一株金龜子綠僵菌對(duì)茶尺蠖的致病力和胞外酶活性

陳 峰，王長(zhǎng)方，王 俊，陳文樂(lè)，胡進(jìn)鋒，吳 瑋，姚錦愛(ài)*

（1. 福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州 350013；2. 三明市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，三明 365000）

茶尺蠖 Ectropis oblique又名茶尺蛾、俗稱(chēng)拱拱蟲(chóng)，屬鱗翅目 Lepidoptera尺（蛾）蠖科 Geometridae，在我國(guó)浙、蘇、皖等地茶區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，是引起我國(guó)茶樹(shù)生產(chǎn)問(wèn)題的重要害蟲(chóng)之一[1]。茶尺蠖以幼蟲(chóng)取食茶葉造成主要危害，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可將茶樹(shù)葉片及嫩芽全部吃光，對(duì)茶葉的品質(zhì)及產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。對(duì)其防治需要尋找一種較為安全、有效和經(jīng)濟(jì)的防控措施?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)該蟲(chóng)的防控偏重于使用化學(xué)農(nóng)藥，易造成“3R”和藥害問(wèn)題[2-4]。生物防治是一種安全、有效、持久的控害方法，且蟲(chóng)生真菌挖掘利用已成為害蟲(chóng)生防的重要發(fā)展方向之一[5-7]。目前，雖然已有球孢白僵菌Beauveria bassiana的一些菌株用于防控楊尺蠖Apocheima cinerarius等害蟲(chóng)[8]，但由于不同地理和寄主來(lái)源的菌株具有一定的寄主專(zhuān)化性，對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的致病力也存在差異，因此有必要再探尋一些相對(duì)廣譜的蟲(chóng)生真菌菌株用于防控茶尺蠖。為此，本研究嘗試從茶園腐殖層昆蟲(chóng)尸體上分離蟲(chóng)生真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征觀察和rDNA-ITS序列分析方法確定其分類(lèi)地位，測(cè)定菌株對(duì)茶尺蠖的胞外酶活性和毒力，探討它的生防潛力和應(yīng)用前景，為利用蟲(chóng)生真菌防控茶樹(shù)害蟲(chóng)提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株分離自福建省茶園腐殖層昆蟲(chóng)尸體；供試茶尺蠖幼蟲(chóng)采集于福建省茶園，在溫度25～26 ℃、相對(duì)濕度55%～60%、光周期14L:10D條件下飼養(yǎng)至次代，取食量最大、為害最重的4齡幼蟲(chóng)備用；供試試劑均為分析純。DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；所用引物ITS1/ITS4由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 菌株鑒定

1.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 參照形態(tài)描述進(jìn)行菌株的初步鑒定[9,10]。將供試菌株接種于 PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d 后在顯微鏡下觀察菌株菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)大小等分類(lèi)特征并照相。

1.2.2 菌株分子鑒定 用DNA提取試劑盒提取DNA后，采用 ITS 序列進(jìn)行菌株的分子生物學(xué)鑒定。所用引物為 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）；PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，引物各 1.0 μL，ddH2O 8.5 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，54 ℃退火 50 s，50 ℃～55 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果與 GenBank 基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，為明確菌株與同屬其他種的親緣關(guān)系，選擇已公布的具有代表性的菌株序列，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 供試菌株對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)的致病力測(cè)定

將保存的供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基平板上，置于溫度28 ℃的HGZ-150型光照培養(yǎng)箱內(nèi)活化培養(yǎng)8 d；然后加入5 mL含0.05%吐溫-80的無(wú)菌水脫溶孢子，經(jīng)3層脫脂紗布過(guò)濾得孢子原液；用紐鮑爾血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在NIKON E200型生物顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢子原液的孢子數(shù)并計(jì)算孢子濃度，制成1.00×108cfu/mL的孢子原液備用。

取制備的孢子原液，以10的梯度稀釋4次，分別獲得濃度為1.00×104、1.00×105、1.00×106、1.00×107、1.00×108cfu/mL的5個(gè)溶液，以0.05%吐溫-80無(wú)菌水作空白對(duì)照，共6個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次；取直徑為12 cm的塑料盤(pán)，在底部鋪上直徑為10 cm的吸水棉，再蓋上一層相同直徑的濾紙片，加入10 mL無(wú)菌水，放3片的茶嫩葉，用軟毛筆向每個(gè)處理挑取供試茶尺蠖4齡幼蟲(chóng)15只，浸泡10 s后挑到濾紙上，晾干2 min后再挑到葉片上，保鮮膜封口；扎孔通氣，后置于與1.1相同條件的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，每24 h觀察、記錄死蟲(chóng)數(shù)（死亡蟲(chóng)體長(zhǎng)出菌絲計(jì)為有效感染，每次記錄后挑除死亡蟲(chóng)體），并及時(shí)更換茶嫩葉，10 d后統(tǒng)計(jì)試蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率，并計(jì)算供試菌株對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)的LC50和LT50。

1.4 供試菌株胞外酶活性測(cè)定

將茶尺蠖4齡幼蟲(chóng)置于-80 ℃冰箱中速凍2 h，再置于80 ℃的DHG-9030型電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，將烘干的蟲(chóng)體研磨成細(xì)粉末；參考董晶[11]的方法稱(chēng)取（K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g和FeSO4·7H2O 0.01 g溶于1000 mL蒸餾水中，制成察氏液體培養(yǎng)基）；稱(chēng)取茶尺蠖蟲(chóng)尸粉0.2 g作為唯一的碳、氮源，加入含有250 mL察氏液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于121 ℃的LDZX-50FFBS型不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌20 min，冷卻后制成含酶活誘導(dǎo)基質(zhì)的察氏液體培養(yǎng)基備用。

參考董晶[11]的方法，將上述制備的含酶活誘導(dǎo)基質(zhì)的察氏液體培養(yǎng)基接種10 mL制備的孢子懸浮液（1×108cfu/mL），置于ZWY-240型旋轉(zhuǎn)式搖床上，于溫度 25 ℃、125 r/min條件下，連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天取3份2 mL的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液在冷凍離心機(jī)4 ℃下12000 g 離心20 min。取上清液即為粗酶液，將粗酶液保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用。蛋白酶活性測(cè)定：取待測(cè)粗酶液1.0 mL加入1.0 mL酪蛋白溶液（以酪蛋白為底物，加入0.05 mol/L、pH 8.5的Tris HCl緩沖液配成的1% W/V 酪蛋白溶液）；參考黃鵬等[12]的方法，檢測(cè)供試粗酶液活性，以每分鐘催化分解酪蛋白生成 1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)酶活單位。幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定：取待測(cè)粗酶液0.5 mL加入0.5 mL膠狀幾丁質(zhì)，參考黃鵬等[12]的方法，檢測(cè)供試粗酶液活性，以每分鐘催化分解幾丁質(zhì)生成1 μg N-乙酰酰氨基葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活單位。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Mega 5.2軟件對(duì)供試菌株進(jìn)行多序列比對(duì)，以NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行聚類(lèi)分析。在DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件上，利用機(jī)率值分析法計(jì)算供菌株對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)的LC50和LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 供試菌株經(jīng)侵染試驗(yàn)驗(yàn)證、對(duì)茶尺蠖4齡幼蟲(chóng)具有毒力（圖1A）。菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d時(shí)，菌落為淡黃色、圓形放射狀生長(zhǎng)、邊緣為短絨狀白色菌絲（圖1B）；培養(yǎng)10 d時(shí)，菌落外半部產(chǎn)生墨綠色分生孢子層，呈環(huán)形堆積狀向四周擴(kuò)散，并形成皺褶（圖 1C）。顯微鏡下進(jìn)行觀察，菌絲透明、寬1.6～2.1 μm，具分支和分隔（圖1D）。分生孢子梗為圓柱狀瓶梗，寬1.9～2.7 μm單生或聚集（圖1E），從小?；啃纬赡钪闋罨蜷L(zhǎng)鏈狀排列的分生孢子（圖1D）；分生孢子單細(xì)胞，淡綠色，長(zhǎng)橢圓形至短棒狀，大小為（6.2～8.9）μm×（2.1～3.1）μm（圖1 F）。

圖1 菌株CHMA?005孢子和菌絲不同時(shí)期的形態(tài)觀察Fig. 1 Morphological observation for spores and hyphae of strain CHMA?005 at different stages

2.1.2 分子鑒定 通過(guò)引物ITS1/ITS4對(duì)菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR后獲得長(zhǎng)度為527 bp的rDNA- ITS基因序列，經(jīng)BLAST比對(duì)，與 M. anisopliae 菌株（登錄號(hào)：MN727141；EF051728）相似度均達(dá)到99%以上。使用MEGA 5.2構(gòu)建NJ（Neighbor-joiningmethod）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可觀察到菌株CHMA-005與MN727141和 EF051728聚為一支（圖 2），因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及分子學(xué)分析，將本次分離的菌株鑒定為金龜子綠僵菌。并將本株金龜子綠僵菌登陸至GenBank，登錄號(hào)為MN883882。

圖2 基于rDNA?ITS序列的菌株CHMA?005及其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 The phylogenetic tree of the strain CHMA?005 and others related species based on rDNA?ITS sequences by ML method

2.2 供試菌株對(duì)茶尺蠖的致病力

供試菌株 5個(gè)處理濃度對(duì)茶尺蠖的毒力各不相同。隨著濃度的提高，致死能力越強(qiáng)，其中 1.00×108濃度處理的茶尺蠖幼蟲(chóng)的死亡率在第8 d時(shí)達(dá)到100%；1.00×107和1.00×106cfu/mL濃度處理的茶尺蠖幼蟲(chóng)的死亡率在第10 d時(shí)達(dá)到100%；而1.00×105和1.00×104cfu/mL濃度處理的茶尺蠖幼蟲(chóng)的死亡率在第10 d時(shí)僅為83.33 %和75%（圖3）。

圖3 金龜子綠僵菌菌株CHMA?005對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)的致病力Fig. 3 Pathogenicity of M. anisopliae CHMA?005 aganist E. oblique

供試菌株在不同侵染時(shí)間下對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)的 LC50各不相同；LC50隨侵染時(shí)間的減少，呈現(xiàn)梯度上升趨勢(shì)，侵染的時(shí)間越短，LC50越大，在第4 d時(shí)LC50最大，為2.27×109cfu/mL；侵染的時(shí)間越短，LC50越小，第8 d時(shí)LC50最小，為1.84×104cfu/mL（表1）。

表1 金龜子綠僵菌菌株CHMA?005對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)的LC50Table 1 LC50 of M. anisopliae CHMA?005 against E. oblique

供試菌株在不同濃度下對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)的LT50各不相同；其中1.00×108、1.00×107和1.00×106cfu/mL濃度處理的LT50時(shí)間較短，分別為3.57、4.52和5.03 d；1.00×105cfu/mL濃度處理的LT50時(shí)間較長(zhǎng)，為6.98 d；1.00×104cfu/mL濃度處理的LT50時(shí)間最長(zhǎng)，為7.77 d，是1.00×108cfu/mL濃度處理的2.17倍（表2）。

表2 金龜子綠僵菌菌株CHMA?005對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)的LT50Table 2 LT50 of M. anisopliae CHMA?005 against of E. oblique

2.3 供試菌株的胞外酶活性

供試菌株在不同誘導(dǎo)時(shí)間下的 2種胞外酶活性各不相同。金龜子綠僵菌的蛋白酶活性在第 1 d時(shí)為15.90 U/mL，并在之后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；第6 d時(shí)達(dá)到最大值，為27.73 U/mL；在之后的第7～10 d，蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。最終在第10 d降為20.47 U/mL。幾丁質(zhì)酶活性，在第1 d時(shí)為19.10 U/mL，并在之后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；第6 d時(shí)達(dá)到最大值，為31.43 U/mL；在之后的第7 d至第10 d，蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。最終在第10 d降為25.20 U/mL（圖4）。

圖4 金龜子綠僵菌菌株的胞外酶活性Fig. 4 Extracellular enzyme activity of M. anisopliae

3 討論

利用蟲(chóng)生真菌對(duì)害蟲(chóng)進(jìn)行生物防控，因其與環(huán)境友好、對(duì)人畜相對(duì)安全、易于規(guī)模生產(chǎn)、又不產(chǎn)生害蟲(chóng)抗性等問(wèn)題，日益受到人們的重視和青睞。目前，雖然已有球孢白僵菌的一些菌株用于防控楊尺蠖等害蟲(chóng)[8]，但由于不同地理和寄主來(lái)源的菌株具有一定的寄主專(zhuān)化性，對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的致病力也存在差異，因此有必要再探尋一些相對(duì)廣譜的蟲(chóng)生真菌菌株用于防控茶尺蠖。本研究從茶園腐殖層蟲(chóng)尸上分離獲得一株可侵染茶尺蠖的蟲(chóng)生真菌CHMA-005，通過(guò)菌落外觀特征、菌絲和分生孢子顯微觀察初步確定為綠僵菌，鑒定后又對(duì)該菌株ITS 序列進(jìn)行測(cè)定（GenBank登錄號(hào)為MH898794），同時(shí)對(duì)GenBank近源序列進(jìn)行比對(duì)和聚類(lèi)分析，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)菌株為金龜子綠僵菌。

生物防治潛力評(píng)估是評(píng)價(jià)和利用蟲(chóng)生真菌進(jìn)行害蟲(chóng)防治的基礎(chǔ)，評(píng)價(jià)指標(biāo)主要涉及菌株致病力等[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌CHMA-005菌株侵染茶尺蠖4齡幼蟲(chóng)10 d后，致死率、LC50和LT50分別可達(dá)100%、1.84×104cfu/mL和3.57 d，高于姚紅青等[8]利用球孢白僵菌Beauveria bassiana TST05侵染楊尺蠖的效果；該菌株蛋白酶活性和幾丁質(zhì)酶活性均在第6 d達(dá)到最大值，分別為31.43和27.73 U/mL，略高于李保國(guó)[15]測(cè)定的金龜子綠僵菌M7-5-7胞外蛋白酶活性和幾丁質(zhì)酶活性?？梢?jiàn)，金龜子綠僵菌CHMA-005對(duì)茶尺蠖的致病力和胞外酶活性高，具有良好的生防潛力和應(yīng)用前景。

本研究雖初步明確了金龜子綠僵菌 CHMA-005對(duì)茶尺蠖的致病力和胞外酶活性，但對(duì)該菌的田間防效及茶尺蠖幼蟲(chóng)在侵染過(guò)程中的蟲(chóng)體組織器官病理變化情況、保護(hù)酶和解毒酶活性的變化等防御反應(yīng)情況尚不明確，因此今后可繼續(xù)開(kāi)展此方面的相關(guān)研究，以期為利用蟲(chóng)生真菌防控茶尺蠖等茶園害蟲(chóng)提供更多的支持。