自身免疫性肝炎小鼠肝組織中的膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)情況▲

劉耿烽 范俊華 呂曉丹 張怡華 曾睿智 陳如艷 詹靈凌 呂小平

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科；2 檢驗(yàn)科，南寧市 530021，電子郵箱:369215736@qq.com)

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一種較為少見(jiàn)的特異性自身免疫性肝臟慢性疾病，具體病因尚未明確，但AIH的患病率正逐年增加[1]。AIH可發(fā)生在各個(gè)種群及每個(gè)年齡階段人群，以女性多見(jiàn)，具有遺傳易感性并且受環(huán)境等因素影響[2]。該病臨床表現(xiàn)多樣化，患者可表現(xiàn)為無(wú)癥狀或輕度轉(zhuǎn)氨酶升高，也可表現(xiàn)為急性肝炎，甚至急性肝衰竭。此外，部分患者可同時(shí)出現(xiàn)關(guān)節(jié)痛、內(nèi)分泌功能障礙、皮膚紋和痤瘡等肝外表現(xiàn)[3]。AIH的診斷主要依據(jù)以界面性肝炎為特征的肝組織病理學(xué)改變、特征性自身免疫抗體陽(yáng)性、高丙球蛋白血癥。根據(jù)血清自身抗體，AIH主要分為兩型：抗核抗體和(或)抗平滑肌抗體陽(yáng)性的AIH定義為AIH 1型(AIH-1)；抗肝腎1型微粒體抗體或抗肝細(xì)胞溶質(zhì)1型抗體陽(yáng)性的AIH定義為AIH 2型(AIH-2)[4]。AIH治療的目標(biāo)是阻止并發(fā)癥的發(fā)生以及病情達(dá)到完全緩解，早發(fā)現(xiàn)、早治療、早預(yù)防并發(fā)癥及阻止其進(jìn)展，成為治療AIH的關(guān)鍵所在。然而臨床上治療AIH的方法有限，目前經(jīng)典的治療藥物主要是免疫抑制劑和皮質(zhì)類固醇。由于糖皮質(zhì)激素或硫唑嘌呤的療效欠佳或所導(dǎo)致的嚴(yán)重不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者不易堅(jiān)持用藥而發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭，最終只能進(jìn)行肝移植[5-6]。

膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1，AnxA1)是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制中性粒細(xì)胞和促炎因子的產(chǎn)生，同時(shí)其可受到糖皮質(zhì)激素的調(diào)節(jié)而發(fā)揮抗炎作用[7]。本研究使用刀豆蛋白A建立AIH小鼠模型，通過(guò)檢測(cè)肝組織AnxA1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，探究AnxA1在AIH的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用，為AIH的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57BL/6小鼠16只，6～8周齡，體質(zhì)量為20～22 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào): SCXK 桂2014-0002) 。在60% 相對(duì)濕度的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要試劑 刀豆蛋白A購(gòu)自Sigma公司(貨號(hào)：SLBT3093)；AnxA1單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司(貨號(hào)：ab214486、ab181602)；生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)購(gòu)自Invitrogen公司(貨號(hào)：TJ26211)；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(貨號(hào)：AA1302-1、AI40713A、AI52235A)；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 (貨號(hào)：K197712D)；蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)：20190910、20190826)。

1.3 AIH動(dòng)物模型建立及標(biāo)本采集 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為正常組和模型組，每組8只，正常飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，模型組小鼠通過(guò)尾靜脈注射12.5 mg/kg的刀豆蛋白A進(jìn)行造模，正常組小鼠通過(guò)尾靜脈注射等量的生理鹽水。給藥48 h后取材，頸椎脫臼法處死小鼠，眼球采集血液800～1 000 μL制備血清標(biāo)本，取小部分肝臟組織用4%甲醛溶液固定，其余肝臟組織存入-80℃冰箱中備用。

1.4 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 眼球采血后，收集血液4℃下3 000 r/min離心10 min，留取血清，使用日立7600型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT和AST水平。

1.5 肝組織病理學(xué)檢查 肝組織經(jīng)過(guò)固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織中AnxA1的原位表達(dá) 切片經(jīng)脫蠟和水化后，根據(jù)AnxA1單克隆抗體說(shuō)明書及免疫組化試劑盒要求，進(jìn)行抗原堿性修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、山羊血清封閉，然后用AnxA1單克隆抗體稀釋液(1 ∶4 000)在4℃條件下孵育過(guò)夜，生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG孵育15 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育15 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片，鏡下觀察。

1.7 肝組織AnxA1 mRNA水平的檢測(cè) 稱取30 mg肝組織,剪碎，加入1 mL TRIzol冰上勻漿,按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，使用分光光度計(jì)進(jìn)行總RNA定量，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肝組織AnxA1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH作為內(nèi)參。AnxA1上游引物5′-AGCAGATCAAGGCCGCGTA-3′，下游引物5′-CATGGCACCACGGAGTTCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149 bp，由寶生物工程(大連)有限公司合成; GAPDH上游引物為5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物為5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為150 bp，由南寧科迪生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)定量PCR試劑盒說(shuō)明書配置20 μL反應(yīng)體系后置于PCR儀(Applied Biosystems公司，StepOne Plus型)中。PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2X) 10 μL，PCR Forward Primer (10μM) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10μM) 0.8 μL， ROX Reference Dye (50X) 0.4 μL，DNA模板 2 μL，dH2o (滅菌)6 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt計(jì)算AnxA1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 肝組織AnxA1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 取30 mg肝組織，剪碎，加入蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解液，在冰上用電動(dòng)組織研磨器研磨勻漿，冰上靜止裂解30 min后4°C、12 000 r/m離心15 min，取上清液。利用分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，將蛋白上樣緩沖液加入上清液中混勻，95℃加熱10 min 變性，冷卻后上樣，10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TBST在搖床上室溫封閉硝酸纖維素膜1 h，將膜放于稀釋后的AnxA1單克隆抗體溶液(1 ∶2 000)和GAPDH 單克隆抗體溶液(1 ∶10 000)中在4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，用PBST在搖床上室溫洗硝酸纖維膜3次，10 min/次，然后放入稀釋后的二抗生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)溶液(1 ∶10 000)在搖床上室溫孵育1 h，再用PBST在搖床上室溫洗膜3次，10 min/次，紅外熒光掃描儀成像系統(tǒng)( 美國(guó)Bio-Rad 公司，Odyssey型) 照相記錄，Image J 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8.2軟件進(jìn)行圖形制作。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的資料以中位數(shù)(四分位距)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清指標(biāo)水平的比較 模型組的血清ALT、AST 中位水平為201(358) U/L、157.5(311) U/L，分別高于正常組的15(8.75) U/L、16(7.50) U/L(z=-3.373，P=0.001；z=-3.363，P=0.001)。

2.2 兩組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 正常組小鼠肝臟外觀正常，HE染色結(jié)果提示肝組織無(wú)炎性細(xì)胞表達(dá)。模型組小鼠肝臟外觀充血腫大，鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹、水樣變性，門管區(qū)和小葉中央?yún)^(qū)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，存在界面性肝炎，但無(wú)明顯擴(kuò)大和纖維化。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠肝組織HE染色結(jié)果(×200)

2.3 兩組小鼠肝組織AnxA1原位表達(dá)的比較 正常組小鼠的肝組織沒(méi)有陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，而模型組的肝組織可以看到較多的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)著色成棕黃色，見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠肝組織AnxA1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)

2.4 兩組小鼠肝組織AnxA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較 模型組小鼠肝組織中AnxA1 mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均高于正常組(均P<0.05)，見(jiàn)表1及圖3。

表1 兩組小鼠肝組織AnxA1的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖3 小鼠肝組織AnxA1蛋白質(zhì)表達(dá)水平

2.5 AIH小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平與肝組織AnxA1表達(dá)的相關(guān)性 AIH小鼠血清ALT、AST水平與肝組織AnxA1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.887、0.872，均P<0.001)，與肝組織AnxA1蛋白的表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.950、0.908，均P<0.001)。

3 討 論

肝臟在人體免疫系統(tǒng)中占有重要的地位，肝臟免疫系統(tǒng)能夠?qū)Σ≡w、炎癥和腫瘤等做出免疫應(yīng)答。肝臟的免疫耐受性通過(guò)樹突細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞介導(dǎo)。肝臟存在的自然殺傷細(xì)胞、CD56+T淋巴細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、γδT細(xì)胞和黏膜相關(guān)恒定的T淋巴細(xì)胞等先天淋巴細(xì)胞，不僅能夠識(shí)別并殺死外界微生物和消除宿主細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，促進(jìn)免疫系統(tǒng)細(xì)胞分化及活化，也可以促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞成熟并產(chǎn)生免疫原性T淋巴細(xì)胞，還可使肝臟免疫負(fù)荷增大從而誘導(dǎo)和維持肝臟損傷，最終引起自身反應(yīng)性T細(xì)胞的自身免疫性肝病[1，8]。AIH的病理特點(diǎn)是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中炎性細(xì)胞主要由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和漿細(xì)胞組成，其在門靜脈周圍浸潤(rùn)，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)進(jìn)行性破壞。CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞在肝臟中聚集識(shí)別并破壞肝細(xì)胞，隨后發(fā)展成肝纖維化，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化和肝衰竭[6，9]。經(jīng)典的AIH小鼠模型由刀豆蛋白A誘導(dǎo)而成：在刀豆蛋白A的作用下免疫細(xì)胞被激活且大量細(xì)胞因子被釋放，導(dǎo)致活化的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)肝組織，以及T淋巴細(xì)胞活化和向肝臟聚集而引起肝損傷[10-11]。本研究采用向小鼠尾靜脈注射刀豆蛋A法誘導(dǎo)AIH模型，結(jié)果顯示，模型組小鼠肝、脾外觀充血腫大，病理組織學(xué)提示肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞腫脹、水樣變性，門管區(qū)和小葉中央?yún)^(qū)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，但無(wú)明顯擴(kuò)大和纖維化，且模型組血清ALT、AST水平較正常組升高，提示造模成功。

膜聯(lián)蛋白超家族是一類能夠黏附在細(xì)胞的磷脂膜上的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，有4個(gè)由60～70個(gè)氨基酸組成的核心，并與獨(dú)特的N-末端區(qū)域相連，而N-末端決定了各自特殊的作用[12]。AnxA1是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白的超家族中的一員，分子量為37 kDa，由1個(gè)N-末端結(jié)構(gòu)域和4個(gè)保守的核心結(jié)構(gòu)域重復(fù)序列組成。AnxA1在鈣離子(1 mmol/L)存在的情況下，具有與鈣結(jié)合后改變構(gòu)象的能力，且與磷脂有很高的親和力，特別是與磷脂酶A2，這些結(jié)構(gòu)變化可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，特別是與潛在受體相互作用的能力[13]。內(nèi)源性AnxA1也能有效調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，可以參與機(jī)體的抗炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等[14]。AnxA1可以促進(jìn)Th1細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素、腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-2，并抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13[15]。Yang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，幼稚CD4+T淋巴細(xì)胞可以分化為Th1、Th2、Th17促炎細(xì)胞系，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子和促炎細(xì)胞因子的特異性表達(dá)，而AnxA1的缺失可導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞活化和終末器官炎癥反應(yīng)的增加，同時(shí)內(nèi)源性AnxA1具有抑制所有促炎性CD4+譜系活化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AHI模型組小鼠肝組織存在AnxA1的表達(dá),且模型組肝組織AnxA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于正常組，與血清ALT、AST水平均呈正相關(guān)，即與肝組織的炎癥反應(yīng)及肝損傷存在相關(guān)性，這表明AnxA1可能與AIH的發(fā)病機(jī)制及病情發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，AIH模型小鼠肝臟組織中AnxA1 mRNA以及蛋白的表達(dá)水平均明顯增加，且與肝臟炎癥損傷存在相關(guān)性，AnxA1可能在AIH的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。AIH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，AnxA1在AIH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到的作用機(jī)制、特點(diǎn)、與炎癥因子的相互作用等需要進(jìn)行更深層次的研究。