高效液相色譜法檢測(cè)肝達(dá)康顆粒中5種成分

劉振麗，徐麗

(駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所 食品藥品檢驗(yàn)，河南 駐馬店 463000)

肝達(dá)康顆粒是由北柴胡、白芍、當(dāng)歸、茜草、白術(shù)、茯苓、鱉甲、湘曲、黨參、白茅根、枳實(shí)、青皮、砂仁、地龍、甘草12味中藥制成的中成藥[1]。肝達(dá)康顆粒具有疏肝健脾、化瘀通絡(luò)的作用，適用于慢性乙型肝炎具肝郁脾虛兼血瘀證候者[2-3]。白芍的主要有效成分為芍藥苷，茜草發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)為大葉茜草素、羥基茜草素，枳實(shí)、青皮的主要有效成分為揮發(fā)油類(lèi)物質(zhì)柚皮苷、橙皮苷[4-5]。本研究使用高效液相層析(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)肝達(dá)康顆粒中芍藥苷、大葉茜草素、羥基茜草素、柚皮苷、橙皮苷5種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對(duì)肝達(dá)康顆粒藥品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 研究方法

1.1 試劑、儀器、藥品

1.1.1試劑 試劑及廠家信息見(jiàn)表1。

表1 試劑及廠家信息

1.1.2藥品 肝達(dá)康顆粒(廠家：貴州健興藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z19980083，規(guī)格：每袋8 g)；對(duì)照品均購(gòu)買(mǎi)于中檢所(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736-201842，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.4%)；大葉茜草素對(duì)照品(批號(hào)110884-201405，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)；羥基茜草素對(duì)照品(批號(hào)111898-201603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%)；柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)110722-201312，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.7%)；橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)110721-201316，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%)。

1.1.3儀器 由真空脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣裝置、柱溫箱和光電二極管矩陣檢測(cè)器組成的1260型HPLC儀(美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品)，sartorius MSA225S電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司產(chǎn)品)，SBL-22DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品)。

1.2 色譜條件Diamonsil(鉆石一代)C18分析色譜柱(5 μm ，250×4.6 mm)，流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水(體積分?jǐn)?shù))。流速：1.0 mL·min-1。梯度洗脫：0～25 min，7%乙腈；25～30 min，7%～12%乙腈；30～55 min，12%～20%乙腈；55～75 min，20%～34%乙腈；75～80 min，34%～85%乙腈；80～85 min，85%乙腈；85～95 min，85%～87%乙腈；95～100 min，7%乙腈(體積分?jǐn)?shù))。UV檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。柱溫：35 ℃。

1.3 供試品及對(duì)照品溶液制備(1)供試品溶液的制備：取適量肝達(dá)康顆粒，置于研缽中，研成細(xì)粉，電子天平精密稱(chēng)取2.0 g，置于150 mL錐形瓶中，精密量取甲醇適量，加入錐形瓶中，超聲30 min，進(jìn)行提取。超聲結(jié)束后，甲醇補(bǔ)足到150 mL，過(guò)濾，獲得濾液。(2)5種對(duì)照品溶液的制備：取適量5種對(duì)照品，甲醇溶解制成芍藥苷、大葉茜草素、羥基茜草素、柚皮苷、橙皮苷質(zhì)量濃度分別為0.421 4、0.322 7、0.309 0、0.217 4、0.433 3 g·L-1的對(duì)照品混合儲(chǔ)液，甲醇稀釋5倍，得5種對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.084 28、0.054 54、0.061 80、0.043 48、0.086 66 g·L-1對(duì)照品溶液。(3)陰性對(duì)照品溶液制備：制備不含白芍、茜草、枳實(shí)和青皮的陰性對(duì)照藥品，按上述方法制備。

1.4 線性關(guān)系考察分別精密量取0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL對(duì)照品溶液，置于10 mL容量瓶中進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄈ葜量潭染€。按照1.2中的色譜條件上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)樣量為10 μL。以峰面積為Y軸，對(duì)照品濃度為X軸，進(jìn)行線性回歸分析。

1.5 精密度實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確量取10 μL對(duì)照品溶液，按照1.2中的色譜條件上機(jī)檢測(cè)，連續(xù)重復(fù)6次。記錄 5種物質(zhì)的峰面積，通過(guò)計(jì)算獲得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)。

1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取1.3中制備的供試品溶液，分別于配置完成后0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL檢測(cè)，記錄各個(gè)峰面積，外標(biāo)法計(jì)算5種化合物在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并與配置完成時(shí)比較，獲得精確度值(RE)。

1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取適量的同一批號(hào)肝達(dá)康顆粒，按照1.3中供試品的制備方法進(jìn)行溶液制備，按照1.2中的方法10 μL進(jìn)樣檢測(cè)，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算獲得化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并最終得到相對(duì)應(yīng)的RSD。

1.8 回收率實(shí)驗(yàn)取適量的同一批肝達(dá)康顆粒，置于研缽中研成細(xì)粉，取6份約0.25 g的細(xì)粉，精密稱(chēng)定，分別置于6個(gè)150 mL容量瓶中，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)液4 mL，按照1.3中的方法制備供試品溶液。10 μL上樣檢測(cè)，計(jì)算5種化合物的回收率。

1.9 樣品測(cè)定精密稱(chēng)取適量肝達(dá)康顆粒，按照1.3中的方法制備供試品溶液，按照1.2中的方法上樣檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算肝達(dá)康顆粒中5種化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。平行進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，求平均值。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系5種化合物在對(duì)應(yīng)的線性范圍內(nèi)，R均大于0.999 0，表明線性關(guān)系較好。見(jiàn)表2。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果芍藥苷、大葉茜草素、羥基茜草素、柚皮苷、橙皮苷的峰面積的RSD分別為0.58%、0.62%、0.44%、0.39%、0.67%，表明儀器的精密度較好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果供試品溶液中5種化合物在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RE見(jiàn)表3所示，表明5種化合物在 12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表3。

表3 5種化合物的穩(wěn)定性

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果芍藥苷、大葉茜草素、羥基茜草素、柚皮苷、橙皮苷5種化合物質(zhì)量濃度的RSD分別為0.21%、0.28%、0.33%、0.30%、0.49%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果5種化合物回收率的平均值分別為98.87%(RSD=0.43%)、98.79%(RSD=0.52%)、99.91%(RSD=0.39%)、98.82%(RSD=0.32%)、98.04%(RSD=0.72%)。

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果肝達(dá)康顆粒種芍藥苷、大葉茜草素、羥基茜草素、柚皮苷、橙皮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.484 72(RSD=0.65%)、1.022 40(RSD=0.27%)、0.558 74(RSD=0.34%)、0.436 32(RSD=0.64%)、1.974 01(RSD=0.44%)mg·g-1。

3 討論

芍藥苷、大葉茜草素、羥基茜草素、柚皮苷、橙皮苷5種化合物的UV最大吸收波長(zhǎng)各不相同[6-7]。對(duì)照品溶液經(jīng)過(guò)光電二極管矩陣檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描后，5種化合物在250 nm處吸收峰面積、峰高均較好，因此，最終選擇UV檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。研究表明，茜草中茜草素、大葉茜草素、羥基茜草素等有效成分設(shè)置柱溫為35 ℃[8]。畢秋佐等[9]使用HPLC法分離鑒定肝達(dá)康顆粒中白芍苷、橙皮苷、柚皮苷等成分柱溫設(shè)置為30℃。在正式實(shí)驗(yàn)前，對(duì)柱溫進(jìn)行摸索，設(shè)置25、30、35、40 ℃ 4個(gè)溫度，在綜合考慮分離度及保留時(shí)間下，選擇35 ℃。目前，HPLC流動(dòng)相的選擇主要集中在乙腈-水、乙腈-0.2%的磷酸水以及甲醇-水[10-11]。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別使用乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%的磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水和甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸水目標(biāo)化合物與肝達(dá)康顆粒中其他物質(zhì)分離度高，峰型好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，最終以乙腈-0.05%磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。曾分別使用50%甲醇、75%甲醇、甲醇對(duì)肝達(dá)康顆粒進(jìn)行提取，比較提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取劑雜質(zhì)峰較少，因此，選擇甲醇作為提取劑。對(duì)白芍中有效成分的提取主要方法主要有水提法及甲醇超聲提取法[12]。

本研究通過(guò)HPLC法對(duì)肝達(dá)康顆粒中芍藥苷、大葉茜草素、羥基茜草素、柚皮苷、橙皮苷5種化合物進(jìn)行檢測(cè)，考察了該方法的精密性、穩(wěn)定性、可重復(fù)性，結(jié)果顯示HPLC檢測(cè)肝達(dá)康顆粒中的有效成分具有精密度高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性較高、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)勢(shì)，可用于肝達(dá)康顆粒的質(zhì)量控制。