基于內(nèi)皮細胞自噬探討紫色疽瘡膏治療糖尿病足血瘀型慢性創(chuàng)面的作用機制※

王廣宇 王 雨 王雷永 徐旭英

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科，北京 100010)

與糖尿病有關(guān)的瘡面，在破潰前已經(jīng)有隱性損傷，破潰后愈合過程中常停滯于某一階段，從而影響了正常的愈合過程，轉(zhuǎn)變?yōu)殡y愈合的慢性創(chuàng)面，是臨床上的治療難點之一[1]。中醫(yī)在慢性創(chuàng)面局部辨證方面經(jīng)驗豐富，其中局部具有顏色黯、生長乏力、滲出較少特點的瘡面，屬于血瘀型瘡面[2-3]。局部微循環(huán)障礙是血瘀型創(chuàng)面發(fā)生原因之一，由于某些因素如炎癥因子、細菌感染等導致暫時性血管舒縮功能失調(diào)，從而引起局部供血不足缺血，改變創(chuàng)面微環(huán)境，改善微循環(huán)，對創(chuàng)面愈合無疑是必要和有效的[4-5]。近年來自噬誘導對內(nèi)皮細胞收縮功能的調(diào)控逐漸得到認可[6]。紫色疽瘡膏是我們治療糖尿病足血瘀型慢性創(chuàng)面的經(jīng)驗方，本研究通過觀察紫色疽瘡膏對內(nèi)皮細胞自噬作用的影響，探討其治療糖尿病足血瘀型慢性創(chuàng)面的作用機制。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 診斷標準 糖尿病足慢性創(chuàng)面的診斷參照《國際糖尿病足工作組糖尿病足慢性創(chuàng)面處理指南》中的相關(guān)診斷標準[7]，糖尿病足潰瘍病程>4周不能愈合，且也無明顯愈合趨勢。局部血瘀證參照《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》中辨證標準[8]：創(chuàng)面潰爛經(jīng)久，基底呈黯紅色或紫黯色，滲出物較少或干枯無膿，腐肉少許或腐肉雖脫，但新肉難生，創(chuàng)周膚色黯無紅腫。

1.1.2 納入標準 符合上述診斷標準；糖尿病足Wagner分級[7]2～3級，創(chuàng)面面積4～10 cm2；患者簽屬知情同意書，并自愿參加本研究，經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.3 排除標準 排除放射性、結(jié)核性及癌性創(chuàng)面；排除由于動脈粥樣硬化閉塞癥導致的創(chuàng)面潰瘍者；合并有惡性腫瘤、急性心腦血管意外、腎功能不全、嚴重肝臟損傷等疾病者。

1.2 一般資料 共納入5例患者，男3例，女2例，年齡44～73歲，糖尿病病程5～21年，糖尿病足病程4個月～6年。

1.3 治療方法 單純采用紫色疽瘡膏(以龍血竭為主藥，還包括輕粉、紅粉、琥珀粉、乳香粉、冰片、煅珍珠粉，由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室加工成膏劑)外敷治療，每日1次。

1.4 皮膚標本選擇及保存 5例患者分別在治療前及治療3、6 d后局部蠶食清創(chuàng)換藥時留取適量創(chuàng)面組織標本，作為治療組。另選取肢體近端正常皮膚真皮淺層組織，作為正常對照組。2組組織分為2部分，一部分立即置于-80 ℃冰箱保存，其余放入10%中性福爾馬林溶液中保存，進行脫水、固定、石蠟包埋。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 微血管內(nèi)徑 對皮膚真皮淺層微血管內(nèi)皮細胞進行CD34免疫組織化學染色和免疫熒光四重染色[包括CD68、CD34、增殖細胞核抗原(PCNA)及α-平滑肌肌動蛋白(αSMA)]，觀察皮膚真皮淺層微血管內(nèi)徑變化情況。取上述石蠟包埋組織，切片后進行CD34免疫組織化學染色，再用日本Olympus公司CX41-12C02型光學顯微鏡進行觀察，CD34免疫組織化學檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，嚴格按照試劑盒說明操作。取-80 ℃冰箱保存組織，按文獻[9-10]中的方法進行免疫熒光四重染色，再用日本Olympus公司CX31-32RFL型熒光顯微鏡進行觀察，其中TSA plus免疫熒光試劑盒、一抗、二抗及熒光素均由美國PerkinElmer公司提供，小鼠抗人CD68、CD34、PCNA及αSMA抗體由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，嚴格按照試劑盒說明操作。均采用德國Carl Zeiss公司ZEN顯微圖像分析系統(tǒng)觀察及測量微血管內(nèi)徑。

1.5.2 細胞自噬 采用免疫組織化學染色法對膜型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3Ⅱ)染色觀察。取上述石蠟包埋組織，切片后進行LC3Ⅱ免疫組織化學染色，常規(guī)光學顯微鏡觀察完畢后換用高倍油鏡觀察，LC3Ⅱ免疫組織化學檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，嚴格按照試劑盒說明操作。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法對創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ/胞漿型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3Ⅰ)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白含量進行測定，采用美國Thermo Fisher Scientific公司MultiSkan MK3酶標儀進行檢測和拍照，相關(guān)試劑盒購自天津銳爾康生物科技有限公司，計算靶蛋白的積分光密度值，并與β-actin內(nèi)參蛋白進行比較，計算靶蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 2組皮膚真皮淺層微血管內(nèi)徑比較 見表1、圖1。

表1 2組皮膚真皮淺層微血管內(nèi)徑比較

注：A～D為免疫組織化學染色；E～H為免疫熒光四重染色，其中紅色為CD68+細胞，綠色為CD34+細胞，藍色為PCNA+細胞，紫紅色為αSMA+細胞

由表1、圖1可見，免疫組織化學染色和免疫熒光四重染色結(jié)果均顯示，與正常對照組比較，治療組治療前皮膚真皮淺層微血管內(nèi)徑明顯增大，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與治療組治療前比較，治療組治療3、6 d后皮膚真皮淺層微血管內(nèi)徑均明顯縮小，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療組治療3 d后與治療6 d后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 2組創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、eNOS及p-mTOR蛋白表達水平比較 見表2、圖2。

表2 2組創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、eNOS及p-mTOR蛋白表達水平比較

注：1正常對照組；2治療組治療前；3治療組治療3 d后；4治療組治療6 d后

由表2、圖2可見，與正常對照組比較，治療組治療前創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表達水平明顯降低，eNOS蛋白表達水平明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與治療組治療前比較，治療組治療3、6 d后創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表達水平明顯升高，eNOS蛋白表達水平明顯降低，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療組治療3 d后與治療6 d后比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 2組LC3Ⅱ免疫組織化學染色結(jié)果 在低倍光鏡下觀察，治療組治療前及正常對照組皮膚真皮淺層微血管內(nèi)皮細胞LC3Ⅱ均呈現(xiàn)藍染，并且正常對照組藍染較深，治療組藍染較淡。治療組經(jīng)紫色疽瘡方治療后3、6 d后染色有所增加，但淺于正常對照組。在高倍油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，2組LC3Ⅱ為藍染的顆粒狀，較集中于細胞核部及周圍，并向外呈輻射狀排列，呈細小的顆粒狀[11]。正常對照組LC3Ⅱ藍染顆粒較多且顏色較深，治療組治療前LC3Ⅱ藍染顆粒少且顏色較淺，而經(jīng)紫色疽瘡方治療后3、6 d后LC3Ⅱ藍染顆粒有所增加，顏色加深。見圖3。

注：A～D為光鏡×200觀察結(jié)果；E～H為油鏡×1000倍觀察結(jié)果；I～L為油鏡局部放大圖

3 討論

創(chuàng)面的修復是一個復雜過程，主要包括炎癥期、增殖期及組織重塑期3個階段，任何一個階段出現(xiàn)異常都可導致創(chuàng)面的修復異常，其中過度炎性反應導致的血管生成紊亂、微血管功能障礙、上皮化異常等是創(chuàng)面難愈合的主要原因[12]。自噬是細胞內(nèi)的降解系統(tǒng),自噬小泡可以包裹衰老或受損的細胞器,將其運輸至溶酶體進行消化，降解的物質(zhì)可再循環(huán)利用，并可通過多種途徑調(diào)整細胞功能，對維持內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞穩(wěn)態(tài)及創(chuàng)面修復具有重要作用[13]。近年來，自噬在慢性創(chuàng)面內(nèi)皮細胞功能調(diào)節(jié)中的作用逐漸得到重視。研究表明，糖尿病足潰瘍瘡面中內(nèi)皮細胞自噬水平明顯低于未潰皮膚中內(nèi)皮細胞自噬水平，瘡面中的自噬被明顯抑制[14]。LC3是自噬過程的標志物，主要參與了自噬小體的形成，自噬發(fā)生時LC3前體分子首先裂解形成胞質(zhì)形式的LC3Ⅰ，然后再降解以膜結(jié)合形式的LC3Ⅱ附著到自噬體膜上，LC3Ⅰ與LC3Ⅱ存在一個生成與降解的動態(tài)過程，因此臨床通常以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值評估自噬水平的高低[14]。自噬的激活過程受多種基因和信號通路的調(diào)控，mTOR作為細胞內(nèi)中心信號調(diào)節(jié)因子，可接受激素、能量、營養(yǎng)、氧化應激、生長因子等多種信號的刺激，對細胞自噬的大多數(shù)信號傳導通路呈負性調(diào)控。mTOR可抑制自噬起始分子ULK1的活性，從而實現(xiàn)對自噬的調(diào)控，但當其磷酸化為p-mTOR后，可解除對ULK1的抑制，從而誘導細胞自噬產(chǎn)生系列的生理活動[15]。一氧化氮(NO)是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞舒縮的主要物質(zhì)，其合成酶主要為一氧化氮合酶(NOS)，eNOS就是存在于內(nèi)皮細胞中的NOS，當其激活時eNOS利用L-精氨酸和氧產(chǎn)生NO從而舒張血管，使血管內(nèi)徑增加[16]，而自噬可以調(diào)控eNOS水平，從而調(diào)控血管的舒縮，也是調(diào)節(jié)舒縮功能的主要途徑[17]。本研究結(jié)果顯示，治療組治療前LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白水平較正常對照組明顯降低(P<0.05)，也說明了內(nèi)皮細胞自噬水平受到抑制，eNOS水平較正常對照組明顯升高(P<0.05)，進而也導致了皮膚真皮淺層微血管內(nèi)徑較正常對照組明顯增加(P<0.05)。但另有研究認為，誘導自噬后可使eNOS表達增加，而自噬水平降低伴隨著eNOS表達的下調(diào)[18]，與本研究結(jié)果相左，其原因不明，可能與本研究所選的均為血瘀型慢性創(chuàng)面有關(guān)，其具體原因需要進一步研究。

糖尿病足慢性創(chuàng)面的愈合問題一直是臨床治療的難點，中醫(yī)學認為其發(fā)生與氣、血關(guān)系密切，機體氣虛和局部血瘀是導致創(chuàng)面遷延難愈的根本原因[19-20]。糖尿病足病程日久，創(chuàng)面長期難以愈合或反復發(fā)作，耗傷人體氣血，氣虛則行血無力，血虛則不能滋養(yǎng)筋骨四肢，造成血流遲緩，經(jīng)脈失養(yǎng)，氣血瘀滯，血脈擴張，久郁化熱，熱瘀結(jié)合，蘊結(jié)肌膚，腐蝕筋肉進而導致創(chuàng)面難愈。紫色疽瘡膏是我們臨床治療糖尿病足血瘀型慢性瘡面的經(jīng)驗方[21]，方中重用龍血竭活血定痛，化瘀止血，斂瘡生?。荤攴?、乳香粉增強化瘀之力；紅粉、輕粉味辛，可拔毒提膿，祛腐生?。槐梁?，通諸竅，散郁火，消腫止痛，增加通散之功；珍珠粉解毒生肌，斂瘡止癢。諸藥合用，以活血化瘀為重點，佐以解毒斂瘡、祛腐生肌，則絡通、瘀散、腐去、肉生。現(xiàn)代藥理學研究表明，龍血竭中主要成分龍血素A、龍血素B具有促進大鼠急性皮膚創(chuàng)傷愈合的作用，能通過參與調(diào)控P物質(zhì)和Bcl-2的表達,增加細胞增殖和減少細胞凋亡，有效地促進糖尿病燙傷創(chuàng)面的愈合，此外龍血竭還有抗菌、抗炎、降血糖、降血脂、抗腫瘤等功效[22-24]。本研究結(jié)果顯示，治療組治療3、6 d后創(chuàng)面組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表達水平較治療前明顯升高(P<0.05)，eNOS蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，皮膚真皮淺層微血管內(nèi)徑明顯縮小(P<0.05)。

綜上所述，紫色疽瘡膏治療糖尿病足血瘀型慢性創(chuàng)面療效確切，其作用機制可能與增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p-mTOR蛋白表達水平，降低eNOS蛋白表達水平，提高內(nèi)皮細胞自噬水平有關(guān)，可改善血管內(nèi)皮細胞的舒縮功能，改善創(chuàng)面局部血管擴張淤滯狀態(tài)，改變局部微環(huán)境，促進血液循環(huán)，促進新陳代謝，進而促進創(chuàng)面的生長和修復。然而創(chuàng)面修復畢竟是一個十分復雜的過程，中藥也具有多重的生物功效，紫色疽瘡膏對其治療是否還存在其他的作用途徑，有待將來進一步觀察研究。