缺氧環(huán)境對(duì)新生SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響及與miR-124-3p的相關(guān)性研究

林超群 范學(xué)政 邱波

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)干細(xì)胞;缺氧環(huán)境;增殖;miR-124-3p

各國(guó)科學(xué)家于上世紀(jì)90年代開(kāi)始了神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的深入研究，研究人員對(duì)哺乳動(dòng)物腦組織進(jìn)行細(xì)胞群落篩選，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)不僅可以不斷分裂，還具有多分化潛能的細(xì)胞群落，把它命名為NSCs。腦缺血缺氧往往會(huì)導(dǎo)致NSCs的細(xì)胞活力受到抑制，甚至發(fā)生凋亡，而且NSCs對(duì)缺氧環(huán)境非常敏感，缺氧環(huán)境中NSCs非常容易發(fā)生延遲死亡。研究者發(fā)現(xiàn)在腦缺血缺氧大鼠模型中，NSCs可依然促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，但缺氧環(huán)境中，NSCs的神經(jīng)修復(fù)功能是否削弱，國(guó)內(nèi)外學(xué)者并未深入研究。近20年來(lái)的研究表明NSCs增殖能力可受到miRNA的調(diào)控，目前miRNA與NSCs功能的相關(guān)性研究正在逐步深入，其中miR-124-3p被證明與NSCs增殖關(guān)系密切，miR-124-3p的高表達(dá)可靶向抑制Delta-like1（DLL1）蛋白表達(dá)，促進(jìn)NSCs的增殖。但缺氧環(huán)境中，miR-124-3p與NSCs的相關(guān)性研究，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未報(bào)道。本研究建立缺氧NSCs模型及無(wú)缺氧NSCs模型，比較兩組模型NSCs的增殖能力，并且分析miR-124-3p與NSCs的相關(guān)性，為缺氧環(huán)境中NSCs增殖的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)本研究建立缺氧NSCs模型及無(wú)缺氧NSCs模型，比較兩組模型NSCs的增殖能力，并且分析miR-124-3p與NSCs的相關(guān)性，為缺氧環(huán)境中NSCs增殖的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

培養(yǎng)基 DMEM/F12為1∶1，B27細(xì)胞補(bǔ)充添加劑、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）重組鼠源表皮生長(zhǎng)因子及胰蛋白酶消化液來(lái)自于Gibco 公司（美國(guó)），重組鼠源堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因素青霉素-鏈霉素雙抗溶液來(lái)自于PeproTech公司（美國(guó)），Accutase分離液，美國(guó)Sigma-Aldrich公司、多聚賴氨酸PDL，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司、PBS 磷酸緩沖鹽溶液（pH7.2），美國(guó)Thermo Scientific公司、多聚甲醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、曲拉通Triton X-100來(lái)自于美國(guó)Amresco公司，小鼠抗兔多克隆抗體和兔抗小鼠IgG H&L采用美國(guó)Abcam公司、驢血清來(lái)自于美國(guó)Jackson 公司;4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液來(lái)自于雷根生物技術(shù)有限公司（北京）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒來(lái)自于凱基生物科技發(fā)展有限公司（南京）、RNA提取試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司。 三氣培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司;二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司;倒置熒光顯微鏡，日本Nikon 公司;激光共聚焦顯微鏡，美國(guó)OLYMPUS公司。

1.2 方法

（1）原代NSCs的提取培養(yǎng)（胎鼠海馬來(lái)源）。實(shí)驗(yàn)使用雌性大鼠為：孕14天SD大鼠，所有大鼠均來(lái)源于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（北京）。使用頸部脫臼的方法，結(jié)束孕14天SD大鼠的生命，在無(wú)菌操作臺(tái)，0 ℃環(huán)境中腹部解剖實(shí)驗(yàn)大鼠，取出胎鼠，逐步分離出胎鼠的大腦，顯微鏡下解剖出胎鼠海馬組織，顯微剪均勻海馬組織加入胰酶（0.25%）進(jìn)行5分鐘的消化處理，再給予胎牛血清（10%）對(duì)消化過(guò)程進(jìn)行終止，給予5分鐘的800r離心處理，棄上清液，加入NSCs完全培養(yǎng)后，仔細(xì)吹打均勻重懸，過(guò)400目細(xì)胞篩網(wǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，把細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/mL。在溫度37℃，二氧化碳濃度為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 天換液，7 天傳代，每天在顯微鏡下觀察NSCs的狀態(tài)，取第2代懸浮NSCs球進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

（2）NSCs免疫熒光鑒定。使用濃度為100 μg/mL的多聚賴氨酸預(yù)先包被24 孔板爬片，PBS 輕柔沖洗3次，取吹打均勻的第2代懸浮NSCs 200 μL放置在24孔爬片上，在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)120 min，在細(xì)胞出現(xiàn)貼壁反應(yīng)后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 輕柔沖洗3 次;加入0.3%曲拉通Triton X-100通透30 min，給予PBS實(shí)施3次的輕柔沖洗，給予驢血清（10%）實(shí)施一小時(shí)的37 ℃的封閉處理，不給予清洗操作，給予一抗（小鼠抗兔多克隆抗體Nestin），4度孵育過(guò)夜;PBS輕柔沖洗3次;在避光環(huán)境下加入同源熒光二抗（兔抗小鼠IgG H&L）在室溫下一小時(shí)的孵育處理，給予PBS反復(fù)3次沖洗操作;給予DAPI染核處理，再實(shí)施PBS反復(fù)3次沖洗操作，將爬片處理后放置在脫載玻片進(jìn)行封片處理，用熒光顯微鏡對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察分析。

（3）CCK8試驗(yàn)。用Accutase分離液消化第2代懸浮NSCs球，消化充分后細(xì)胞球消失，形成多個(gè)懸浮單個(gè)細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整，在96孔內(nèi)實(shí)施1×104個(gè)/孔密度的細(xì)胞設(shè)置，我們建立缺氧NSCs模型及無(wú)缺氧模型，缺氧模型為37度，50%空氣，45%N2，5%CO2，的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。無(wú)缺氧模型為37度，5%CO2，95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。我們將NSCs分為無(wú)缺氧組，缺氧組，兩組不同細(xì)胞分別接種于96孔板，無(wú)缺氧組在無(wú)缺氧環(huán)境中培養(yǎng)72小時(shí)。缺氧組在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)72小時(shí)，然后每個(gè)孔給予10 μLCCK8 試劑的加入，并實(shí)施兩小時(shí)的37 ℃溫度下的孵育處理，對(duì)450 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度水平實(shí)施酶標(biāo)儀的檢測(cè)處理，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)。

（4）不同缺氧環(huán)境中NSCs增殖的形態(tài)學(xué)鑒定。為了研究缺氧環(huán)境中NSCs的增殖能力，取第2代懸浮NSCs，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，把細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/mL。將NSCs分為無(wú)缺氧組和缺氧組，兩組不同細(xì)胞在不同缺氧環(huán)境中培養(yǎng)，72小時(shí)后在顯微鏡下觀察NSCs的狀態(tài)。

（5）RT-PCR檢測(cè)miR-124-3p的表達(dá)水平為了檢測(cè)2組不同細(xì)胞miR-124-3p的表達(dá)水平，我們收集無(wú)缺氧組及缺氧組細(xì)胞后，使用Trizol法提取RNA，以37度持續(xù)60 分鐘，85 度持續(xù)5分鐘進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng);然后95度預(yù)變性10 分鐘;95度變性20秒;60度退火15秒，72度延伸收集30秒，一共40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt 法計(jì)算miR-124-3p基因的相對(duì)表達(dá)量，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并取其均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上各項(xiàng)指標(biāo)給予（x—±s）進(jìn)行表示，開(kāi)展GraphPad8.0軟件及SPSS 22.0軟件對(duì)符合方差齊性及正態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料實(shí)施t檢驗(yàn)的處理，當(dāng)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代胎鼠海馬來(lái)源NSCs形態(tài)及鑒定

NSCs懸浮生長(zhǎng)，隨著增殖的NSCs逐漸融合，6～7天后，肉眼就能辨認(rèn)出含有數(shù)千個(gè)細(xì)胞的大神經(jīng)球（圖A1～A2）。原代NSCs在體外是神經(jīng)球樣的，通過(guò)免疫熒光法證實(shí)表達(dá)NSCs的特異性標(biāo)記蛋白Nestin（圖B1～B2）。

2.2 不同缺氧環(huán)境對(duì)NSCs活力的影響

本研究采用CCKB實(shí)驗(yàn)評(píng)估顯示，在缺氧環(huán)境中，NSCs的細(xì)胞活力明顯下降（P<0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 兩種不同缺氧環(huán)境中原代NSCs增殖培養(yǎng)的形態(tài)

實(shí)驗(yàn)分組后，72 h后在顯微鏡下觀察NSCs的狀態(tài)：無(wú)缺氧組見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞顯著增殖呈懸浮聚集成球生長(zhǎng)，只有少數(shù)細(xì)胞呈單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)。缺氧組少部分細(xì)胞成球生長(zhǎng)，大部分仍呈單細(xì)胞生長(zhǎng)，見(jiàn)圖3。

2.4 缺氧環(huán)境中NSCs的miR-124-3p的表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)分組后，72 h后使用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組不同細(xì)胞miR-124-3p的表達(dá)水平。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在缺氧環(huán)境中，miR-124-3p的表達(dá)量明顯下降，見(jiàn)圖4。

3 討論

本研究的目的是探討缺氧環(huán)境對(duì)新生SD大鼠NSCs增殖的影響，并且分析miR-124-3p與NSCs的相關(guān)性，為缺氧環(huán)境中NSCs增殖的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)[1-2]。本研究結(jié)果表明，在缺氧環(huán)境中，新生SD大鼠NSCs增殖受到明顯抑制[3]，并且NSCs中miR-124-3p的表達(dá)量高低與不同缺氧環(huán)境具有相關(guān)性[4]。

自從1992年Reynolds首次提出NSCs的概念后，通過(guò)NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)帶來(lái)了新希望。miR-124-3p作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性的miRNA，在NSC 的增殖與向神經(jīng)性分化過(guò)程中，起著關(guān)鍵性的作用[5]。研究證明，miR-124-3p的高表達(dá)可靶向抑制Delta-like1（DLL1）蛋白表達(dá)，促進(jìn)NSCs的增殖，在NSC 的維持與神經(jīng)再生中起關(guān)鍵作用[6].。在本研究中，我們建立缺氧NSCs模型的建立，證實(shí)了缺氧環(huán)境對(duì)NSCs增殖的影響非常大，同時(shí)也明確了miR-124-3p的表達(dá)量與缺氧環(huán)境的相關(guān)性，但miR-124-3p具體通過(guò)何種通路，在缺氧環(huán)境中調(diào)控NSCs的增殖機(jī)制研究，本研究并未明確，需要進(jìn)一步研究來(lái)揭示這一機(jī)制。本研究有一定的局限性。由于本研究是在體外進(jìn)行的，因此在體內(nèi)缺氧環(huán)境中進(jìn)一步NSCs的增殖機(jī)制仍有必要[7-8]。

綜上所述，在缺氧環(huán)境中，新生SD大鼠NSCs增殖受到明顯抑制;NSCs中miR-124-3p的表達(dá)量高低與不同的缺氧環(huán)境具有相關(guān)性。