesis significantly increased the expression levels of protein phosphatase and sucrose phosphate synthase in flag leaves. The expression levels of class I heat shock protein()and【】Spraying DA-6 at 6 days after anthesis promoted the expression levels of proteins, key enzyme-encoding genes of sucrose metabolism ands. It also facilitated the synthesis of seed storage substances, increased the protein contents of seeds and significantly increased the 1000-grain weights.The dry weight of individual plants during germination and seed vigor of upper, middle spikes and the upper grain of harvested seeds in two varieties significantly improved after spraying DA-6. The seed vigor difference between different spike positions decreased, and the α-amylase activity increased during seed germination. Thus, spraying DA-6 after anthesis promoted the accumulation of seedling dry matter and improved material transformation capacities during seed germination. Additionally, seed vigor improved. Our studies suggest that spraying 6 g·L-1DA-6 on wheat at 6 days after anthesis is an effective way to improve seed vigor.

wheat; DA-6; seed vigor; real-time PCR

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.001

2020-08-24；

2020-10-19

國家重點研發(fā)計劃七大農(nóng)作物育種專項課題（2018YFD0100904）

許晨，E-mail：xuchen0905@foxmail.com。通信作者張春慶，E-mail：cqzhang@sdau.edu.cn。通信作者孫愛清，E-mail：saqsshh@sdau.edu.cn

（責任編輯 李莉）