鯉仔魚(yú)耳石上鍶標(biāo)記的持久性評(píng)價(jià)

邱 晨 ，姜 濤，陳修報(bào) ，劉洪波 ，楊 健 ，

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心院長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)與資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081）

人工增殖放流是一項(xiàng)以養(yǎng)護(hù)水生生物資源、修復(fù)水域生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)漁民增收、振興漁業(yè)經(jīng)濟(jì)為目標(biāo)的國(guó)策。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部所制定的《2019 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村綠色發(fā)展工作要點(diǎn)》也將該工作列為“著力強(qiáng)化漁業(yè)資源養(yǎng)護(hù)修復(fù)”的重要內(nèi)容。為有效掌握資源魚(yú)類(lèi)的增殖放流效果，開(kāi)發(fā)及優(yōu)化放流標(biāo)記和跟蹤評(píng)估技術(shù)具有十分重要的意義，但同時(shí)也是開(kāi)展經(jīng)濟(jì)、珍稀水生生物物種增殖放流及其效果評(píng)價(jià)工作中的難點(diǎn)課題。

值得注意的是，由于鍶（Sr）的代謝與鈣（Ca）相似，容易被硬骨組織吸收和保留，且早期生活史階段的魚(yú)體對(duì) Sr 的吸收和積累效應(yīng)更明顯［1］；因此，Sr 元素被認(rèn)為可用于仔稚魚(yú)等個(gè)體耳石化學(xué)標(biāo)記的安全有效的標(biāo)記工具［2］，與傳統(tǒng)標(biāo)記技術(shù)相比，Sr 標(biāo)記因其具有操作簡(jiǎn)單、成本低、對(duì)魚(yú)干擾少等優(yōu)點(diǎn)［3］而備受關(guān)注，也已成為研究熱點(diǎn)之一。迄今，多種魚(yú)類(lèi)的耳石 Sr標(biāo)記已取得了成功［4-11］。

如果創(chuàng)建的標(biāo)記可以在標(biāo)志魚(yú)的整個(gè)生命周期中存在，那該標(biāo)志技術(shù)的價(jià)值就能顯著增加［12］。若耳石上所形成的Sr 標(biāo)記可以永久保存的話(huà)，無(wú)疑將具有客觀(guān)地區(qū)別于非標(biāo)記魚(yú)，且評(píng)價(jià)增殖放流生態(tài)效果價(jià)值。由于耳石具有代謝惰性，元素一旦被沉積到耳石上，就可能存在于魚(yú)類(lèi)的整個(gè)生活史，不會(huì)被代謝或消失，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)有針對(duì)外源Sr 標(biāo)記在耳石可存留最長(zhǎng)時(shí)間的研究報(bào)道。為此，本研究以鯉（Cyprinus carpio）仔魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，在已證明Sr可以作為其安全有效標(biāo)記物的基礎(chǔ)上［13，14］，對(duì)其進(jìn)行有針對(duì)性的高Sr 標(biāo)記試驗(yàn)，再經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的恢復(fù)續(xù)養(yǎng)，探究Sr 標(biāo)記在其3 對(duì)耳石（即矢耳石、微耳石和星耳石）上的標(biāo)記效果及保持情況，并比較篩選出最適合作為長(zhǎng)期Sr 標(biāo)記研究的耳石類(lèi)型，以期能為破解和評(píng)價(jià)鯉科魚(yú)類(lèi)耳石Sr 標(biāo)記的持久性，更好地發(fā)展及優(yōu)化相關(guān)耳石Sr 標(biāo)記技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚(yú)于2017 年4 月26 日采自江蘇省無(wú)錫市中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南區(qū)實(shí)驗(yàn)基地人工繁殖的健康鯉仔魚(yú)（14 日齡）［15］。試驗(yàn)標(biāo)記溶液為10 mg/L 六水氯化鍶（換算成Sr2+的濃度為3.3 mg/L）（SrCl2·6H2O，分析純，上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）溶液。

1.2 浸泡標(biāo)記與檢測(cè)

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本采集方案 標(biāo)記前，試驗(yàn)魚(yú)在100 cm×45 cm×50 cm 玻璃缸內(nèi)空腹暫養(yǎng)1 d，以減少標(biāo)記期間代謝消耗。2017 年 4 月 29 日 17：30，隨機(jī)挑選300 尾試驗(yàn)魚(yú)（全長(zhǎng)為8～10 mm）放入標(biāo)記溶液中空腹標(biāo)記2 d，標(biāo)記期間不斷向水體充氧。2017年 5 月 1 日 17：30，將試驗(yàn)魚(yú)分別置于盛有 100 L 曝氣自來(lái)水的玻璃缸（規(guī)格同上）中續(xù)養(yǎng)恢復(fù)，期間進(jìn)行正常投喂，每日清理排泄物及換水1 次，換水量占養(yǎng)殖水體的1/4。整個(gè)試驗(yàn)不控溫度和光周期。

為開(kāi)展鯉仔魚(yú)耳石上鍶標(biāo)記的持久性探索，從上述試驗(yàn)魚(yú)中選養(yǎng)1 尾，一直恢復(fù)續(xù)養(yǎng)至2018 年12月29 日（607 d，即20 個(gè)月），且于當(dāng)天17：30 時(shí)進(jìn)行了該魚(yú)的活體取樣，并解剖摘取其3 對(duì)耳石。

1.2.2 耳石的摘取與檢測(cè) 在解剖鏡下取出鯉魚(yú)3對(duì)耳石，即矢耳石、星耳石和微耳石（圖1），用去離子水去除耳石表面有機(jī)雜質(zhì)，自然晾干。用環(huán)氧樹(shù)脂（Epofix，Struers 公司）進(jìn)行包埋，用碾磨機(jī)（Disco?plan-TS 型，Struers 公司）初、精磨至核心標(biāo)記，再將其用磨拋機(jī)（LaboPol-35，Struers公司）將其拋光至核心完全標(biāo)記在表面且耳石表面無(wú)明顯劃痕。測(cè)定前，耳石樣本用去離子水超聲清洗，完全干燥后，用真空鍍膜機(jī)（JEE-420，日本電子株式會(huì)社）鍍膜（36 A，25 s）。利用X 射線(xiàn)電子探針微區(qū)分析儀（EPMA，簡(jiǎn)稱(chēng)電子探針，JXA-8100 型，日本電子株式會(huì)社，下同），分別對(duì)3 對(duì)耳石（矢耳石和微耳石為過(guò)核心的矢狀面，星耳石為過(guò)核心的橫截面）進(jìn)行定量線(xiàn)和面分布分析［16，17］。

圖1 六水氯化鍶溶液中浸泡標(biāo)記2 d 后再恢復(fù)續(xù)養(yǎng)607 d 時(shí)鯉仔魚(yú)及其3 對(duì)耳石（微耳石、矢耳石和星耳石）形態(tài)

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007 進(jìn)行匯總及作圖。定量線(xiàn)分布數(shù)據(jù)用Sr 含量和Ca 含量的比值來(lái)表示，耳石上不同區(qū)域Sr/Ca 比值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，由于耳石中Sr 含量遠(yuǎn)小于Ca 含量，按慣例將Sr/Ca 標(biāo)準(zhǔn)化，即統(tǒng)一用（Sr/Ca）×103來(lái)表示，簡(jiǎn)稱(chēng)Sr/Ca 比值。

2 結(jié)果與分析

電子探針微區(qū)分析所獲面分布結(jié)果顯示，經(jīng)10 mg/L SrCl2·6H2O 標(biāo)記，再經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá) 20 個(gè)月的恢復(fù)續(xù)養(yǎng)后，鯉仔魚(yú)3 對(duì)耳石上呈現(xiàn)出不同的標(biāo)記特征。微耳石和矢耳石上仍可觀(guān)察到紅色高Sr 含量標(biāo)記區(qū)（圖2）。定量線(xiàn)分布結(jié)果也證實(shí)，星耳石、微耳石和矢耳石上均出現(xiàn)了明顯的一個(gè)Sr/Ca 比值標(biāo)記峰，峰值分別9.62、9.53、7.84（圖3）。

圖2 恢復(fù)續(xù)養(yǎng)607 d 時(shí)鯉仔魚(yú)3 對(duì)耳石（微耳石、矢耳石和星耳石）上的鍶標(biāo)記圖譜

圖3 恢復(fù)續(xù)養(yǎng)607 d 時(shí)鯉魚(yú)3 對(duì)耳石（微耳石、矢耳石和星耳石）從核心（0 μm）到邊緣定量線(xiàn)分析所獲Sr/Ca 比值圖譜

3 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)標(biāo)志法，如掛牌法、剪鰭法、染色法等［18］，雖在國(guó)際上應(yīng)用廣泛，但都存在標(biāo)記易丟（消）失或保存率較低的“瓶頸”［19］，而確保標(biāo)志或標(biāo)記的持久性是衡量一項(xiàng)放流標(biāo)志技術(shù)價(jià)值的重要指標(biāo)［12，20］。由于耳石Sr 標(biāo)記的可檢測(cè)性和持久性，使其具有可獲取耳石上精確的標(biāo)記及其持續(xù)保持時(shí)間參數(shù)的潛力。

魚(yú)類(lèi)耳石Sr 標(biāo)記技術(shù)的研究是基于耳石代謝惰性這一特性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。王臣等［7］對(duì)大麻哈魚(yú)（On?corhynchus keta）發(fā)眼卵后期胚胎進(jìn)行不同濃度Sr 浸染試驗(yàn)中，經(jīng)100 d 恢復(fù)續(xù)養(yǎng)后，矢耳石上Sr 峰值仍清晰可測(cè)，說(shuō)明Sr 標(biāo)記在矢耳石至少能存在100 d。Steven 等［21］利用 5 000 mg/L SrCl2標(biāo)記紅大麻哈魚(yú)（Oncorhynchus nerka）魚(yú)苗，恢復(fù)續(xù)養(yǎng) 21 個(gè)月時(shí)，其矢耳石上的高Sr 部位能明顯被檢測(cè)到。Morales-Nin 等［22］經(jīng) Sr 肌肉注射標(biāo)記的鱸形目尾斑重牙鯛（Diplodus annularis）和紋首鮨（Serranus scriba）個(gè)體在續(xù)養(yǎng)277～366 d（近12 個(gè)月）后，耳石上均可檢測(cè)出Sr 標(biāo)記信號(hào)。同樣，本研究證實(shí)了在鯉仔魚(yú)階段利用 Sr 溶液 2 d 標(biāo)記后，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá) 607 d（20 個(gè)月）的續(xù)養(yǎng)，3 對(duì)耳石上紅色高Sr 含量標(biāo)記環(huán)均清晰存在；Sr/Ca 比值標(biāo)記峰值也非常明顯。這說(shuō)明Sr 均可有效標(biāo)記鯉星耳石、微耳石、矢耳石三類(lèi)耳石達(dá)640 d以上，具顯著的持久性。從Sr 標(biāo)記圖譜區(qū)域范圍、含量水平和Sr/Ca 比標(biāo)記峰值綜合來(lái)看，星耳石能更為清晰地反映Sr標(biāo)記持久性的效果。

本研究證實(shí)即使經(jīng)過(guò)607 d 的長(zhǎng)期續(xù)養(yǎng)恢復(fù)后，其星耳石、微耳石、矢耳石上沉積形成的高Sr含量及高Sr/Ca 比值峰值“標(biāo)記”區(qū)域仍可清晰留存。這種現(xiàn)象的存在顯示出耳石Sr標(biāo)記應(yīng)該具有明顯的持久性，也進(jìn)一步印證了耳石Sr 標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。在此基礎(chǔ)上，需要增加相關(guān)工作的耳石樣本量及加長(zhǎng)標(biāo)記魚(yú)的恢復(fù)續(xù)養(yǎng)時(shí)間，來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)上述標(biāo)記持久性的普適性，以便為魚(yú)類(lèi)增殖放流服務(wù)和相關(guān)基準(zhǔn)/標(biāo)準(zhǔn)的研發(fā)提供更系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。