扶正口服液通過STAT3-RORγt信號(hào)通路對(duì)胃癌小鼠Th17細(xì)胞的調(diào)控作用

王理槐 孫銀輝

【關(guān)鍵詞】胃癌;扶正口服液;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3;維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt;輔助性T細(xì)胞17

近年來，有關(guān)胃癌患者其輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）及維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（retinoid-related orp han nuclear receptor γt，RORγt）表達(dá)增加的報(bào)道相繼涌現(xiàn)[1-2]。基礎(chǔ)研究亦證實(shí)了白細(xì)胞介素-17（IL-17）具有較強(qiáng)促瘤作用，IL-17抑制劑或可成為胃癌治療的新思路[3]。扶正口服液是我院腫瘤科長(zhǎng)期臨床探索中研制而成的院內(nèi)制劑，該方以李東垣“補(bǔ)脾胃、瀉陰火”學(xué)說為指導(dǎo)，具有健脾益氣、活血散結(jié)之功。本研究基于本院采用扶正口服液輔助治療胃癌的確切療效，研究扶正口服液通過STAT3-RORγt信號(hào)通路調(diào)控胃癌荷瘤小鼠Th17細(xì)胞分化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物

SPF級(jí)KM小鼠50只，雌雄各半，體重18～22 g，6～8周齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物使用符合我?！秾?shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定》。

扶正口服液每1000 mL含：莪術(shù)220 g、生丹參147 g、當(dāng)歸147 g、黃連44 g、蒲公英440 g、白花蛇舌草440 g、黨參147 g、蜜麩炒白術(shù)147 g、生甘草88 g、制半夏147 g、陳皮88 g、白茯苓176 g。將扶正口服液以生理鹽水稀釋至0.45 g/ mL，根據(jù)換算系數(shù)，小鼠等效給藥量為0.2 mL/10 g，并依此設(shè)置低劑量、中劑量、高劑量（0.1 mL/10 g、0.2 mL/10 g、0.4 mL/10 g）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901置于含10%滅活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，于37℃、5%CO2、濕度合適的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物造模

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞株，在無菌條件下分別用0.25%胰蛋白酶消化制備成3×107個(gè)/mL細(xì)胞懸液，以0.1 mL/只接種于50只裸小鼠右側(cè)腋窩下。待腫瘤生長(zhǎng)至100～200 mm3后，選取合適裸小鼠40只備用。

1.2.3 分組及給藥

將40只荷瘤小鼠隨機(jī)分為空白組，陽性對(duì)照組（5-FU組），低、中、高劑量組，每組8只?？瞻捉M：生理鹽水灌胃，每次劑量為0.2 mL/10 g，1次/d;另腹腔注射生理鹽水，每次劑量為0.1 mL/10 g，2次/周。5-Fu組：將5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）以生理鹽水稀釋至5 mg/mL，腹腔注射給藥，每次劑量為0.1 mL/10 g，2次/周;另以生理鹽水灌胃，每次劑量為 0.2 mL/10 g，1次/d。低、中、高劑量組：生理鹽水稀釋后的扶正口服液灌胃，低、中、高劑量組每次劑量分別0.1 mL/10 g、0.2 mL/10g、0.4 mL/10 g，1次/d;另腹腔注射生理鹽水，每次劑量為0.1 mL/10 g，2次/周。給藥28天后，將小鼠摘除眼球取血，手術(shù)剝?nèi)×鰤K。

1.3 指標(biāo)觀察

瘤體體積：給藥前后測(cè)量瘤體最長(zhǎng)徑（a）和最短徑（b），并根據(jù)公式V=πab2/6（mm3）算出瘤體體積。

腫瘤抑制率：計(jì)算腫瘤的生長(zhǎng)抑制率=（Cweight-Tweight） /Cweight×100%，Tweight為給藥組小鼠體積、Cweight為空白組小鼠平均體積。

STAT3、RORγt 信使RNA（mRNA）的表達(dá)：采用RT-PCR法檢測(cè)，將腫瘤組織剪碎并加入Trizzol冰上勻漿，抽提RNA并測(cè)定濃度，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)STAT3 RORγt mRNA的表達(dá)情況。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，72 ℃5 min，循環(huán)次數(shù)為40，設(shè)GAPDH作為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì)見表1。

STAT3、RORγt的蛋白表達(dá)：采用Western Blot法檢測(cè)，將腫瘤組織剪碎后加入RIPA裂解液并在冰浴條件下超聲勻漿裂解后加入PMSF及Complete 液，4℃12000rct離心15min得到蛋白樣品，應(yīng)用BCA分析試劑測(cè)定蛋白濃度，50 μg蛋白質(zhì)在SDS-PAGE 電泳分離，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃過夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次。以GAPDH蛋白的表達(dá)為內(nèi)參照。

血清IL-17、IL-22、IL-6水平采用ELISA法檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，操作嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件處理，計(jì)量資料采用（x—±s）表示，多組間比較采用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，當(dāng)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組瘤體體積比較

給藥后，5-FU組，低、中、高劑量組瘤體體積均小于空白組，5-FU組瘤體體積均小于低、中劑量組，5-FU組瘤體生長(zhǎng)抑制率均高于低、中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.2 各組STAT3、RORγt mRNA表達(dá)情況

中、高劑量組STAT3、RORγt mRNA表達(dá)量均低于空白組、5-FU組、低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.3 各組STAT3、RORγt蛋白表達(dá)情況

中、高劑量組STAT3、RORγt蛋白蛋白表達(dá)均低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.4 血清Th17相關(guān)炎癥因子水平

低、中、高劑量組血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于空白組，中、高劑量組血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于5-FU組和低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

3 討論

根據(jù)胃癌臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)“積聚”范疇，其多由飲食不節(jié)日久致胃失和降或痰熱毒瘀交阻于胃而成，病機(jī)總屬虛實(shí)夾雜，因此當(dāng)健脾益氣以補(bǔ)虛，活血散結(jié)以祛邪[4]。

本研究中，給藥后，5-FU組，低、中、高劑量組瘤體體積均小于空白組，5-FU組瘤體體積均小于低、中劑量組，5-FU組瘤體生長(zhǎng)抑制率均高于低、中劑量組。表明中、高劑量的扶正口服液對(duì)于胃癌小鼠均有抗癌抑瘤作用，劑量越高，效果越明顯，高劑量的扶正口服液效果與胃癌常用的抗腫瘤藥5-氟尿嘧啶無明顯差別。扶正口服液組成為莪術(shù)、丹參、當(dāng)歸、黃連、蒲公英、白花蛇舌草、黨參、白術(shù)、半夏、陳皮、茯苓、甘草。其中黨參、當(dāng)歸可補(bǔ)氣養(yǎng)血，白術(shù)、茯苓健運(yùn)脾胃，以除胃癌病久之虛，莪術(shù)、丹參活血行氣，半夏、陳皮燥濕化痰，蒲公英、白花蛇舌草散結(jié)消癥，與黃連合用還可清熱解毒，甘草調(diào)和諸藥，固護(hù)胃氣，諸藥合用則補(bǔ)氣養(yǎng)血與健脾護(hù)胃并舉，痰、濕、瘀、熱、毒共治，扶正與祛邪兼顧[5-7]。

研究證實(shí)[8-9]，Th17在胃癌患者中明顯升高，其釋放的炎性介質(zhì)可促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，同時(shí)還可導(dǎo)致Th17/Treg的免疫失衡，進(jìn)而加重胃癌患者的免疫抑制，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17、IL-22、IL-6等促炎因子發(fā)揮促炎作用，誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展，同時(shí)IL-6分泌過多，還可使抑炎因子TGF-β負(fù)相調(diào)控T細(xì)胞，使其向Th17分化，減少Treg細(xì)胞數(shù)量，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)[10-11]。而STAT3-RORγt信號(hào)通路與Th17的分化及促炎機(jī)制密切相關(guān)，STAT3是Th17增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路代表因子，而RORγt則是其特異性轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)STAT3功能亢進(jìn)時(shí)，STAT磷酸化增加，并可提高bcl-2和bcl-xL對(duì)機(jī)體炎癥細(xì)胞的抗凋亡作用，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖及毒性T細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而增加Th17細(xì)胞的分化及加重機(jī)體炎癥損傷。此外，STAT3上調(diào)還可激活RORγt的過度表達(dá)，已有研究[12]顯示，RORγt缺乏小鼠，其Th17細(xì)胞數(shù)量明顯低于正常小鼠，而在初始T細(xì)胞中加入編碼RORγt的逆轉(zhuǎn)錄病毒，可明顯促進(jìn)IL-17、IL22等Th17相關(guān)因子的分泌。

本研究還顯示中、高劑量組STAT3、RORγt mRNA均低于空白組、5-FU組和低劑量組，蛋白表達(dá)量均低于空白組，此外，低、中、高劑量組血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于空白組，中、高劑量組血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于5-FU組和低劑量組。表明扶正口服液可通過下調(diào)STAT3、RORγt表達(dá)，抑制Th17細(xì)胞分化，減少Th17相關(guān)細(xì)胞因子分泌，抑制Th17細(xì)胞分化，進(jìn)而發(fā)揮抗癌作用，其效果與劑量相關(guān)，較低劑量時(shí)無明顯作用。而5-氟尿嘧啶則無此調(diào)控作用，其抗癌機(jī)制與扶正口服液并不相同。

綜上所述，高劑量扶正口服液可下調(diào)STAT3、RORγt的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌小鼠Th17的分化發(fā)揮抑瘤作用。