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    LncRNA ZEB1‐AS1對(duì)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤增殖和凋亡的影響及其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析

    2021-05-11 06:33:26廖成成鄧木英莫國(guó)君雷丹青夏愛(ài)軍榮超譚曉虹岑洪盧盛娟
    中國(guó)癌癥防治雜志 2021年2期
    關(guān)鍵詞:淋巴瘤試劑盒調(diào)控

    廖成成 鄧木英 莫國(guó)君 雷丹青 夏愛(ài)軍 榮超 譚曉虹 岑洪 盧盛娟

    B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B?cell non?Hodgkin's lymphoma,B?NHL)是一種淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤,其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B?cell lymphoma,DLBCL)是最常見(jiàn)的類(lèi)型,占非霍奇金淋巴瘤的30%~58%[1]?;熀兔庖呋熓荁?NHL常用的治療手段,但部分患者一線治療后耐藥或復(fù)發(fā)難治,療效并不理想[2?3]。目前在臨床實(shí)踐中,淋巴瘤一線方案均以蒽環(huán)類(lèi)藥物為主,如多柔比星(doxorubicin,Dox)。因此,探討Dox耐藥機(jī)制,尋找B?NHL診斷和治療新型生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)尤為重要。

    淋巴瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)錄異常有關(guān),除mRNA水平異常外,還包括基因組中ncRNAs調(diào)控能力異常(lncRNAs、miRNAs等)[4]。近年來(lái)SALMENA等提出細(xì)胞內(nèi)有一類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(competing endoge?nous RNA,ceRNA)假說(shuō)[5],認(rèn)為 lncRNAs可通過(guò)miRNA反應(yīng)原件(miRNA response elements,MREs)吸附miRNA,抑制miRNA作用,間接調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá),從而調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)程??梢?jiàn)miRNA在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用[6?7]。本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)集預(yù)測(cè)與DLBCL預(yù)后相關(guān)的lncRNAs,探討lncRNA ZEB1?AS1及其與Dox協(xié)同對(duì)B?NHL細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并構(gòu)建lncRNA?miRNA?mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),預(yù)測(cè)下游核心基因,為B?NHL診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及分析

    數(shù)據(jù)集1來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)集(GSE31312)中DLBCL表達(dá)譜數(shù)據(jù)及患者樣本信息(498例)。納入標(biāo)準(zhǔn):⑴病理確診為DLBCL;⑵可獲得患者的總體生存時(shí)間;⑶可獲得標(biāo)準(zhǔn)化lncRNA及mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)。表達(dá)譜數(shù)據(jù)用R語(yǔ)言limma包進(jìn)行差異基因的篩選;構(gòu)建Cox回歸模型,按照HR>1.5,調(diào)整后的P值<0.05,挑選出前20個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)lncRNA。數(shù)據(jù)集2為從UCSC XENA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://xenabrowser.net/datapages/)[8]中選取444例正常組織與47例DLBCL組織的表達(dá)數(shù)據(jù)集,比較HR較高的前8個(gè)基因在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)量。通過(guò)文獻(xiàn)查閱,篩選出在數(shù)據(jù)集1中HR較高同時(shí)在數(shù)據(jù)集2腫瘤組織中顯著高表達(dá),且未被文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的lncRNAs,并采用qPCR驗(yàn)證其在正常組織(外周血單個(gè)核細(xì)胞)和B?NHL細(xì)胞系中的表達(dá)量,最終確定lncRNA ZEB1?AS1為本研究的目的lncRNA。

    根據(jù)ZEB1?AS1表達(dá)的中位數(shù)將數(shù)據(jù)集1中的患者分為高、低表達(dá)組,運(yùn)用limma數(shù)據(jù)包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行mRNA的共表達(dá)分析,若表達(dá)趨勢(shì)一致則定義為共表達(dá)基因。同時(shí)利用DIANA tools查詢經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的編碼和非編碼RNA上的miRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(TarBase v7.0和LncBase)。通過(guò)DIANA?miRPath(http://diana.imis.athena?innovation.gr/)算法預(yù)測(cè)與lncRNA ZEB1?AS1相結(jié)合的miRNA及其結(jié)合位點(diǎn),并運(yùn)用Targetscan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。將與lncRNA ZEB1?AS1共表達(dá)的mRNA與Targetscan預(yù)測(cè)的靶基因取交集得到ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游基因,再將lncRNA?miRNA?mRNA調(diào)控軸導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0并進(jìn)行可視化輸出,接著采用R語(yǔ)言的clusterProfiler包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析,最后利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string?db.org/)對(duì)差異基因的編碼蛋白進(jìn)行分析并構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)。

    1.2 細(xì)胞系及主要試劑

    B?NHL細(xì)胞系Raji、Ramos、Farage和293T購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)為健康供者外周血經(jīng)梯度離心獲得;Gibco胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Life公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;慢病毒載體SV40及目的質(zhì)粒sh?NC、sh?ZEB1?AS1購(gòu)自VectorBuilder Inc,美國(guó)芝加哥;慢病毒包裝質(zhì)粒PMD2.G、PSPAX2購(gòu)自Addgene公司;Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司,Polybrene購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,Dox購(gòu)自深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司;CCK?8試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;Annexin V?FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司;TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR RT?qPCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

    1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

    將Raji和Ramos細(xì)胞接種至含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,293T細(xì)胞接種至含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基,并置于37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作,使用Lipofectamine 3000在293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒生產(chǎn)病毒后,予Polybrene輔助感染Raji或Ramos細(xì)胞,構(gòu)建 ZEB1?AS1敲降細(xì)胞。采用RT?qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況,嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,然后以不同濃度(50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)Dox處理 Raji和Ramos細(xì)胞,設(shè)未經(jīng)處理的相應(yīng)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分為4組:⑴慢病毒對(duì)照組:sh?NC+DMSO;⑵ZEB1?AS1敲低組:sh?ZEB1?AS1+DMSO;⑶Dox組:sh?NC+Dox;⑷ZEB1?AS1敲低+Dox組:sh?ZEB1?AS1+Dox。

    1.4 RT?qPCR法檢測(cè)B?NHL細(xì)胞中ZEB1?AS1 mRNA的表達(dá)情況

    采用Trizol提取法提取各組細(xì)胞的總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),分別取各組細(xì)胞總RNA 1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再按照定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū),以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件:95℃、15s;60℃、1min,40個(gè)循環(huán)。引物序列:ZEB1?AS1的上游引物為 5'?GTGGGCACTGCTGAATTTGA?3',下游引物為5'?GCGGAACTTCTAGCCTCTCT?3';GAPDH的上游引物為5'?GCACCGTCAAGGCTGAGAAC?3',下游引物為5'?TGGTGAAGACGCCAGTGGA?3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH作為內(nèi)參,使用2?△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量的數(shù)據(jù)分析。

    1.5 CCK?8法檢測(cè)B?NHL細(xì)胞的增殖活力

    取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且經(jīng)不同濃度Dox處理后的Raji和Ramos細(xì)胞接種到96孔板(4×103/孔)中培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后,向各孔分別加入20 μL CCK?8溶液,恒溫孵育2 h,于酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖活力(%)=[(實(shí)驗(yàn)組A值?對(duì)照組A值)/(空白組A值?對(duì)照組A值)]×100%。

    1.6 Annexin V?FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B?NHL細(xì)胞的凋亡

    取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且經(jīng)Dox(0 ng/mL和100 ng/mL)處理后的Raji和Ramos細(xì)胞接種到24孔板(1×105/孔)中,置于5% CO2、37℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5 mL離心管,并洗滌2次,取500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞。按照 Annexin V?FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒的操作步驟,每管依次加入5 μL Annexin V?FITC和5 μL PI,充分混勻,室溫避光孵育15 min,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用R語(yǔ)言(version 3.6.0)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)均為:截?cái)嘀祃ogFC>1.5,Bonferroni法調(diào)整后的P值<0.05[9],并對(duì)差異基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則需進(jìn)行多重比較。多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較的多重比較采用Dunnett,兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用R軟件的survival軟件包應(yīng)用Kaplan?Meier法計(jì)算總生存率并繪制生存曲線,組間差異比較采用log?rank檢驗(yàn)法。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 目標(biāo)lncRNAs的篩選

    通過(guò)GEO數(shù)據(jù)集(GSE31312)篩選前20個(gè)可預(yù)測(cè) DLBCL 不良預(yù)后的高風(fēng)險(xiǎn) lncRNAs(HR:4.46~15.56),見(jiàn)圖1A。采用UCSC XENA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后的正常組織與DLBCL組織的lncRNAs表達(dá)量進(jìn)行比較,8個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)lncRNAs中,除SPATA13(P≥0.05)外,ZFAS1、NNT?AS1、LINC01578、RPARP?AS1、ZEB1?AS1、EBLN3P、OTUD6B?AS1等在DLBCL組織中的表達(dá)均高于正常組織(均P<0.01),見(jiàn)圖1B。RT?qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,ZEB1?AS1在淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Ramos、Farage的表達(dá)倍數(shù)分別是PBMC的(4.67±0.21)倍、(3.13±0.15)倍、(5.33±0.25)倍(均P<0.05),見(jiàn)圖1C。GSE31312數(shù)據(jù)集分析顯示,ZEB1?AS1高表達(dá)組DLBCL患者(249例)中位生存時(shí)間低于低表達(dá)組(249例)(45個(gè)月vs57個(gè)月,P<0.001),見(jiàn)圖1D。選擇ZEB1?AS1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖1 目標(biāo)lncRNAs的篩選Fig.1 Screening of target lncRNAs

    2.2慢病毒感染B?NHL細(xì)胞后ZEB1?AS1的表達(dá)情況

    RT?qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,與 sh?NC 組相比,sh?ZEB1?AS1#1組和sh?ZEB1?AS1#2組細(xì)胞中 ZEB1?AS1表達(dá)量均降低(均P<0.05),其中 sh?ZEB1?AS1#1敲降效果最好,見(jiàn)圖2。表明成功構(gòu)建ZEB1?AS1敲低的 B?NHL細(xì)胞,用sh?ZEB1?AS1#1組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖2 RT‐qPCR檢測(cè)慢病毒感染B‐NHL細(xì)胞后ZEB1‐AS1的表達(dá)情況Fig.2 The expression of sh‐ZEB1‐AS1 in B‐NHL cells after lentivi‐rus infection detected by RT‐qPCR

    2.3 ZEB1?AS1敲低及聯(lián)合Dox對(duì)B?NHL細(xì)胞增殖活力的影響

    CCK?8檢測(cè)結(jié)果顯示,敲低ZEB1?AS1后,Raji和Ramos 細(xì) 胞增殖活力均較相應(yīng)對(duì)照組降低(P< 0.05);與不同濃度(50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL)Dox聯(lián)合處理后,細(xì)胞增殖活力明顯受抑制(均P<0.05),且細(xì)胞殺傷作用呈濃度依賴性,其中100 ng/mL和50 ng/mL濃度Dox作用下細(xì)胞活性抑制作用最大,協(xié)同分?jǐn)?shù)分別為15.008和13.249,見(jiàn)圖3。

    圖3 ZEB1‐AS1敲低及聯(lián)合不同濃度多柔比星對(duì)Raji和Ramos細(xì)胞活力的影響Fig.3 The effect of ZEB1‐AS1 knockdown and combined with different concentrations of doxorubicin on the viability of Raji and Ramos cells

    2.4 ZEB1?AS1敲低及聯(lián)合Dox對(duì)B?NHL細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與sh?NC+DMSO組相比,sh?ZEB1?AS1+DMSO組、sh?NC+Dox組、sh?ZEB1?AS1+Dox組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(均P<0.05),且sh?ZEB1?AS1+Dox 組細(xì)胞凋亡率明顯高于sh?NC+Dox組(P<0.05),見(jiàn)圖4。

    圖4 ZEB1‐AS1敲低及聯(lián)合多柔比星對(duì)Raji和Ramos細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 TheeffectofZEB1‐AS1knockdownandcombineddoxorubicin on the apoptosis of Raji and Ramos cells

    2.5 LncRNA?miRNA?mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的篩選與構(gòu)建

    通過(guò)DIANA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出4個(gè)與lncRNA高度結(jié)合的miRNA,即miR?33?5p、miR?222?3p、miR?499a?5p、miR?4742?3p,結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖5A。利用R語(yǔ)言對(duì)芯片表達(dá)量進(jìn)行預(yù)處理,并按照l(shuí)ncRNA ZEB1?AS1表達(dá)量的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組后進(jìn)行mRNA共表達(dá)分析,結(jié)果共篩選出1 208個(gè)上調(diào)mRNA(與lncRNA ZEB1?AS1呈現(xiàn)共表達(dá)關(guān)系),以前50個(gè)差異基因繪制的熱圖見(jiàn)圖5B。通過(guò)R語(yǔ)言limma包和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù),預(yù)測(cè)既與ZEB1?AS1呈共表達(dá)關(guān)系又與miRNA結(jié)合的差異表達(dá)mRNA,結(jié)果顯示可能存在261個(gè)靶基因受以上4個(gè)miRNAs調(diào)控,其中miR?33?5p、miR?221?3p、miR?499a?5p 和 miR?4742?3p 的靶基因分別有38個(gè)、27個(gè)、16個(gè)、180個(gè)。結(jié)合以上lncRNA?miRNA?mRNA的調(diào)控機(jī)制,最終建立ZEB1?AS1在DLBCL中的lncRNA?miRNA?mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),包括284個(gè)節(jié)點(diǎn)和291條邊。其中,284個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1個(gè)ZEB1?AS1、4個(gè)miRNAs和232個(gè)mRNAs,291條邊表示它們之間存在291種相互作用關(guān)系,見(jiàn)圖5C;ZEB1?AS1位于該網(wǎng)絡(luò)中心,調(diào)節(jié)與之結(jié)合的miR?33?5p、miR?221?3p和miR?499a?5p、miR?4742?3p,進(jìn)而調(diào)控下游232個(gè)靶基因。

    圖5 LncRNA‐miRNA‐mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的篩選與構(gòu)建Fig.5 Screening and construction of lncRNA‐miRNA‐mRNA regu‐latory network

    2.6 下游基因功能及信號(hào)通路分析

    GO分析共發(fā)現(xiàn)18個(gè)細(xì)胞成分、20個(gè)生物過(guò)程、3個(gè)分子功能相關(guān)富集,主要參與中心體、線粒體基質(zhì)、蛋白酶體蛋白質(zhì)分解代謝、D N A代謝調(diào)控、蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白分解代謝、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性等功能;KEGG分析發(fā)現(xiàn)6條相關(guān)通路,包括泛素介導(dǎo)的蛋白水解、細(xì)胞周期、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工過(guò)程、丙酸代謝等通路,見(jiàn)圖6。在PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn),R C HY1是擁有最高連接度的核心基因,與多種蛋白質(zhì)存在相互作用。

    圖6 LncRNA靶基因KEGG、GO分析Fig.6 KEGG and GO analysis of lncRNA target genes

    3 討論

    近年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可能是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的生物標(biāo)志物[10],如在直腸癌中發(fā)現(xiàn)lncRNAs有良好的診斷和預(yù)后價(jià)值[11]。更重要的是,lncRNA還能通過(guò)參與調(diào)控腫瘤生物過(guò)程,結(jié)合下游靶基因并且調(diào)節(jié)其功能,進(jìn)而影響增殖、凋亡以及分化等生物過(guò)程,在腫瘤發(fā)生發(fā)展、預(yù)后和治療中發(fā)揮重要的生物調(diào)控作用。例如,在肝癌中發(fā)現(xiàn)lncRNA WT1?AS通過(guò)上調(diào)WT1蛋白含量抑制細(xì)胞凋亡[12]。但是目前大多數(shù)lncRNAs功能尚不明確,其中l(wèi)ncRNA ZEB1?AS1與淋巴瘤也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)集和qPCR驗(yàn)證lncRNA ZEB1?AS1在B?NHL細(xì)胞中高表達(dá),且高表達(dá)預(yù)示不良生存結(jié)局。該基因的轉(zhuǎn)錄本從具有鋅指結(jié)構(gòu)E?box?結(jié)合同源框1(zinc finger E?box binding homeobox 1,ZEB1)的共享雙向啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄,其轉(zhuǎn)錄物可結(jié)合賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2A,并促進(jìn)組蛋白修飾,而該修飾被認(rèn)為可促進(jìn)ZEB1表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)ZEB1?AS1可誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌上皮?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[13];上調(diào)ZEB1?AS1表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移[14]。本研究在體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因敲降聯(lián)合Dox處理進(jìn)一步驗(yàn)證ZEB1?AS1功能。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn),敲低ZEB1?AS1能抑制B?NHL細(xì)胞增殖,且相較單獨(dú)Dox及單獨(dú)敲低ZEB1?AS1,Dox同時(shí)處理ZEB1?AS1敲降細(xì)胞后的增殖抑制效果更明顯,提示敲低ZEB1?AS1能減弱B?NHL細(xì)胞系增殖能力,且可能對(duì)Dox的化療殺傷起協(xié)同作用。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)敲低ZEB1?AS1能促進(jìn)B?NHL細(xì)胞凋亡,敲低ZEB1?AS1可以協(xié)同Dox減少淋巴瘤對(duì)Dox的抵抗和耐受。機(jī)制可能與lncRNA能通過(guò)多種調(diào)節(jié)機(jī)制在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平以及染色體修飾等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用有關(guān)[15]。

    ceRNAs是一種lncRNA調(diào)控模式,在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中具有重要作用,參與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展[16?18]。在ceRNAs網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA以miRNA作為橋梁間接調(diào)控蛋白編碼基因表達(dá)[5]。已有研究報(bào)道lncRNA ZEB1?AS1為節(jié)點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),如靶向miR?365a?3p抑制肝癌細(xì)胞增殖[19];通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 miR?141?3p促進(jìn)肺纖維化[17]。本研究結(jié)果也顯示lncRNA ZEB1?AS1是B?NHL ceRNA網(wǎng)絡(luò)的上游信號(hào)分子,且發(fā)揮類(lèi)似海綿作用,其中miR?33?5p、miR?221?3p、miR?499a?5p和miR?4742?3p可能與下游261個(gè)靶基因形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的miRNA,但是lncRNA ZEB1?AS1與以上4個(gè)miRNA的調(diào)控關(guān)系有待深入研究。

    本研究進(jìn)一步進(jìn)行信號(hào)通路分析及分子功能預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA的靶基因與中心體、線粒體基質(zhì)、蛋白酶體蛋白質(zhì)分解代謝、DNA代謝調(diào)控、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性等通路顯著相關(guān)。將這些在信號(hào)通路中富集的分子導(dǎo)入PPI網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)RCHY1具有最高的連接度且與多種蛋白質(zhì)存在相互作用,為尋找下游調(diào)控靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。

    綜上所述,ZEB1?AS1敲低可抑制B?NHL細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡,ZEB1?AS1敲低協(xié)同Dox作用后的殺傷作用更明顯,lncRNA ZEB1?AS1可能作為DLBCL潛在的生物標(biāo)志物,以ZEB1?AS1為節(jié)點(diǎn)構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),可能是DLBCL重要的調(diào)控機(jī)制和診療靶點(diǎn)。

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