基于同步熒光光譜的雞肉中甲磺酸達(dá)氟沙星和氧氟沙星殘留快速檢測(cè)方法研究

陳 健,黃俊仕,2,劉木華,2,袁海超,2,黃雙根,2，趙進(jìn)輝,2*,徐 寧,王 婷,胡 圍

1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江西 南昌 330045

引 言

喹諾酮類抗生素(Quinolones)是一類人工合成的廣譜抗生素，在家禽飼養(yǎng)和疾病的防治中被廣泛應(yīng)用[1]。我國(guó)的家禽養(yǎng)殖向著規(guī)模化、集約化方向發(fā)展，抗生素發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，但抗生素的不規(guī)范、不合理使用導(dǎo)致禽肉抗生素殘留的問(wèn)題也日趨嚴(yán)重[2]。甲磺酸達(dá)氟沙星(danofloxacin mesylate，DFM)和氧氟沙星(ofloxacin，OFL)是常用的喹諾酮類抗生素，其殘留進(jìn)入人體可能引起癌癥、基因突變等[3]。因此，建立一種快速、經(jīng)濟(jì)的雞肉中DFM和OFL殘留的檢測(cè)方法是一項(xiàng)十分有意義的工作?；趯?duì)消費(fèi)者安全的考慮，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部限定了雞肉中喹諾酮類抗生素的最大殘留限量，其中達(dá)氟沙星的最大殘留限量為200 μg·kg-1，OFL被禁用[4-5]。

目前，液相色譜法[6-7]、液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法[8-9]等方法可用于雞肉中喹諾酮類抗生素殘留的檢測(cè)，這些方法雖然有較高的靈敏度，但儀器昂貴、運(yùn)行成本高且需要較高的操作水平[10]。同步熒光技術(shù)同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射單色器波長(zhǎng)，同時(shí)利用了化合物的吸收特性和發(fā)射特性，具有簡(jiǎn)化光譜、窄化譜帶、減弱背景干擾和降低散射光等優(yōu)點(diǎn)[11]。近年來(lái)，李月秋等[12]應(yīng)用同步熒光技術(shù)檢測(cè)豬肉中頭孢噻呋抗生素的殘留量，蔡其洪等[13]應(yīng)用同步熒光技術(shù)檢測(cè)火腿腸、豬肉、魚肉、鴨肉和雞肉中氟羅沙星抗生素的殘留量。本研究以雞肉為載體，DFM和OFL抗生素為研究對(duì)象，應(yīng)用同步熒光技術(shù)嘗試建立一種雞肉中DFM和OFL殘留快速檢測(cè)的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)(Cary Eclipse，美國(guó)瓦里安)；電子天平(FA1004B，上海上平儀器有限公司)；純水機(jī)(全自動(dòng)RO，湖南科爾頓水務(wù)有限公司)；超聲波清洗器(JK-50B，合肥金尼克機(jī)械有限公司)；漩渦混合器(VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器有限公司)；振蕩器(KJ-201BS，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；低速離心機(jī)(JW-1024，安徽嘉文儀器裝備有限公司)；組織搗碎勻漿機(jī)(JJ-2B，江蘇省金南儀器廠)；石英比色皿(1 cm光程，宜興市晨偉玻璃儀器廠)。

雞胸肉(南昌市某大型超市)；DFM和OFL(≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；乙腈、甲酸和氫氧化鈉(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；十二烷基硫酸鈉(分析純，SDS，金克隆北京生物技術(shù)有限公司)；溴代十六烷基三甲胺(分析純，CTAB，金克隆北京生物技術(shù)有限公司)；壬基酚聚氧乙烯醚系列(7)醚(分析純，NP-7，上海麥克林生化科技有限公司)；有機(jī)相針式濾器(0.45 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

1.2 樣品制備

(1)抗生素儲(chǔ)備液的配制：取5.0 mg的DFM(或OFL)標(biāo)準(zhǔn)品溶于50 mL超純水，可得到100 mg·L-1DFM(或100 mg·L-1OFL)儲(chǔ)備液，于4 ℃下儲(chǔ)存。

(2)抗生素工作液的配制：取0.15 mL的DFM(或OFL)儲(chǔ)備液，用超純水稀釋至15 mL得到1.0 mg·L-1DFM(或OFL)工作液，于4 ℃下儲(chǔ)存。

(3)根據(jù)文獻(xiàn)[14]中的快速溶劑萃取法提取空白雞肉，略作修改，具體如下：稱取均質(zhì)的雞胸肉1.0 g，置于10 mL離心管中，加入2%甲酸-乙腈溶液4 mL，渦旋1 min，然后，于離心機(jī)上以4 000 r·min-1的速率離心5 min，將上清液移入另一個(gè)10 mL離心管中，將離心殘?jiān)? mL 2%甲酸-乙腈溶液再提取一次，合并上清液，混勻，過(guò)0.45 μm濾膜，用2%甲酸-乙腈定容至10 mL，得到空白雞肉提取液。

(4)根據(jù)文獻(xiàn)[14]中的快速溶劑萃取法提取雞肉中DFM和OFL的殘留，略作修改，具體如下：①加標(biāo)雞肉的制備：稱取均質(zhì)的雞胸肉1.0 g，置于10 mL離心管中，分別添加0.01，0.04，0.08，0.10，0.12，0.16，0.20，0.24，0.28，0.32，0.36，0.40和0.44 mL 的DFM儲(chǔ)備液和0.01，0.04，0.08，0.10，0.12，0.16，0.20，0.24，0.28，0.32，0.36，0.40和0.44 mL的OFL儲(chǔ)備液，兩者濃度隨機(jī)組合，渦旋1 min。②雞肉中抗生素的提?。涸偌尤?%甲酸-乙腈溶液4 mL，渦旋1 min，然后，于離心機(jī)上以4 000 r·min-1的速率離心5 min，將上清液移入另一個(gè)10 mL離心管中，將離心殘?jiān)? mL 2%甲酸-乙腈溶液再提取一次，合并上清液，混勻，過(guò)0.45 μm濾膜，用2%甲酸-乙腈定容至10 mL。得到含DFM和OFL的雞肉提取液：DFM濃度為0.1，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6，4.0和4.4 mg·L-1(分別對(duì)應(yīng)于雞肉中含有1.0，4.0，8.0，10.0，12.0，16.0，20.0，24.0，28.0，32.0，36.0，40.0和44.0 mg·kg-1DFM)，OFL濃度為0.1，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6，4.0和4.4 mg·L-1(分別對(duì)應(yīng)于雞肉中含有1.0，4.0，8.0，10.0，12.0，16.0，20.0，24.0，28.0，32.0，36.0，40.0和44.0 mg·kg-1OFL)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液以及雞肉提取液的同步熒光光譜的采集

為了采集標(biāo)準(zhǔn)溶液以及雞肉提取液的同步熒光光譜，分別取500 μL DFM標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg·L-1)、OFL標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg·L-1)、空白雞肉提取液和含DFM和OFL的雞肉提取液(1.0 mg·kg-1DFM，1.0 mg·kg-1OFL)于不同的石英比色皿中，再先后加入130 μL SDS緩沖液(0.1 mol·L-1)，670 μL氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)，采集波長(zhǎng)差Δλ=130和200 nm處的同步熒光光譜。

1.4 定性試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

(1)為了探究不同氫氧化鈉溶液濃度對(duì)同步熒光強(qiáng)度的影響，向石英比色皿中依次加入500 μL含DFM和OFL的雞肉提取液(1.0 mg·kg-1DFM，1.0 mg·kg-1OFL)，130 μL SDS溶液(0.1 mol·L-1)，670 μL氫氧化鈉溶液(0.001，0.01，0.1，0.2，0.3和0.4 mol·L-1)，設(shè)置5個(gè)平行組，采集Δλ=130和200 nm處的同步熒光光譜。

(2)為了探究不同表面活性劑對(duì)同步熒光強(qiáng)度的影響，向石英比色皿中依次加入500 μL含DFM和OFL的雞肉提取液(1.0 mg·kg-1DFM，1.0 mg·kg-1OFL)，130 μL CTAB表面活性劑(0.019 mol·L-1)或SDS表面活性劑溶液(0.1 mol·L-1)或NP-7表面活性劑(5.33 mmol·L-1)，670 μL氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)，設(shè)置5個(gè)平行組，采集Δλ=130和200 nm處的同步熒光光譜。

1.5 定量試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

向石英比色皿中依次分別加入500 μL的含不同濃度DFM和OFL的雞肉提取液，130 μL SDS溶液(0.1 mol·L-1)，670 μL氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)，設(shè)置5個(gè)平行組，采集Δλ=130和200 nm處的同步熒光光譜。

1.6 熒光光譜儀參數(shù)設(shè)置

熒光光譜儀參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍為240～450 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，PMT電壓為700 V。

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液以及雞肉提取液的同步熒光光譜

DFM和OFL具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有類似的熒光特性。為了實(shí)現(xiàn)辨別的目的，須要找到合適的Δλ。圖1給出了DFM和OFL標(biāo)準(zhǔn)溶液的同步熒光光譜圖，從中看出，DFM和OFL熒光光譜有明顯區(qū)別，在Δλ=130 nm時(shí)，可由282 nm處寬譜峰辨別出DFM。在Δλ=200 nm時(shí)，可由318 nm處寬譜峰辨別出OFL。圖2給出了雞肉提取液的同步熒光光譜圖。從中看出，雞肉中DFM和OFL的熒光激發(fā)峰相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中DFM和OFL的熒光激發(fā)峰發(fā)生紅移現(xiàn)象。含DFM和OFL的雞肉提取液在Δλ=130 nm處有位于288 nm處DFM的熒光激發(fā)峰，在Δλ=200 nm處有位于325 nm處OFL的熒光激發(fā)峰，而空白雞肉提取液在這些位置處未出現(xiàn)寬譜峰。綜上所述，雞肉中DFM和OFL殘留可通過(guò)Δλ/激發(fā)波長(zhǎng)130/288 nm和200/325 nm實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)。

圖1 DFM和OFL標(biāo)準(zhǔn)溶液的同步熒光光譜圖Fig.1 Synchronous fluorescence spectra of DFM and OFL standard solutions

2.2 同步熒光光譜檢測(cè)條件優(yōu)化

由圖3(a)可知，隨著氫氧化鈉溶液濃度增加，DFM的熒光強(qiáng)度呈先增強(qiáng)，后減弱的趨勢(shì)。對(duì)于OFL而言，熒光強(qiáng)度也呈先增強(qiáng)，后減弱的趨勢(shì)。產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化的原因可能是氫氧化鈉溶液濃度的增加，體系pH會(huì)升高，進(jìn)而影響了DFM和OFL的質(zhì)子離解平衡[15]，影響了它們的熒光強(qiáng)度。在氫氧化鈉溶液濃度為0.1 mol·L-1時(shí)，DFM和OFL的熒光強(qiáng)度最大。因此，0.1 mol·L-1為氫氧化鈉溶液最佳的加入濃度。

圖3 不同條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響(a):氫氧化鈉溶液濃度；(b):表面活性劑Fig.3 Effects of difference conditions on the fluorescence intensities(a):Concentration of sodium hydroxide solution;(b):Surfactants

表面活性劑具有熒光增敏的效果，被廣泛應(yīng)用于熒光檢測(cè)。表面活性劑達(dá)到臨界膠束濃度時(shí)能形成膠束，使DFM和OFL分子處于有序的微環(huán)境，減少了分子間的碰撞概率[16]。在本試驗(yàn)中SDS在體系中濃度為10.0 mmol·L-1，大于其臨界膠束濃度8.0 mmol·L-1[17]。由圖3(b)可知，在加入SDS表面活性劑時(shí)，DFM絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度最大。另一方面，在加入SDS表面活性劑時(shí)，OFL絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度最大。因此，選用SDS表面活性劑。

2.3 主成分分析

PCA是一種經(jīng)典的多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，其中心目的是將光譜的數(shù)據(jù)降維。表1給出了前4個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率。從中可見，DFM和OFL前3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率均達(dá)到了90%。隨著主成分?jǐn)?shù)增大，其方差貢獻(xiàn)率逐漸減小。通常主成分?jǐn)?shù)大于90%的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率就能代表原始變量的大部分信息[18]。因此，選擇前3個(gè)主成分進(jìn)行PLSR和MLR分析。

表1 前4個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Table 1 Variance contribution rate and cumulative variance contribution rate for the first four principal component

2.4 預(yù)測(cè)模型的建立和預(yù)測(cè)結(jié)果的分析

含DFM和OFL的雞肉提取液樣本共13個(gè)，隨機(jī)選取7個(gè)樣本作為訓(xùn)練集，以建立預(yù)測(cè)模型，剩余6個(gè)作為預(yù)測(cè)集，以分析模型預(yù)測(cè)結(jié)果，預(yù)測(cè)集的數(shù)據(jù)都落在訓(xùn)練集的范圍之內(nèi)，如表2所示。

表2 雞肉中DFM和OFL殘留的樣本統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistical results of samples of DFM and OFL residues in chicken

表3 雞肉中DFM和OFL殘留的模型預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Statistical results of prediction model of DFM and OFL residues in chicken

綜合上述的信息得出基于PLSR的DFM殘留預(yù)測(cè)模型和基于MLR的OFL殘留預(yù)測(cè)模型的綜合評(píng)價(jià)更好，因此本試驗(yàn)分別用PLSR和MLR算法建立雞肉中DFM和OFL殘留的預(yù)測(cè)模型，檢測(cè)雞肉中DFM和OFL殘留的檢出限均可達(dá)1.0 mg·kg-1，并繪制了雞肉中DFM和OFL殘留的樣本關(guān)系圖(見圖4)。本方法能夠滿足雞肉中DFM和OFL殘留快速同時(shí)檢測(cè)要求，對(duì)后續(xù)研究具有一定的參考價(jià)值。

圖4 雞肉中DFM和OFL殘留的樣本關(guān)系圖Fig.4 Plots of the relationship between the actual and predicted values of DFM and OFL residues in chicken for the training and prediction samples

3 結(jié) 論

采用同步熒光技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，建立了雞肉中DFM和OFL殘留快速檢測(cè)的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用同步熒光技術(shù)可有效的分辨出雞肉提取液、DFM和OFL的熒光特征峰，使雞肉中DFM和OFL殘留被同時(shí)檢測(cè)，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟，為雞肉中抗生素殘留的快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。