羊乳巴氏殺菌條件的篩選

葉彤，聶聰怡，李林強(qiáng)

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

羊乳被稱為“乳中之王”[1]，優(yōu)質(zhì)蛋白含量豐富，含有顆粒較小的球蛋白，易被人體消化吸收，且羊乳酪蛋白和乳清蛋白的比例接近母乳，較其他乳源對(duì)人體健康更有利[2-4]。乳的熱處理主要包括預(yù)熱、殺菌甚至滅菌等過(guò)程。巴氏殺菌是最常見(jiàn)的熱處理方式，其主要目的是殺滅乳品中大多數(shù)微生物，保證乳品的品質(zhì)和延長(zhǎng)乳品的貨架期[5-6]，改善乳品加工性能[7]。低溫巴氏殺菌對(duì)乳中熱不穩(wěn)定性蛋白的影響較小[8]，而高溫巴氏殺菌則會(huì)導(dǎo)致乳品蛋白的乳化能力和穩(wěn)定性發(fā)生較大的變化[9-10]。因此，低溫的巴氏殺菌是更受人們青睞的熱加工方式。

蛋白質(zhì)的水解是羊乳殺菌過(guò)程中發(fā)生的主要化學(xué)變化之一。在加工生產(chǎn)方面，水解后的乳蛋白往往更有利于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)[11]；在健康方面，蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的小分子肽及氨基酸更容易被人體吸收，且部分小肽還具有調(diào)節(jié)血糖[12]、抗氧化[13]、抗高血壓[14]、抑菌[15]等功能；在安全方面，巴氏殺菌后的乳蛋白相比未處理而言更加安全，如經(jīng)過(guò)65～100 ℃加熱處理后，α-乳白蛋白的抗原性和潛在致敏性顯著降低[16]。目前，對(duì)于乳蛋白的水解有相當(dāng)多的研究，但多集中于酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解。馬瑩等[17]報(bào)道胃蛋白酶水解乳清蛋白最佳酶解工藝溫度為37 ℃，胰蛋白酶水解乳清蛋白最佳酶解溫度為55 ℃，韓仁嬌等[18]報(bào)道在55.2 ℃條件下，β-乳球蛋白酶解產(chǎn)生乳清水解蛋白，其水解率可達(dá)60%。但是酶處理易導(dǎo)致蛋白質(zhì)過(guò)度水解，產(chǎn)生大量苦肽和游離氨基酸，影響羊乳的風(fēng)味。巴氏殺菌是一種常見(jiàn)的殺菌方式，并且廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，但是當(dāng)下不同企業(yè)采用不同的巴氏殺菌條件，主要體現(xiàn)在巴氏殺菌時(shí)間和殺菌溫度的不同，雖然這些條件滿足了商業(yè)殺菌的要求，但是哪一種巴氏殺菌的條件更有利于保護(hù)乳蛋白的特性，尚缺乏系統(tǒng)的研究。

本文較系統(tǒng)地研究巴氏殺菌對(duì)羊乳水解程度、色值變化、表面形貌、蛋白種類的影響，以加深人們關(guān)于巴氏殺菌對(duì)羊乳蛋白質(zhì)性狀影響的認(rèn)識(shí)，有利于深入研究羊乳品質(zhì)的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮羊乳采自陜西省西安市長(zhǎng)安區(qū)關(guān)中奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)，冰盒2～4 ℃運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

牛血清白蛋白，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250、考馬斯亮藍(lán)G-250，N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N,N,N,N-四甲基乙二胺，Sigma公司；鹽酸、過(guò)硫酸銨、溴酚藍(lán)、甘氨酸，上海源葉生物試劑有限公司；甘油、冰醋酸、95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、氯化鈉、磷酸、乙醚(均為國(guó)產(chǎn)分析純)，天劍天利化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

800B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；J探頭原子力顯微鏡，Veeco Bruker公司；SC-80C全自動(dòng)色差儀，北京康光光學(xué)儀器有限公司；PowerPac TM Universal電泳系統(tǒng)、Universal Hood II,XRS凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-rad公司。

理論、計(jì)算與實(shí)際應(yīng)用在現(xiàn)行數(shù)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)與教材中的割裂狀態(tài)應(yīng)當(dāng)改變，兩者必須結(jié)合起來(lái).小學(xué)數(shù)學(xué)中的理論和計(jì)算技能，如果學(xué)生不懂得如何應(yīng)用于實(shí)際問(wèn)題，則無(wú)價(jià)值可言.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊乳中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

乳中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]的方法。稱量0.1 g牛血清白蛋白至100 mL容量瓶中,倒入0.15 mol/L的NaCl溶液至刻度線，混勻配制成1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。依次吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mL)和0.15 mol/L的NaCl溶液(0.09、0.08、0.07、0.05、0.04 mL)于相應(yīng)試管中，再分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑各5.00 mL。采用722型可見(jiàn)分光光度計(jì)在595 nm處測(cè)定其吸光度。以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確移取1 μL羊乳于試管中，再加入99 μL NaCl溶液，其余操作同上。

1.2.2 不同巴氏殺菌羊乳色值的測(cè)定

采用全自動(dòng)色差儀測(cè)定不同巴氏殺菌條件下羊乳的紅值(a*)、黃值(b*)和亮度(L*)，以常溫鮮羊乳為對(duì)照。

1.2.3 羊乳蛋白粒子形貌原子力顯微鏡觀察

取等量常溫和95 ℃，15 s處理的羊乳，經(jīng)400×g離心15 min后，棄去脂肪層，再使用乙醚萃取，脫去剩余殘脂。對(duì)少量脫脂后的羊乳稀釋25倍后，進(jìn)行超聲處理。取樣液鋪展在云母片上,靜置風(fēng)干。制備好的蛋白云母片樣本在Bruker原子力顯微鏡J探頭下進(jìn)行掃描觀察。

1.2.4 巴氏殺菌羊乳蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

參考文獻(xiàn)[20]稍作修改。取2 mg不同溫度處理的羊乳和對(duì)照乳,分別溶解在1 mL樣品緩沖液中。配制濃縮膠的體積分?jǐn)?shù)為5%，配制分離膠的體積分?jǐn)?shù)為13%。將分離膠注入凝膠板至距上部1/4處，再灌入蒸餾水壓平，待凝固后倒掉蒸餾水。然后注入濃縮膠，插入梳子后等待凝固。倒入電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)凝膠板，拔梳子。樣品上樣量為10 μL。將濃縮膠中的電壓控制為80 V恒定，待溴酚藍(lán)條帶跑入分離膠后，電壓改為121 V，恒壓直到蛋白質(zhì)染液跑至距分離膠底部1 cm左右處,關(guān)閉電源停止電泳。將凝膠片放入考馬氏亮藍(lán)染液染色，置于搖床振蕩2 h。再放入脫色液脫色，每2 h換1次，至背景通透、蛋白條帶可清楚辨別。

2 結(jié)果與分析

2.1 考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的吸光值點(diǎn)進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)方程。結(jié)果顯示回歸方程為y=0.908 4x-0.017，其線性范圍為0～0.6 mg/mL，該方程的R2=0.991 9，表明蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度與吸光度關(guān)系良好，該方程可信度高(P<0.01)。

2.2 不同巴氏殺菌羊乳中蛋白質(zhì)含量

采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)65、75、85、95 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。由圖1可知，各巴氏殺菌處理組的羊乳總蛋白質(zhì)含量均顯著高于對(duì)照組(25 ℃未經(jīng)處理的羊乳，下同)(P<0.05)，考馬斯亮藍(lán)法的測(cè)定原理是蛋白質(zhì)和色素的結(jié)合，但肽類物質(zhì)也可以與色素結(jié)合，這可能是處理組蛋白質(zhì)的含量高于對(duì)照組的原因，也進(jìn)一步表明蛋白質(zhì)在75 ℃以上溫度時(shí)發(fā)生了水解；75 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質(zhì)含量顯著高于其他巴氏殺菌組(P<0.05)；85和95 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質(zhì)含量顯著高于65 ℃巴氏殺菌組(P<0.05)；85和95 ℃巴氏殺菌羊乳中的蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖1 羊乳蛋白質(zhì)含量在不同溫度處理30 min后的變化Fig.1 The contents of protein from goat milk treated at different temperatures for 30 min

對(duì)95 ℃加熱15 s、30 min和4 h的巴氏殺菌乳中的蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果如圖2所示，各巴氏殺菌組的羊乳蛋白質(zhì)含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。15 s巴氏殺菌乳中的蛋白質(zhì)含量顯著高于其他巴氏殺菌組(P<0.05)。4 h巴氏殺菌乳中的蛋白質(zhì)含量顯著高于30 min巴氏殺菌組(P<0.05)。

圖2 羊乳蛋白質(zhì)含量在95 ℃不同時(shí)間處理后的變化Fig.2 The contents of protein from goat milk treated at 95 ℃ for different times

結(jié)果表明，隨著在相同時(shí)間的處理?xiàng)l件下溫度的升高，蛋白質(zhì)含量先增大，后降低。這可能是因?yàn)殡S著溫度升高，羊乳蛋白空間構(gòu)象改變，二三級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水區(qū)域發(fā)生變化，蛋白質(zhì)的酶切位點(diǎn)數(shù)量增加，因此巴氏殺菌后的乳蛋白對(duì)蛋白酶更加敏感，而羊乳中蛋白酶、纖溶酶等內(nèi)源水解酶會(huì)降解乳中蛋白質(zhì)，將其分解為小分子短肽和游離氨基酸[21-22]。相對(duì)于75 ℃條件的巴氏殺菌，85、95 ℃的巴氏殺菌溫度較高，可能致使某些特殊蛋白質(zhì)發(fā)生一定凝結(jié)，從而表現(xiàn)為蛋白質(zhì)含量下降。而在65 ℃處理后的羊乳蛋白含量較其他處理組最低，可能是由于耐熱蛋白酶的最佳酶解溫度主要集中于60～80 ℃，少數(shù)例外也在80 ℃以上[23]，因此水解酶的活性未完全激活。在95 ℃不同時(shí)間的處理下，處理15 s后羊乳蛋白質(zhì)含量相對(duì)其他處理組最高，這可能是由于在此條件下蛋白水解程度較大，產(chǎn)生了較多游離氨基酸和小肽導(dǎo)致的。

2.3 不同巴氏殺菌對(duì)羊乳色澤的影響

采用全自動(dòng)色差儀對(duì)65、75、85和95 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質(zhì)色值進(jìn)行測(cè)定。由表1可知，65、75、85、95 ℃處理的羊乳b*顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，4組處理組之間也均具有顯著性差異(P<0.05)。隨著溫度的增加，羊乳的b*值呈逐漸增大的趨勢(shì)，在75 ℃時(shí)，羊乳的b*值相對(duì)于其他處理組最低。這說(shuō)明褐變現(xiàn)象最明顯的為95 ℃處理組，接下來(lái)依次為85、65、75 ℃處理組。而各巴氏殺菌的L*，a*，c*，H則無(wú)顯著規(guī)律變化(P>0.05)。綜上結(jié)果表明，在不同溫度處理30 min，羊乳b*值的大小與處理溫度的高低呈一定程度的正相關(guān)。

表1 不同巴氏殺菌對(duì)羊乳色澤的影響Table 1 Effects of different heat treatments on goat milk color values

色值變化體現(xiàn)了美拉德反應(yīng)的程度。本文研究結(jié)果表明75 ℃以上，隨著溫度的增加，羊乳的b*值呈逐漸增大的趨勢(shì)。這可能是由于在高溫條件下，乳糖降解產(chǎn)生還原性單糖，其羰基與乳蛋白的氨基相互作用發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成中間產(chǎn)物羥甲基糠醛，進(jìn)一步積累形成類黑色素，且隨著加熱時(shí)間和加熱溫度的增加，褐變程度增大[24]。這與孫靜麗[25]、李思寧等[26]研究結(jié)果相一致。因此，黃值也可作為巴氏殺菌對(duì)羊乳品質(zhì)影響的重要指標(biāo)之一。

2.4 羊乳蛋白粒子形貌原子力顯微鏡觀察

采用原子力顯微鏡對(duì)巴氏殺菌(95 ℃，15 s)處理乳進(jìn)行蛋白質(zhì)粒子形貌觀察。如圖3、表2、表3所示，95 ℃，15 s 巴氏殺菌處理組蛋白的顆粒數(shù)目(77)顯著低于對(duì)照組(437)(P<0.05)，蛋白的顆粒密度(3.08個(gè)/μm2)顯著低于對(duì)照組(17.48個(gè)/μm2)(P<0.05)，蛋白的顆粒直徑(93.91 nm)大于對(duì)照組(80.41 nm)，蛋白的片狀凝聚程度(8 221.42 nm2)顯著高于對(duì)照組(5 636.28 nm2)(P<0.05)，而且蛋白質(zhì)顆粒表面的起伏程度(5.92～23.79 nm)大于對(duì)照組(2.54～16.92 nm)。

a-常溫(25 ℃)；b-巴氏殺菌(95 ℃，15 s)圖3 常溫(25 ℃)和巴氏殺菌(95 ℃,15 s)處理后羊乳 蛋白質(zhì)粒子的表面形貌Fig.3 Surface morphology of protein particles from goat milk treated at room temperatire(25 ℃) and 95 ℃ for 15 s

結(jié)果表明，巴氏殺菌后羊乳蛋白質(zhì)粒度大于常溫(25 ℃)對(duì)照組羊乳。這可能是由于加熱導(dǎo)致羊乳蛋白的結(jié)構(gòu)改變。巴氏殺菌后的羊乳表面有較大的凝聚顆粒，可能是因?yàn)楦邷貙?dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鏈運(yùn)動(dòng)加劇，β-乳球蛋白與K-酪蛋白、α-乳白蛋白等的空間結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間形成二硫鍵[27]，結(jié)合成直徑更大的蛋白顆粒，由于這種結(jié)合方式下蛋白質(zhì)空間排布不緊密，可能形成了疏松多孔結(jié)構(gòu)，所以更多的小顆粒蛋白附著在羊乳酪蛋白表面，蛋白質(zhì)粒子也會(huì)逐漸增大。另一方面，大分子蛋白質(zhì)粒子數(shù)目在巴氏殺菌后大幅下降，這可能是由于在巴氏殺菌處理中，除部分含巰基蛋白質(zhì)聚集外，還有部分其他的蛋白質(zhì)在該溫度下發(fā)生大量水解，形成小分子氨基酸，使得大分子蛋白質(zhì)粒子數(shù)目明顯降低。與李子超等[28]、楊楠[29]、CORREDIG等[30]和KAZMIERSKI等[31]研究結(jié)果類似，并且這種結(jié)果與上文熱處理對(duì)羊乳蛋白水解程度的影響分析結(jié)果一致。

表2 常溫(25 ℃)對(duì)照組羊乳蛋白質(zhì)粒度

表3 巴氏殺菌(95 ℃，15 s)羊乳蛋白質(zhì)粒度Table 3 Particle sizes of goat milk protein pasteurized at 95 ℃ for 15 s

2.5 巴氏殺菌羊乳蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE對(duì)65、75、85和95 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析。如圖4所示，各巴氏殺菌樣品均含有2條類似的蛋白條帶，但65、75 ℃巴氏殺菌組的A蛋白條帶灰度與對(duì)照組相近；85、95 ℃巴氏殺菌組的A蛋白條帶灰度明顯低于其他處理組，并且蛋白質(zhì)條帶數(shù)目較75 ℃的巴氏殺菌處理組明顯減少。另外，65和75 ℃巴氏殺菌組的A蛋白條帶灰度無(wú)明顯差異；85和95 ℃巴氏殺菌組的A蛋白條帶灰度無(wú)明顯差異。

圖4 巴氏殺菌羊乳蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of goat milk protein after pasteurization注：圖中條帶1, 2, 3, 4, 5分別代表對(duì)照、65、75、85、 95 ℃羊乳熱處理30 min

85、95 ℃巴氏殺菌的羊乳SDS-PAGE電泳灰度明顯變淺，表明隨著溫度的增高，羊乳蛋白水解程度增加。電泳條帶的灰度值與蛋白質(zhì)分子的凝聚和交聯(lián)作用有關(guān)，形成這種現(xiàn)象的原因可能是高溫促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水解，使蛋白質(zhì)分解成更小分子肽和游離氨基酸，從而使條帶變淺。65和75 ℃處理的羊乳與對(duì)照組灰度無(wú)明顯差異，表明該溫度處理基本不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的明顯水解，并且較85、95 ℃處理而言，65和75 ℃處理的羊乳蛋白質(zhì)電泳條帶數(shù)目與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，也進(jìn)一步證明上述結(jié)果。在75 ℃蛋白質(zhì)條帶灰度的變化較小，因此在一定程度上這種溫度的處理可能更有利于保存蛋白質(zhì)活性。

3 結(jié)論

巴氏殺菌是影響乳品加工品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。本文研究表明巴氏殺菌會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量、色值、表觀形貌的變化。巴氏殺菌的溫度和時(shí)間均對(duì)羊乳蛋白質(zhì)的水解存在著顯著影響(P<0.05)。溫度增加容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性程度增加，表現(xiàn)為水解程度增大、羊乳褐變程度加深，進(jìn)一步表現(xiàn)為75 ℃蛋白條帶無(wú)明顯變化，85、95 ℃蛋白質(zhì)條帶減少、灰度變淺，并且95 ℃，15 s巴氏殺菌后的羊乳蛋白質(zhì)數(shù)目減少、粒度增大。綜上所述，75 ℃，30 min的巴氏殺菌方法最適于羊乳的加工與生產(chǎn)，為羊乳的熱加工提供了參考。