三種不同分子量6-羧基殼聚糖的制備、表征及其溶解性

高風(fēng)坤，陸 蕾，張文婧，程才紅，侯文龍，楊越冬

(河北科技師范學(xué)院河北省天然產(chǎn)物活性成分與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066004)

殼聚糖的分子量相對(duì)較大，小到數(shù)萬大到數(shù)百萬不等，獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和較大的分子量使得其溶解性較差，在水中不溶解，可以溶解于弱酸，在很大程度上限制了它的應(yīng)用[1,2]。

提高殼聚糖溶解性的方法之一是通過增加親水性官能團(tuán)來修飾分子結(jié)構(gòu)。殼聚糖含有多個(gè)羥基(C-6上的伯羥基和C-3上的仲羥基)和高活性(C-2)氨基[3]，可通過不同的方法進(jìn)行修飾。國(guó)內(nèi)外研究者已對(duì)殼聚糖的氧化進(jìn)行了大量的探究。Coseri等[4]研究表明，氮氧自由基2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)催化氧化還原體系可以氧化脂肪族和芳香族醇，是一種有效的催化體系。Bragd P等[5]使用TEMPO/NaClO/NaBr氧化體系將殼聚糖C-6位氧化，但由于鹵化試劑(NaClO和NaBr)和有機(jī)溶劑的使用，會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的污染。使用TEMPO-漆酶來氧化殼聚糖是對(duì)TEMPO氧化體系的很好的補(bǔ)充[6]。TEMPO-漆酶可用于促進(jìn)殼聚糖的區(qū)域選擇性氧化，以生產(chǎn)具有新的生物活性的定制衍生物[7]。但是TEMPO只能溶于有機(jī)溶劑，對(duì)氧化的底物有一定要求，體系氧化度不高，氧化醇到羧酸比較困難，大多氧化為醛或者酮。Whistler等[8]使用N2O4作為氧化劑，將固體N2O4揮發(fā)成氣體后隔濕氧化殼聚糖，測(cè)得氧化度不理想，且發(fā)生了主鏈降解及部分氧化脫氨。Horton等[9]采用CrO3作為氧化劑，先將醇羥基氧化成醛基，然后加水使醛基氧化為羧基，最后滴加NaOH溶液，使得C-6羧基形成鈉鹽形式，但其配位吸附的Cr3+很難除凈。

本次研究擬使用NO2作為氧化劑來氧化不同分子量的殼聚糖，研究不同分子量對(duì)其被氧化程度的影響，通過對(duì)殼聚糖進(jìn)行氧化來解決殼聚糖溶解性較差且難以應(yīng)用的問題，并對(duì)氧化后得到的6-羧基殼聚糖在不同溶劑中的溶解性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

50，200，1 000 ku分子量殼聚糖引自濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；冰乙酸(優(yōu)級(jí)純)、無水乙醇(分析純)、銅片(分析純)、硝酸(分析純)、甲醛(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、苯(分析純)、吡啶(分析純)、二氯甲烷(分析純)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、二甲基亞砜(分析純)、NaOH(分析純)均購(gòu)自天津歐博凱化工有限公司。

1.2 制備方法

1.2.1NO2氣體的制備通過銅片與濃硝酸反應(yīng)來制備NO2，將制備的NO2氣體用向上排空氣法收集到廣口瓶中，將尾氣通入到NaOH溶液中。

1.2.2 6-羧基殼聚糖的制備將3種不同分子量的殼聚糖分別浸泡在冰乙酸中充分接觸2 h，然后將制得的NO2氣體通入到裝有磁力攪拌的反應(yīng)裝置中。在10 h內(nèi)勻速的通入16氣瓶NO2氣體，停止通氣反應(yīng)一夜，再通入16氣瓶NO2氣體，停止通氣后繼續(xù)反應(yīng)一夜，整個(gè)反應(yīng)過程中盡量隔絕水氣。向裝置中加入同體積的無水乙醇，充分?jǐn)嚢?，抽濾，再用無水乙醇洗滌3次。干燥得到3種不同分子量的6-羧基殼聚糖(圖1)。

圖1 NO2氧化殼聚糖原理

1.3 表征手段

利用傅立葉變換紅外光譜儀(德國(guó)布魯克公司生產(chǎn)，TENSOR 27)對(duì)樣品分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成進(jìn)行分析；使用差熱熱重同步分析儀(德國(guó)耐馳公司生產(chǎn)，STA 4094 PC)測(cè)定樣品的熱穩(wěn)定性；使用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(日本日立公司生產(chǎn)，SU8010)對(duì)樣品形貌進(jìn)行觀察；使用X射線衍射儀(日本理學(xué)公司生產(chǎn)，D/max-2500PC)對(duì)樣品進(jìn)行物相分析。

1.4 氧化度測(cè)定

根據(jù)公式(1)對(duì)6-羧基殼聚糖的氧化度(DO)進(jìn)行測(cè)定[10,11]。

(1)

式中：c，v分別是NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L)和體積(mL)。

m為樣品中殼聚糖分子鏈上羥甲基(—CH2OH)被氧化成羧基(—COOH)的單元數(shù)(mol)。

(2)

式中：DO為氧化度，w為樣品質(zhì)量，X為原料殼聚糖脫乙酰度。

1.5 溶解性

將乙酸乙酯，乙醇，甲醇，二氯甲烷，苯，水，DMSO，DMF，0.3 mol/L NaOH溶液，0.2 mol/L稀乙酸溶液，吡啶各取3 mL分別倒進(jìn)裝有10 mg 6-羧基殼聚糖的玻璃小瓶中，溶解24 h，觀察6-羧基殼聚糖在各個(gè)溶劑中的溶解性。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化度

測(cè)定結(jié)果表明，50 ku分子量6-羧基殼聚糖氧化度為33.18%；200 ku分子量6-羧基殼聚糖氧化度為39.94%；1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖氧化度為54.54%。在相同的制備條件下，氧化度隨著殼聚糖分子量的增大而升高，說明殼聚糖的分子量越高越容易被氧化。

2.2 紅外光譜分析

2.2.1殼聚糖3種不同分子量的殼聚糖的紅外光譜分析結(jié)果表明，殼聚糖的特征伸縮振動(dòng)吸收峰位置都與文獻(xiàn)[12]一致(圖2)。在3 427.44 cm-1處的強(qiáng)而寬的峰為O—H和N—H的伸縮振動(dòng)吸收峰；在2 872.26 cm-1和2 918.54 cm-1處的峰為—CH對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰和—CH2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；在1 649.10 cm-1處為酰胺Ⅰ帶吸收峰；在1 598.95 cm-1處為殼聚糖分子中—NH2的面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰；1 421.51 cm-1處吸收峰為—CH2彎曲和—CH3變形振動(dòng)吸收峰；1 381.08 cm-1處為—CH彎曲振動(dòng)和對(duì)稱變形振動(dòng)吸收峰；在1 155.33 cm-1處的吸收峰為吡喃環(huán)中不對(duì)稱氧橋伸縮振動(dòng)；在1 078.19 cm-1附近的二級(jí)羥基C—O伸縮、1 031.89 cm-1處的一級(jí)羥基的C—O伸縮和氨基的C—N伸縮振動(dòng)吸收峰重疊，在1 000～1 100 cm-1范圍內(nèi)形成較強(qiáng)較寬的吸收峰；896.88 cm-1處的伸縮振動(dòng)吸收峰為β-吡喃糖苷的特征吸收峰。在1 649.10 cm-1與1 598.95 cm-1處的吸收峰強(qiáng)弱可初步判斷殼聚糖分子的脫乙酰度，后者峰強(qiáng)相比前者越大，表明殼聚糖分子脫乙酰度越高。

圖2 殼聚糖的紅外光譜a，50 ku分子量殼聚糖；b，200 ku分子量殼聚糖；c，1 000 ku分子量殼聚糖

2.2.2 6-羧基殼聚糖3種6-羧基殼聚糖的紅外光譜結(jié)果表明，3種殼聚糖都成功被氧化(圖3)。在1 031.89 cm-1處吸收峰強(qiáng)度明顯減弱，說明C-6上的醇羥基被氧化；在1 726.25 cm-1處出現(xiàn)羧基的伸縮振動(dòng)吸收峰，說明醇羥基被氧化為羧基。3種不同分子量的殼聚糖都成功被氧化為6-羧基殼聚糖，且隨著殼聚糖分子量的增大，羧基的吸收峰也越來越強(qiáng)，說明6-羧基殼聚糖的氧化率隨著分子量的增大而提升，此結(jié)論與氧化度測(cè)定結(jié)果吻合。

圖3 6-羧基殼聚糖的紅外光譜a，50 ku分子量6-羧基殼聚糖；b，200 ku分子量6-羧基殼聚糖；c，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖

2.3 熱穩(wěn)定性

2.3.1殼聚糖不同分子量殼聚糖在氮?dú)鈿夥障拢髁繛?0 mL/min，Al2O3坩堝，升溫速率10 K/min，溫度范圍為20～800 ℃的熱重分析 (TG)圖譜表明，3種不同分子量殼聚糖的熱分解為兩個(gè)階段(圖4)，且分解溫度基本相同。第一個(gè)分解階段出現(xiàn)在80 ～110 ℃，主要是脫去部分水分，分子量大的殼聚糖失去質(zhì)量較少；第二個(gè)分解階段始于280 ℃左右，在500 ℃后，殼聚糖的質(zhì)量趨于穩(wěn)定。且分子量越大的殼聚糖分解的溫度越高。50 ku分子量殼聚糖在284.2 ℃時(shí)開始分解，200 ku分子量殼聚糖在286.5 ℃時(shí)開始分解，1 000 ku分子量殼聚糖在287.0 ℃時(shí)開始分解。這一階段為殼聚糖自身的熱降解，包括殼聚糖的糖環(huán)的脫水，聚合物單元的解聚。

2.3.2 6-羧基殼聚糖比較3種不同分子量6-羧基殼聚糖的TG圖譜和殼聚糖的TG圖譜可以得出結(jié)論，殼聚糖比6-羧基殼聚糖熱穩(wěn)定性更好(圖4，圖5)。殼聚糖在結(jié)束熱分解第一階段的脫水后隨著溫度升高質(zhì)量保持不變，說明分子內(nèi)化學(xué)鍵更穩(wěn)定；而6-羧基殼聚糖在失水后聚合物單元也開始斷裂，糖環(huán)脫水，這是由于將殼聚糖C-6位醇羥基氧化為羧基破壞了殼聚糖原有的分子間的氫鍵。3種不同分子量的6-羧基殼聚糖的熱穩(wěn)定性相差不大，隨著分子量增大，氧化度的提升對(duì)6-羧基殼聚糖的熱穩(wěn)定性也有影響(圖5)。在熱分解第二階段，氧化度越高失去質(zhì)量越迅速。由于氧化度升高導(dǎo)致氧含量升高，最終煅燒后剩余的殘余質(zhì)量隨著氧化度的升高而減小。

圖4 殼聚糖的TG圖譜a，50 ku分子量殼聚糖；b，200 ku分子量殼聚糖；c，1 000 ku分子量殼聚糖圖5 6-羧基殼聚糖的TG圖譜a，50 ku分子量6-羧基殼聚糖；b，200 ku分子量 6-羧基殼聚糖；c，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖

2.4 物相分析

X射線衍射結(jié)果表明，3種殼聚糖的衍射峰位置重合(圖5中的a，c，e曲線)。由于殼聚糖為低結(jié)晶性高分子，在2θ為20.38°處觀察到的衍射峰為殼聚糖的非晶態(tài)聚合峰，與文獻(xiàn)[12]中殼聚糖的特征衍射峰位置吻合。而3種6-羧基殼聚糖的衍射峰位置與殼聚糖基本一致(圖5中的b，d，f曲線)，說明對(duì)殼聚糖C-6位進(jìn)行羧基化并不會(huì)改變殼聚糖的晶型，分子鏈的規(guī)整性還保持完好，沒有受到破壞。

2.5 形貌分析

在同一尺寸下觀察3種不同分子量殼聚糖及其氧化物6-羧基殼聚糖的形貌，SEM形貌分析表明，殼聚糖形貌為多層紙片型結(jié)構(gòu)重疊在一起的片層狀結(jié)構(gòu)，且表面粗糙，凹凸不平(圖7)。殼聚糖的寬度在幾十微米到100多微米，厚度為幾微米；由于本反應(yīng)屬于非均相反應(yīng)，反應(yīng)前后對(duì)殼聚糖形貌未發(fā)生較大變化，6-羧基殼聚糖的形貌與殼聚糖基本相似，表面較殼聚糖更為粗糙。

圖6 殼聚糖和6-羧基殼聚糖的XRD圖譜50 ku分子量:a 殼聚糖，b 6-羧基殼聚糖；200 ku分子量：c 殼聚糖，d 6-羧基殼聚糖；1 000 ku分子量：e 殼聚糖，f 6-羧基殼聚糖

圖7 殼聚糖及其衍生物的FESEM結(jié)果50 ku分子量：(a)殼聚糖，(d)6-羧基殼聚糖；200 ku分子量：(b)殼聚糖，(e)6-羧基殼聚糖；1 000 ku分子量：(c)殼聚糖，(f)6-羧基殼聚糖

2.6 溶解性

溶解性測(cè)試結(jié)果表明，分子量越大，6-羧基殼聚糖的溶解性越好。圖8中的A，B，C分別為50，200，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖在不同溶劑中的溶解情況?？梢钥闯觯》肿恿繗ぞ厶侨芤旱念伾S；而大分子量殼聚糖溶液的顏色呈白色，氧化反應(yīng)未改變產(chǎn)物顏色。6-羧基殼聚糖在水和稀乙酸溶液中溶解性最強(qiáng)，6-羧基殼聚糖完全溶解，在DMSO中大部分溶解，其次在苯、吡啶和氫氧化鈉溶液中部分溶解，在其他溶劑中未溶解。對(duì)比不同分子量6-羧基殼聚糖在同一溶劑中的溶解情況，可以看到分子量越高在溶劑中的溶解性越好，這一結(jié)果正好和測(cè)得的6-羧基殼聚糖的氧化度結(jié)果相對(duì)應(yīng)，6-羧基殼聚糖的氧化度越高，其在溶劑中溶解的越多，溶解性越好。

圖8 3種6-羧基殼聚糖在不同溶劑中的溶解性A行，50 ku分子量6-羧基殼聚糖；B行，200 ku分子量6-羧基殼聚糖；C行，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖

3 結(jié) 論

本次試驗(yàn)使用NO2作為氧化劑來氧化3種不同分子量的殼聚糖制備6-羧基殼聚糖。通過XRD，SEM，F(xiàn)TIR，熱重分析對(duì)殼聚糖和6-羧基殼聚糖進(jìn)行了表征，測(cè)試其氧化度以及對(duì)其在不同溶劑中的溶解情況進(jìn)行初步試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：(1)使用NO2氧化法成功將殼聚糖的C-6位的醇羥基氧化為羧基，并制備出3種不同分子量6-羧基殼聚糖。(2)引入羧基使得6-羧基殼聚糖熱穩(wěn)定性變差但并未改變殼聚糖晶體晶型。(3)殼聚糖分子量越大氧化效果越好，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖的氧化度為54.54%，(4)3種不同分子量6-羧基殼聚糖在水和稀乙酸溶液中完全溶解，在DMSO中大部分溶解，其次在苯、吡啶和氫氧化鈉溶液中部分溶解，在其他溶劑中未溶解。