貴州代表性茶樹品種茶青萎凋期游離氨基酸動態(tài)分析及評價

潘科，李琴，方仕茂，戴宇樵，冉乾松，劉忠英，楊婷

1(貴州省茶葉研究所，貴州 貴陽，550006)2(貴州大學 茶學院，貴州 貴陽，550025)

游離氨基酸可被人體直接吸收，其含量和成分能反映食品的營養(yǎng)價值，可參與人體的新陳代謝、生長、免疫，同時作為重要的呈味物質(zhì)體現(xiàn)出鮮、甜、酸、苦及澀等味感，這些多樣的味感形成了食物豐富的味覺層次[1]。游離氨基酸是許多其他化合物前體，如苯丙氨酸是類黃酮及部分揮發(fā)性物質(zhì)的前體[2]。游離氨基酸與糖類物質(zhì)在熱的作用下發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成的羰氨化合物對干茶香氣和色澤產(chǎn)生影響，如茶氨酸和D-葡萄糖或其他單糖，在150～160 ℃反應(yīng)可生成吡嗪和呋喃衍生物[3]。除美拉德反應(yīng)外，氨基酸還可經(jīng)斯卻克爾反應(yīng)降解生成相應(yīng)醛類、醇類，影響香氣品質(zhì)[4]。可見，游離氨基酸與茶葉品質(zhì)有密切聯(lián)系。

目前國內(nèi)外關(guān)于茶葉游離氨基酸提取及檢測，加工過程變化分析，保健功能等方面已有較多研究。ZHAO等[5]運用領(lǐng)苯二甲醛衍生方法可同時檢測茶葉中21種游離氨基酸。彭影琦等[6]研究發(fā)現(xiàn)，L-茶氨酸可通過增加腸道絨毛高度、提高絨毛高度與隱窩深度比值來改善小鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時可促進十二指腸、空腸對氨基酸的吸收利用。傳統(tǒng)茶葉按加工工藝分為六大類，萎凋是茶葉加工中極其基礎(chǔ)且關(guān)鍵的工序[7]，加工中常根據(jù)不同成茶品質(zhì)設(shè)置萎凋處理，為后期加工物質(zhì)轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。福鼎大白為貴州省主要栽種品種，金觀音為大量引入貴州省的烏龍茶栽種品種[8]，黔茶1號是貴州省自主選育優(yōu)良品種[9]。目前關(guān)于萎凋期游離氨基酸差異和不同呈味氨基酸變化規(guī)律的研究尚不多，明確主栽品種萎凋期規(guī)律可增進對品種適制性理解。本研究特選取3個代表性栽培品種探究萎凋葉游離氨基酸組成、含量和變化趨勢，為改進萎凋工藝提升貴州綠茶品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

供試材料來源于貴州茶葉研究所種質(zhì)資源圃分別是福鼎、金觀音及黔茶1號。

1.2 儀器與試劑

冷凍干燥機，浙江雙嘉儀器有限公司；超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；高效液相色譜儀及熒光檢測器，美國Waters公司；恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司。

Waters AccQ.Tag化學試劑包:硼酸緩沖液，衍生劑粉末，衍生劑稀釋液，混合氨基酸水解標樣，美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 萎凋處理

于2019年7月下旬早上采收一芽二葉鮮葉，相對濕度60%，25 ℃條件下恒溫萎凋，薄攤2～3 cm，每隔3 h取1次樣。

1.3.2 游離氨基酸的測定

精確稱取0.1 g(±0.000 5 g)茶粉，置于15 mL離心管中，移液管取10 mL純水。在100 ℃水浴中浸提45 min，每隔10 min振蕩1次。冷卻至室溫，將得到的氨基酸提取液用0.45 μm水系濾頭過濾，制成待衍生樣品。

1.3.2.1 樣品游離氨基酸衍生

制備衍生試劑：用Waters AccQ.Tag化學試劑包中衍生劑稀釋液1 mL溶解衍生試劑粉末，置于預(yù)熱55 ℃的加熱裝置，直至粉末完全溶解，加熱時間不超過10 min。樣品制備：潔凈槍頭吸取10 μL氨基酸提取液于內(nèi)襯管，換潔凈槍頭吸取70 μL硼酸緩沖液注入內(nèi)襯管，渦旋混合；再取清潔槍頭吸取20 μL衍生試劑注入內(nèi)襯管，立即渦旋混合10 s，室溫放置1 min，在55 ℃加熱裝置下加熱10 min，等待進樣。

1.3.2.2 氨基酸分析

衍生后，氨基酸帶有發(fā)光基團，使用配備熒光檢測器的高效液相色譜儀進行檢測。檢測波長為，激發(fā)波長250 nm，入射波長395 nm。檢測溫度25 ℃，進樣量10 μL。流動相：A相：體積比1∶10稀釋濃縮液A(AccQ.Tag洗脫液)，0.22 μm濾膜抽濾；B相：色譜純級別乙腈；C相：屈臣氏蒸餾水。流動相均要進行15 min超聲脫氣處理。流速設(shè)為1 mL/min，梯度洗脫條件如下：0 min：100%A；17 min：91%A，5%B，4%C；24 min：80%A，17%B，3%C；32 min：68%A，20%B，12%C；34 min：68%A，20%B，12%C；35 min：60%B，40%C；38 min：100%A；45 min：100%A。

1.3.3 味道強度值的計算

味道強度值(taste active value，TAV)為呈味物質(zhì)測定值與呈味物質(zhì)味覺閾值的比值[10]。

1.3.4 特殊氨基酸分析

脯氨酸是一種小分子的相容滲透劑，是水溶性最大的氨基酸。作為植物細胞內(nèi)的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 脯氨酸是分布最廣泛的一種。干旱、高鹽、高溫、冰凍、氧化及重金屬等非生物脅迫條件都會導(dǎo)致植物體內(nèi)脯氨酸含量的增加，大量積累的脯氨酸可維持胞液的滲透平衡，減輕逆境脅迫對細胞的傷害[11]。萎凋使新梢離體后長時間進行水分脅迫，期間脯氨酸要通過滲透調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)生化反應(yīng)。茶氨酸是茶樹特征氨基酸，約占游離氨基酸總量50%以上，極易溶于水，水溶液呈鮮味和甜味其鮮甜味高于谷氨酰胺和天冬氨酸，對茶湯苦澀味具有緩解作用且對甜味具有增強作用，它由谷氨酸和乙胺合成，水解后又生成谷氨酸和乙胺，乙胺部分參與合成兒茶素[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Origin進行圖表制作，SPSS 2018進行單因素方差分析,以P<0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 萎凋葉葉相變化

茶樹離體新梢經(jīng)萎凋緩慢失水，葉相發(fā)生顯著變化，如圖1所示(選取0至12 h)。葉質(zhì)由飽滿硬挺轉(zhuǎn)至柔軟，葉色由鮮綠轉(zhuǎn)向深綠甚至更暗。品種使葉質(zhì)差異失水程度具有差異，失水能力強弱使葉片卷曲程度大小不一。福鼎和黔茶1號在9 h時，葉緣大幅背卷，金觀音則發(fā)生在6 h。取樣間隔時間短， 因12 h 后葉片顏色失綠轉(zhuǎn)向灰白略帶棕褐，且各時間節(jié)點間樣品圖片已無明顯區(qū)別，特選取12 h以及之前樣品以便觀察萎凋葉狀態(tài)。

2.2 不同品種萎凋期游離氨基酸變化規(guī)律

由表1～表3可知，福鼎、金觀音和黔茶1號在萎凋期均檢出天冬氨酸(aspartic acid，Asp)、絲氨酸(serine，Ser)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、甘氨酸(glycine，Gly)、組氨酸(phenylalanine，His)、精氨酸(arginine，Arg)、蘇氨酸(threonine，Thr)、丙氨酸(alanine，Ala)、脯氨酸(proline， Pro)、茶氨酸(theaine，Thea)、半胱氨酸(cysteine，Cys)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)、纈氨酸(valine， Val)、蛋氨酸(methionine，Met)、賴氨酸(lysine， Lys)、異亮氨酸(isoleucine，Ile)、亮氨酸(leucine，Leu)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)共計18種游離氨基酸。福鼎游離氨基酸總量以15 h為轉(zhuǎn)折點后呈上升趨勢，金觀音分別在6 h和18 h有所下降，黔茶1號在12 h到達總含量小高峰，后有所降低，三者游離氨基酸隨著萎凋時間延長有所增加，均在萎凋24 h達到最大值，與JABEEN等[13]和SAPTASHISH等[14]研究結(jié)果一致，且游離氨基酸總量在3.938～43.309 mg/g。總體來看福鼎含量最高，金觀音次之，黔茶1號最低。從氨基酸組分來看，茶葉特征氨基酸——茶氨酸含量明顯高于其他17種游離氨基酸，含量在0.732～13.699 mg/g，其次是谷氨酸，含量范圍在0.922～5.305 mg/g。

福鼎 0 h福鼎 3 h福鼎 6 h福鼎 9 h福鼎 12 h 金觀音0 h 金觀音3 h金觀音6 h金觀音9 h金觀音12 h黔茶1號0 h黔茶1號3 h黔茶1號6 h黔茶1號9 h黔茶1號12 h

表1 福鼎不同萎凋時間游離氨基酸含量 單位:mg/g

必需氨基酸(essential amino acid，EAA)是蛋白質(zhì)合成，組織修復(fù)和營養(yǎng)吸收需要的，包括Thr、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、His和Lys[15]。3個品種中EAA在萎凋期間總體呈上升趨勢，占氨基酸總量的19.502%～37.959%。必需氨基酸占比均值為整個萎凋期必需氨基酸占比總值與取樣數(shù)的比值，黔茶1號最高(33.200%)，金觀音次之(31.451%)，福鼎最低(24.666%)。黔茶1號分別在3、12、15、21 h接近37%，18 h達到最大37.959%，占比接近世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的40%營養(yǎng)標準[16]，說明黔茶1號所含游離氨基酸具有較高營養(yǎng)價值。金觀音在15 h為最大值34.450%，福鼎在24 h為最大值30.212%。

自然界中氨基酸有20多種，其中Glu、Asp、Arg、Gly、Phe、Tyr、Met、Leu、Lys稱為藥用氨基酸[17]。藥用氨基酸含量占總氨基酸百分比為33.489%～62.711%，萎凋期間總體呈下降趨勢，前期占比高后期占比降低。藥用氨基酸占比均值為整個萎凋期藥用氨基酸占比總值與取樣數(shù)的比值，以黔茶1號最高(48.234%)，福鼎次之(41.412%)，金觀音最低(40.971%)。黔茶1號和福鼎在萎凋3 h為最大值，金觀音最大值在0 h。

2.3 不同品種萎凋期呈味氨基酸動態(tài)變化及分析

食物中的氨基酸由游離態(tài)和非游離態(tài)組成，游離態(tài)氨基酸對滋味構(gòu)成起到重要作用，可分為鮮味(Asp、Glu)、甜味(Ala、Gly、Ser和Thr)和苦味(His、Met、Val、Arg、Ile、Leu、Phe和Tyr)[16]。如表4所示，福鼎鮮味氨基酸占比在3 h達到最大值，為42.55%，萎凋24 h時最低，為16.24%。甜味氨基酸占比隨萎凋時間推移而增加，在0 h為最小值，24 h為最大值，分別是6.34%和24.84%。苦味氨基酸總體呈上升趨勢，在15 h和24 h占比較高，分別為23.35%和24.80%。金觀音鮮味氨基酸變化趨勢先增后降，在9 h為最大值28.85%，24 h最小值為14.95%，甜味氨基酸占比的最大值最小值分別在0 h和24 h，最大值為19.39%，最小值為6.78%?？辔栋被嵴急瘸尸F(xiàn)階段性變化，0 h為最大值28.97%，由3 h的23.62%升至15 h的28.04%，后有所降低，24 h達到28.35%。黔茶1號鮮味氨基酸占比最大值在9 h，為37.85%，以9 h為轉(zhuǎn)折點在24 h降至最低為14.24%，甜味氨基酸占比變化趨勢不同于福鼎和金觀音，以15 h(33.40%)為轉(zhuǎn)折點先升后降，苦味氨基酸占比分別在0 h至3、9、12 h有增幅，12 h后無明顯變化趨勢。

黔茶1號和金觀音鮮味氨基酸占比變化趨勢為先升后降，福鼎隨萎凋時間增加而降低，占比均值：黔茶1號(26.19%)>福鼎(25.14%)>金觀音(22.23%)。福鼎和金觀音甜味氨基酸占比呈上升趨勢，黔茶1號呈先升后降趨勢，占比均值：黔茶1號(22.47%)>福鼎(15.63%)>金觀音(13.69%)。三者在苦味氨基酸占比變化不盡相同，福鼎總體呈上升趨勢，金觀音呈階段性變化，先升后降趨勢，黔茶1號在12 h保持相對穩(wěn)定，占比均值：黔茶1號(27.23%)>金觀音(26.53%)>福鼎(20.44%)。

2.4 萎凋期間呈味氨基酸分析

TAV值常用于衡量呈味物質(zhì)對滋味貢獻度，TAV值大于1認為對滋味有貢獻，小于1則認為對滋味構(gòu)成不做出貢獻[18]。茶氨酸作為鮮味主要貢獻因子，味覺閾值為0.06%[19]，如表1～表3所示，茶氨酸含量從高到低依次是福鼎、金觀音、黔茶1號，表明茶氨酸鮮味貢獻度最大的是福鼎，其次是金觀音，最小的是黔茶1號。3個品種所含呈味氨基酸TAV值如表5所示，鮮味氨基酸TAV值大于1的分別是Glu、Asp。甜味分別由Ala、Ser在萎凋12 h后做出呈味貢獻，苦味主要由氨基酸His、Met參與呈味。黔茶1號鮮味主要由茶氨酸和Glu構(gòu)成，12 h后甜味氨基酸Ser參與呈味，苦味主要由His構(gòu)成，9 h后Val參與呈味。金觀音鮮味構(gòu)成在黔茶1號基礎(chǔ)上增加Asp，12 h后Ser和15 h后Ala參與構(gòu)成甜味，苦味主要由His、Met構(gòu)成，Val、Ile和Phe分別在6、21 h后參與呈味。福鼎鮮味和金觀音鮮味構(gòu)成一致，12 h后Ala和Ser參與構(gòu)成甜味，苦味主要由His和Met構(gòu)成，Val、Phe、Arg和Ile分別在6、9、12和21 h參與呈味。

2.5 特殊氨基酸分析

植物生理學上常將脯氨酸作為衡量植物的抗逆性強弱指標之一，萎凋處理對離體鮮葉存在一定水分脅迫，由圖2可以看出，3個品種中脯氨酸含量以福鼎最高，金觀音次之，黔茶最低，據(jù)此推測福鼎品種廣泛栽種與其高脯氨酸含量存在潛在關(guān)系。

茶氨酸只在茶樹中有積累，且取決于品種[20]。FELDHEIM等[21]研究表明萎凋處理會引起茶氨酸含量降低，并推測可能由茶氨酸分解為谷氨酸和乙胺造成。WALLACE等[22]研究表明萎凋處理促進茶氨酸積累，并指出茶氨酸在第二葉中存在較大波動,推測前人研究由品種導(dǎo)致差異。本研究中茶氨酸含量隨時間變化呈現(xiàn)升降交替變化趨勢，如圖3所示，福鼎和金觀音存在谷氨酸合成和茶氨酸分解的動態(tài)變化，黔茶1號品種茶氨酸和谷氨酸含量則不存在這種趨勢，推測可能存在其他代謝支路，有待進一步研究。

圖2 三個茶樹品種萎凋時期脯氨酸含量變化圖Fig.2 Changes in proline content of three tea varieties during the withering period

a-福鼎；b-金觀音；c-黔茶1號圖3 三個品種谷氨酸和茶氨酸含量變化圖Fig.3 Changes in the content of glutamic acid and theanine in the three varieties

3 討論與結(jié)論

“看茶做茶”的要義在于根據(jù)在制品狀態(tài)進行茶葉加工。采用良好殺青條件固定萎凋期間形成的葉色才能得到以嫩綠、翠綠為優(yōu)的干茶色澤，適時萎凋才能塑造成茶外形。本研究得到福鼎和金觀音在6 h左右進行殺青固定品質(zhì)，而黔茶1號則應(yīng)在6 h左右，這與李子平等[23]研究一致。

游離氨基酸是綠茶鮮爽的主要因子，貴州主產(chǎn)綠茶，本研究特選取福鼎、金觀音和黔茶1號具有代表性的栽培品種，在萎凋環(huán)節(jié)進行游離氨基酸動態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)3個品種萎凋期間具有不同的變化趨勢，黔茶1號和金觀音鮮味氨基酸占比變化趨勢為先升后降，福鼎隨萎凋時間延長而降低。福鼎和金觀音甜味氨基酸占比呈上升趨勢，黔茶1號呈先升后降趨勢。對于苦味氨基酸而言，福鼎總體呈上升趨勢，金觀音呈階段性變化，先升后降趨勢，黔茶1號在12 h保持相對穩(wěn)定。游離氨基酸除呈味功能以外還具有一定營養(yǎng)價值，但目前針對萎凋茶葉游離氨基酸營養(yǎng)價值評價研究尚不多，前人研究多對加工過程或成品茶中兒茶素、咖啡堿及茶氨酸等進行深入研究，目前并沒有將目光聚焦于此。本研究發(fā)現(xiàn)萎凋期間必需氨基酸占比總體呈上升趨勢，其中黔茶1號必需氨基酸占比均值最高，金觀音次之，福鼎最低。黔茶1號分別在3 h和18 h占比接近世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的40%營養(yǎng)標準。藥用氨基酸含量占總氨基酸百分比為42%～87.5%，萎凋期間均在萎凋0 h為最大值，總體呈下降趨勢，說明更為復(fù)雜的加工處理使藥用氨基酸保留更少。這一結(jié)果佐證六大茶類中白茶具有較高的保健效果[24]。

大部分游離氨基酸TAV值小于1，由于呈味物質(zhì)存在互作作用，不代表對風味不做出貢獻，可表現(xiàn)為協(xié)同，加和、抑制效應(yīng)[25]，因此滋味的構(gòu)成不能單一地由濃度疊加。從氨基酸TAV值來看，金觀音和福鼎的氨基酸呈味強度大于黔茶1號，可能具有更為豐富的口感，這一結(jié)論有待進一步加工成品茶進行研究。HANIFAH等[26]發(fā)現(xiàn)低于呈味閾值的苦味氨基酸，可增強其他氨基酸的鮮味和甜味。例如:Phe、Tyr、Arg能增加呈味的復(fù)雜性和輔助提升鮮度[10]。茶湯中其他物質(zhì)同樣影響茶湯鮮味、甜味及苦味呈現(xiàn)。余鵬輝等[27]研究發(fā)現(xiàn)茶氨酸與甜味強度呈正相關(guān)，兒茶素、咖啡堿、沒食子酸、茶黃素、茶紅素含量與黃金茶、工夫紅茶甜味強度呈負相關(guān)，且兒茶素總量和茶黃素含量與甜味強度呈極顯著負相關(guān)。本研究僅進行萎凋期間游離氨基酸動態(tài)變化及分析，未能系統(tǒng)探明其他呈味物質(zhì)含量與呈味物質(zhì)間的互作作用，這有待進一步研究。

生理學上常將脯氨酸作為評價抗逆性指標，萎凋?qū)θ~片造成的水分脅迫導(dǎo)致其含量上升，其含量以福鼎最高，這與福鼎廣泛栽種存在一定聯(lián)系。茶氨酸是茶葉特征氨基酸，與谷氨酸和乙胺存在動態(tài)平衡。在福鼎和金觀音中存在這一明顯變化趨勢，在黔茶1號中則不明顯，黔茶1號中是否存在其他代謝途徑，是否由季節(jié)原因?qū)е掠写M一步發(fā)掘研究。