下調(diào)HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、周期及侵襲能力的影響

葉惠榮，張玉娟，曹茵，王西躍，吳麗華，陳桂林，陳麗娟，袁惠玲

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TN‐BC）病人雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表達(dá)均為陰性，約占乳腺癌的17%。TN‐BC因缺少PR、ER、HER2的表達(dá)，不能接受分泌治療和抗HER2治療的手段，目前臨床上主要依賴(lài)化療，但其乳腺癌細(xì)胞具有強(qiáng)轉(zhuǎn)移和侵襲能力，導(dǎo)致相對(duì)其它類(lèi)型乳腺癌，TNBC整體預(yù)后仍差。由于缺乏明確的治療靶點(diǎn)，因此越來(lái)越多學(xué)者關(guān)注TNBC治療靶點(diǎn)的研究。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long Non-coding RNA，lncRNA）長(zhǎng)度一般為200個(gè)核苷酸序列，不編碼蛋白質(zhì)，在X染色體滅活、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控、MicroRNA活性、表觀(guān)基因調(diào)節(jié)等生物過(guò)程均發(fā)揮重要作用。lncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX Transcript Antisense RNA，HO‐TAIR）能夠通過(guò)反式作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在TNBC組織中表達(dá)水平升高，與TNBC的臨床病理分期相關(guān)。但HOTAIR對(duì)TNBC細(xì)胞調(diào)控機(jī)制尚不清楚，本研究自2019年2—7月以TNBC細(xì)胞MDA-MB-231為模型，探究下調(diào)HO‐TAIR表達(dá)水平對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、周期及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基（貨號(hào)：C11875500BT）、胎牛血清（FBS）（貨號(hào)：10091-148）均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（貨號(hào)11668019）購(gòu)自武漢科昊佳生物科技有限公司；陰性對(duì)照si-Control、si-HOTAIR由上海吉瑪公司合成；兔抗人c-myc（貨號(hào)BS94081）、兔抗人Ki-67（貨號(hào)BS90768）、兔抗人PCNA（貨號(hào)BS6438）、兔抗人MMP-9（貨號(hào)BS6893）、兔抗人MMP-2（貨號(hào)BS72289）、兔抗人內(nèi)參β-Actin（貨號(hào)：AP0060）均購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；羊抗兔二抗（貨號(hào)31466）購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；RNA提取試劑Trizol（貨號(hào)15596026）購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄-PCR試劑盒（貨號(hào)DRR042A）購(gòu)自南京賽鴻瑞生物科技有限公司；FC 500系列流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞系：正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A、TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231購(gòu)自南京安研生物科技有限公司。MCF-10A細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞在相對(duì)濕度98%、5%二氧化碳、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有1%青鏈霉素雙抗、10%FBS的1640培養(yǎng)基，待細(xì)胞單層平鋪培養(yǎng)瓶約80%時(shí)胰酶消化傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、si-陰性對(duì)照組、si-HOTAIR組。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操 作 將si-HOTAIR（5'-GAACGGGAGUACAGAGA‐GAUU-3'）和陰性對(duì)照si-Control（5'-TTCTCCGAAC‐GTGTCACGT-3'）轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)48 h后用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞HOTAIR表達(dá)水平 使用RNA提取試劑Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，嚴(yán)格按照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將cDNA稀釋至25 ng/mL，然后加入到反應(yīng)體系中，使用PCR儀對(duì)HOTAIR進(jìn)行擴(kuò)增。HOTAIR正向引物序列：5’-GGGTGTTGGTCTGTGGAACT-3’，反向引物序列：5’-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3’；內(nèi)參GAP‐DH正 向 引 物 序 列：5’-CTTTGGTATCGTG‐GAAGGACTC-3’，反 向 引 物 序 列：5’-CAGT‐GGGGAACTCTGACTCG-3’，反應(yīng)條件：首先在94℃條件下預(yù)變性300 s，隨后94℃條件下變性30 s，65℃退火1 min，最后在60℃條件下延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，60℃終末延伸5 min。各組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，采用2法對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞HOTAIR表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.4 MTT法測(cè)定MDA-MB-231細(xì)胞活性 將細(xì)胞以1×10個(gè)/孔接種到96孔板上，實(shí)驗(yàn)分組同“1.2”，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入不含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后加入25μL MTT（5 mg/mL）溶液，孵育4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150μL DMSO溶液，100 r/min 37℃恒溫震蕩10 min，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在570nm處吸光度（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD-空白組OD）×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定MDA-MB-231細(xì)胞周期 收集MDA-MB-231細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組同“1.2”，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，離心后用預(yù)冷的PBS清洗3次，之后將細(xì)胞置于4℃70%乙醇中固定0.5 h，用預(yù)冷的PBS清洗3次，最后將細(xì)胞重懸于含有100μg RNaseA和40μg PI的PBS中，25℃避光孵育0.5 h，用流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel膠從-20℃冰箱中取出，4℃環(huán)境中過(guò)夜解凍，用1640培養(yǎng)液稀釋至200μL/mL，之后涂抹到transwell板的濾膜上面（200μL/cm），37℃放置3 h，取出后在超凈臺(tái)上干燥過(guò)夜。按照“1.2”實(shí)驗(yàn)分組處理，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞以1×10個(gè)/孔接種到上室，同時(shí)下室加入600μL不含細(xì)胞的培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換上室培養(yǎng)液，然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用棉簽輕輕擦去Matri‐gel和上室內(nèi)細(xì)胞，甲醇固定5 min，然后用PBS清洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS清洗3次后顯微鏡下拍照，每組隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值。

1.7 蛋 白 印 跡 法（western blotting，WB）測(cè) 定MDA-MB-231細(xì)胞c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平 使用RIPA法提取各組細(xì)胞蛋白并測(cè)定總蛋白含量，垂直電泳法分離所需目標(biāo)蛋白，用BIO-RAD法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA將結(jié)合位點(diǎn)封閉1 h。加入兔抗人c-myc、兔抗人Ki-67、兔抗人PCNA、兔抗人MMP-9、兔抗人MMP-2、兔抗人內(nèi)參β-Actin（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，加入羊抗兔二抗（1∶1 000），PBS清洗3次，37℃孵育0.5 h，PBS清洗3次，顯色、曝光、凝膠成像設(shè)備觀(guān)察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS22.0版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組比較行單因素方差分析，兩組均數(shù)相比行snk-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MDA-MB-231細(xì)胞HOTAIR表達(dá)水平比較 與MCF-10A細(xì)胞組（1.06±0.13）相比，對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞HOTAIR基礎(chǔ)表達(dá)水平（1.85±0.21）升高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，si-HOTAIR組HOTAIR表達(dá)水平（1.34±0.15）降低（P＜0.05），si-陰性對(duì)照組（1.80±0.31），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組MDA-MB-231細(xì)胞活性比較 與對(duì)照組（102.64±3.29）%相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞活性（98.04±6.28）%降低（P＜0.05），si-陰性對(duì)照組（81.93±5.87）%無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 各組MDA-MB-231細(xì)胞周期比較 與對(duì)照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞G0/G1期下調(diào)，主要阻滯在G2/M期，si-陰性對(duì)照組無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖1。

圖1 MDA-MB-231細(xì)胞周期：A為對(duì)照組；B為si-陰性對(duì)照組；C為si-HOTAIR組

2.4 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力比較 與對(duì)照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞通過(guò)Matrigel到達(dá)濾膜底層的細(xì)胞數(shù)A明顯減少［（35.66±8.04）個(gè)比（125.92±13.55）個(gè)，P＜0.05］，si-陰性對(duì)照組［（128.17±16.53）個(gè)］，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 各組MDA-MB-231細(xì)胞中c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平比較 與對(duì)照組、si-陰性對(duì)照組相比，si-HOTAIR組c-myc、Ki-67、PC‐NA、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平降低（P＜0.05），si-陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2和表1。

圖2 MDA-MB-231細(xì)胞中c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平

3 討論

TNBC相比其它類(lèi)型乳腺癌，治療及預(yù)后、基因表型和生物學(xué)行為有明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)TNBC病人3～5年期間生存率較低，10年后復(fù)發(fā)率與其它乳腺癌病人相當(dāng)。因此，盡管TNBC侵襲性能力強(qiáng)，預(yù)后差，但如能找到合適的治療靶點(diǎn)，TNBC仍有望臨床治愈。

近幾年，HOTAIR在乳腺癌組織中異常表達(dá)受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在TNBC病人外周血清和癌組織中表達(dá)水平升高，且在轉(zhuǎn)移性TNBC病人中尤其高。乳腺癌組織中HOTAIR高表達(dá)，上調(diào)MCF-7細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)水平后，細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，提示HOTAIR高表達(dá)有助于提高乳腺癌細(xì)胞侵襲能力。李苗等構(gòu)建MDA-MB-231細(xì)胞三維培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)RNA-HO‐TAIR表達(dá)水平升高。本研究證實(shí)，與MCF-10A細(xì)胞組相比，MDA-MB-231細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)水平升高，說(shuō)明在MDA-MB-231細(xì)胞中HOTAIR高表達(dá)，提示HOTAIR可能與TNBC有關(guān)。Liu等研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在肺癌組織和細(xì)胞系中的高表達(dá)，敲除CAV-1后能夠下調(diào)HOTAIR表達(dá)水平，抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲，提示HOTAIR有望成為治療肺癌的新靶點(diǎn)。朱意等研究表明lncRNA-HOTAIR在前列腺癌癌組織中高表達(dá)，與前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲能力有關(guān)，使細(xì)胞G2期阻滯，G1期的下調(diào)。另有研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR-siRNA組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖水平、侵襲能力與遷移能力低于對(duì)照組和陰性對(duì)照組，提示lncRNA-HOTAIR參與子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移侵襲進(jìn)程。本研究表明，與對(duì)照組、si-陰性對(duì)照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞活性、侵襲能力降低，細(xì)胞G0/G1期下調(diào)，主要阻滯在G2/M期，說(shuō)明下調(diào)HOTAIR表達(dá)水平可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、降低侵襲能力，提示HO‐TAIR可能成為治療TNBC的新靶點(diǎn)。

表1 MDA-MB-231細(xì)胞中c-myc、Ki-67、PCNA、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）表達(dá)水平/x±s

c-myc作為位于細(xì)胞核的原癌基因，具有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等作用，研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)抑制cmyc蛋白表達(dá)，可抑制TNBC細(xì)胞增殖。Ki-67蛋白具有200多個(gè)磷酸化部位，易受到相關(guān)蛋白酶作用，Ki-67蛋白是癌細(xì)胞增殖過(guò)程中必需的結(jié)合蛋白，是臨床上常用評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖標(biāo)志物。PCNA在細(xì)胞核特異性表達(dá)，與細(xì)胞增殖活性相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，抑制PCNA蛋白表達(dá)水平，能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖。本研究表明，與對(duì)照組、si-陰性對(duì)照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞中c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明下調(diào)HOTAIR表達(dá)水平可能抑制c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)，提示下調(diào)HOTAIR可能通過(guò)降低c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)水平而抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移，研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p能夠通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移。楊彧、付雯研究發(fā)現(xiàn)TAGLN基因過(guò)表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。本研究表明，與對(duì)照組、si-陰性對(duì)照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平可能受HOTAIR調(diào)控，提示下調(diào)HO‐TAIR水平使MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力下降可能通過(guò)抑制MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，HOTAIR在MDA-MB-231細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)HOTAIR表達(dá)水平可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、降低細(xì)胞侵襲能力。但是具體通過(guò)調(diào)控哪種信號(hào)通路影響MDA-MB-231細(xì)胞還有待進(jìn)一步研究。