長鏈非編碼RNA linc 00261通過競爭性結合微小RNA-182調(diào)控RND3基因參與卵巢癌癌細胞的生物學行為研究

陳達書，蔣倩穎

卵巢癌是最致命的女性婦科惡性腫瘤之一，具有死亡率高、預后差和發(fā)病隱匿的特點。目前對于卵巢癌的治療主要包括放化療和手術切除病灶。隨著醫(yī)學的發(fā)展，卵巢癌的治療效果有所提升，但總體生存率并不樂觀。卵巢癌發(fā)生和發(fā)展的機制十分復雜，這可能是導致卵巢癌的生存率低，預后差的主要原因。因此，探究并完善卵巢癌的發(fā)病機制，有利于提高患者生存率和臨床療效。

IncRNA（Long non-coding RNAs）是長度大于200 nt的非編碼RNA的一種。IncRNA廣泛參與生命活動的調(diào)節(jié)，目前主要在腫瘤學領域被廣泛研究，是當前研究的熱點之一。linc 00261屬于In‐cRNA成員之一，目前已有研究表明linc 00261在喉鱗狀細胞癌中表達上調(diào)，但在結腸癌、卵巢癌、胃癌等惡性腫瘤中表達下調(diào)。在腫瘤學中，IncRNA常作為海綿體，通過競爭性結合MicroRNA，從而調(diào)控腫瘤增殖、遷移、侵襲和凋亡等過程。我們通過RNA22預測到linc 00261與miR-182之間存在結合位點。微小RNA-182（miR-182）屬于microRNA家族成員之一，是一種致癌基因。目前已有多項研究表明miR-182在三陰性乳腺癌、肺癌、結腸癌以及上皮性卵巢癌中表達升高，其具有促進腫瘤體內(nèi)生長的作用。但目前尚無文獻表明在卵巢癌中l(wèi)inc 00261是否會通過競爭性結合miR-182，進而影響卵巢癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲也尚未明確。同時我們進一步通過RNA22網(wǎng)站篩選發(fā)現(xiàn)miR-182與RND3存在結合位點，且在過往研究中有報道m(xù)iR-182和RND3具有調(diào)控關系。RND3是Rho家族GTP酶家族成員之一，有研究表明RND3的過表達有利于肝癌、乳腺癌患者的預后，且RND3抑制多種癌細胞的增殖遷移和侵襲。但RND3是否作為一個廣譜性的抑癌因子，抑制癌癥的發(fā)展系目前尚無文獻證實。

本研自2019年11月至2020年3月通過培養(yǎng)卵巢癌細胞系，并進行相應的轉染，旨在探究明linc 00261與miR-182之間是否通過競爭性結合關系，影響卵巢癌細胞的凋亡，miR-182與RND3是否存在靶向調(diào)控關系以及RND3對卵巢癌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞處理及分組

人卵巢表面上皮細胞系IOSE80和4株卵巢癌細胞系SKOV3、HO8910、A2780和OVCAR（購于ATCC），用含10%胎牛血清（10100139C，Gibco，USA）、鏈霉素（100 mg/mL）和青霉素（100 U/mL）的DMEM細胞培養(yǎng)液（11965092，Gibco，USA）將細胞培養(yǎng)于37℃、含5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中。根據(jù)細胞生長情況，融合率達到85%以上進行傳代培養(yǎng)。

收集對數(shù)期細胞，計數(shù)后將細胞按每孔1×10個接種于6孔板，37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h后，在細胞融合度達到了75%左右，按照Lipo‐fectamine 2000（11668-019，Invitrogen，New York，California，USA）說明書進行細胞轉染。表達質粒購自上海吉瑪生物公司，質粒使用濃度為50 ng/mL，各組在37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)6～8 h后，換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，進行后續(xù)實驗。分組1：mimic NC（轉染mimic對照序列）、miR-182 mimic（轉染miR-182 mimic序列）；分組2：pcDNA-NC組（轉染pcDNA空載體）、pcDNA-linc 00261組（轉染過表達linc 00261載體）、NCinhibitor組（轉染inhibitor對照序列）、miR-182 inhibitor組（轉染miR-182 inhibitor序列）、pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組（轉染過表達linc 00261載體+miR-182 mimic序列）、pcD‐NA-linc 00261+si-RND3組（轉染過表達linc 00261載體+si-RND3序列）。

1.2 雙熒光素酶實驗

為構建熒光素酶報告載體，將含有miR-182結合位點的RND3-3’UTR片段和linc 00261 cDNA片段插入到pGL3質粒中。通過點突變方法，構建結合位點突變的RND3-3′UTR-MUT片段和linc 00261-MUT片段插入到pGL 3質粒中，并經(jīng)測序驗證插入序列正確。采用脂質體轉染方法，將pGL3-linc 00261、pGL3-linc 00261-MUT、pGL3-RND3-3’UTR、pGL3-RND3-3’UTR-MUT重組載體和Rellina內(nèi)參質粒分別與NC mimic或miR-182 mimic或共轉染入HEK293T細胞，轉染48 h后收集并裂解細胞，使用熒光素酶檢測試劑盒（K801-200，Biovision公司），熒光素酶報告基因檢測采用雙熒光酶報告基因分析系統(tǒng)（Promega，Madison，WI，USA）。海腎熒光素酶作為內(nèi)參基因，根據(jù)螢火蟲熒光素酶測定值RLU除以海腎熒光素酶測定值RLU所得到的比值來比較目的報告基因的激活程度。實驗重復3次。

1.3 CCK8檢測細胞增殖

采用CCK8檢測試劑盒（AC11L053，上海李記生物科技有限公司）檢測細胞活力。96孔板中以5×10/well密度接種100μL細胞懸液，在接種后的第24、48、72 h，每孔加入10μL CCK8溶液，輕柔混勻，不能產(chǎn)生氣泡，在37℃、5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱反應4 h后，用酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）測定各孔在450 nm處的吸光值。實驗重復3次。

1.4 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

遷移實驗：消化細胞，無血清培養(yǎng)基洗3次，計數(shù)，制成細胞懸液接種1×10個/毫升細胞懸液于上室，上室為無血清培養(yǎng)基，含10%FBS培養(yǎng)基加入下室，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室PBS沖洗2次每次5 min，5%戊二醛4℃固定，加0.1%結晶紫染色30 min，PBS沖洗2次每次5 min，擦凈，境下觀察。各組穿過基質膠的細胞數(shù)多少作為評價其遷移能力的指標，實驗重復3次。

侵襲實驗：細胞轉染48 h后，Matrigel基質膠（貨號356234，BD公司，USA）4℃處理過夜，按1∶3用無血清培養(yǎng)基將其稀釋，在Transwell小室的上室內(nèi)每孔加入50μL，培養(yǎng)孵箱中靜置30 min。收集細胞，無血清培養(yǎng)基重懸，無血清培養(yǎng)基洗Matrigel 1次，接種1×10個/毫升細胞懸液于上室，含10%FBS培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h，將Transwell小室用PBS沖洗2次，每次5 min，5%戊二醛4℃固定后，用0.1%結晶紫染色30 min，PBS沖洗2次，每次5 min，擦干凈，鏡下觀察并計數(shù)。各組穿過基質膠的細胞數(shù)多少作為評價其侵襲能力的指標，實驗重復3次。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率

Annexin VFITC/PI雙標染色檢測細胞凋亡，將處理好的細胞置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞，PBS溶液洗滌2次后離心將細胞重懸于200μL結合緩沖液中，加入10μL Annexin V-FITC（ab14085，Abcam，Inc，MA，USA）和5μL PI輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300μL結合緩沖液，用流式細胞儀以激發(fā)波長488 nm檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.6 RIP實驗

采用RIP試劑盒（millipore，USA）檢測linc 00261與AGO2蛋白結合情況。冷PBS洗卵巢癌細胞2次，收集細胞。等體積的RIPA裂解液（P0013B，碧云天）重懸細胞，冰上靜置5 min，14 000 r/min，4℃離心10 min取上清。細胞提取液一部分取出作為input，一部分與抗體孵育進行共沉淀，具體步驟為：每一個共沉淀反應體系取50μL磁珠清洗后重懸于100μL RIP Wash Buffer中加入5 μg抗體AGO2（ab32381，1∶50，Abcam，UK），IgG（1∶100，ab109489，Abcam，UK）孵育。磁珠-抗體復合物經(jīng)清洗后與重懸于900μL RIP Wash Buffer，加入100μL細胞提取液4℃孵育過夜。樣品置于磁座上收集磁珠-蛋白復合物。樣品經(jīng)蛋白酶K消化后提取RNA，qRT-PCR檢測linc 00261表達水平。

1.7 RNA pull-down

卵巢癌細胞分別轉染W(wǎng)T生物素化的和MUT生物素化的miR-182（各50 nmol/L）。轉染48 h后，收集細胞并用PBS洗滌，渦旋。然后，用特定的細胞裂解液（Ambion，Austin，Texas，USA）孵育10 min。將裂解物與預涂了RNase-free和酵母tRNA（購自Sigma，St.Louis，MO，USA）的M-280鏈霉親和素磁珠（購自Sigma，St.Louis，MO，USA）一起孵育。4℃條件下孵育3 h，然后用冷裂解液洗滌兩次，用低鹽緩沖液和高鹽緩沖液分別洗3次和1次，結合的RNA通過Trizol純化，qRT-PCR檢測linc 00261表達水平。

1.8 蛋白質印跡法（Western Blot，WB）檢測

收集細胞，棄上清，用含有蛋白酶抑制劑的增強型RI‐PA裂解液（武漢博士徳公司）進行裂解，然后用BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士徳公司）進行蛋白濃度的測定。蛋白溶于2×SDS上用10%SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS沖洗2 min，將PVDF膜與稀釋的一抗RND3（1∶1 000，ab171799，abcam，Cambridge，UK），Bax（1∶2 000，ab32503，abcam，Cambridge，UK），Bcl-2（1∶1 000，ab32124，abcam，Cambridge，UK），GAPDH（1∶2 000，ab 9485，abcam，Cambridge，UK）4℃過夜，TBST洗滌3次每次5 min，1∶100稀釋的HRP標記二抗羊抗鼠IgG抗體（ab205719；1∶2 000；Abcam，Cambridge，UK）孵 育1 h。室 溫 下 膜 與ECL液（ECL808-25，Biomiga，USA）反應1 min。吸去液體，覆蓋保鮮膜，然放上X-ray film曝光5～10 min后進行顯影和定影。用Image J分析軟件對Western blot圖像中各組條帶進行灰度定量，GAPDH作為內(nèi)參。每次實驗重復3次。

1.9 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測

使用Trizol試劑盒（15596026，Invitrogen，Car，Cal，USA）提取細胞總RNA，按照PrimeScript RT re‐agent Kit（RR047A，Takara，Japan）說明書將總的RNA反轉錄成cDNA，對合成的cDNA用Fast SYBR Green PCR試 劑 盒（Applied biosystems）與ABI PRISM 7300 RT-PCR系統(tǒng)（Applied biosystems）進行qRT-PCR檢測，每個孔均設置3個重復。本實驗中用U6作為miR-182的內(nèi)參，GAPDH作為其他基因的內(nèi)參，采用相對定量法（2法）計算linc 00261、miR-182盒RND3的相對轉錄水平：ΔΔCt=ΔCt－ΔCt，ΔCt=Ct－Ct，目的基因的相對轉錄水平=2。每次實驗重復3次。引物設計如表1所示。

表1 引物序列

2 結果

2.1 卵巢癌細胞中長鏈非編碼RNA linc 00261呈低表達，而miR-182呈高表達

qRTPCR檢測人卵巢表面上皮細胞株IOSE80和4株卵巢癌細胞株SKOV3、HO8910、OVCAR和A2780中l(wèi)inc 00261和miR-182的表達，結果顯示：與人卵巢表面上皮細胞株IOSE80（1.00±0.11）相比，4株卵巢癌細胞SKOV3（0.25±0.04）、HO8910（0.71±0.08）、A2780（0.53±0.07）和OVCAR（0.36±0.05）中l(wèi)inc 00261的表達顯著降低，而miR-182的表達在SKOV3（3.46±0.42）、HO8910（2.07±0.21）、A2780（2.79±0.31）和OVCAR（2.98±0.32）中均顯著增加（均P＜0.05），其中SKOV3中l(wèi)inc 00261的表達最低，選為后續(xù)細胞學實驗驗證的細胞。

2.2 在卵巢癌細胞中l(wèi)inc 00261競爭性結合miR-182

運用RNA22預測了linc 00261和miR-182的結合位點（圖1），linc 00261序列與miR-182序列間存在特異結合區(qū)域。雙熒光素酶報告：與NCmimic組（1.00±0.12）比較，miR-182 mimic組中l(wèi)inc 00261野生型與miR-182特異結合區(qū)域的熒光素酶活性受到顯著抑制（0.34±0.04），P＜0.001，而linc 00261突變型的熒光素酶活性無明顯的變化，說明linc 00261能特異性結合miR-182。

RNA-pull down實驗示，與MUT-miR-182（1.00±0.13）和Bio-NC組（1.23±0.15）相比，WT-miR-182結合的linc 00261明顯增加（14.36±1.32），P＜0.001，表明miR-182和linc 00261可直接結合。RNA免疫共沉淀（RIP）實驗，檢測CNE-1細胞內(nèi)linc 00261是否與AGO2蛋白直接相互作用。結果顯示在SKOV3細胞內(nèi)，抗AGO2的抗體可以將linc 00261沉淀下來，表明linc 00261可以與AGO2形成復合物，可競爭性結合miR-182。

圖1 RNA22預測了linc 00261和miR-182的結合位點

2.3 miR-182靶向調(diào)控RND3

qRT-PCR和WB分別檢測人卵巢表面上皮細胞株IOSE80和4株卵巢癌細胞株SKOV3、HO8910、OVCAR和A2780中RND3 mRNA和蛋白的表達，結果顯示：與人卵巢表面上皮細胞株IOSE80（1.00±0.11）相比，4株卵巢癌細 胞SKOV3（0.37±0.04）、HO8910（0.69±0.07）、A2780（0.78±0.09）和OVCAR（0.35±0.05）中RND3 mRNA表達量均明顯降低。與人卵巢表面上皮細胞株IOSE80（0.86±0.11）相比，4株卵巢癌細胞SKOV3（0.25±0.03）、HO8910（0.52±0.05）、A2780（0.47±0.05）和OVCAR（0.27±0.03）中RND3蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05）。

運用RNA22預測了miR-182和RND3的結合位點（圖2），雙熒光素酶報告顯示：與NC mimic組（1.00±0.13）比較，miR-182 mimic轉染組RND3野生型3'UTR的熒光素酶活性（0.28±0.03）明顯收到抑制（P＜0.05），而突變型3'UTR的熒光素酶活性變化無明顯差別（P＞0.05），以上結果說明miR-182能靶向抑制RND3基因。

上述結果表明，在卵巢癌中l(wèi)inc 00261可能通過競爭性結合miR-182從而調(diào)控RND3基因的表達。

圖2 RNA22預測了linc 00261和miR-182的結合位點

2.4 過表達linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細胞增殖

在卵巢癌細胞SKOV3中，我們通過過表達linc 00261或者沉默miR-182，以及在過表達linc 00261的基礎上過表達miR-182或者沉默RND3基因，來研究linc 00261可能通過競爭性結合miR-182從而調(diào)控RND3，對卵巢癌細胞生物學活性的影響。

CCK8檢測各組細胞增殖情況，結果表明：與pcDNA-NC組（0.46±0.05）、（0.87±0.09）相比，pcD‐NA-linc 00261組卵巢癌細胞SKOV3的增殖能力在48 h和72 h時顯著下降（0.30±0.04）、（0.49±0.06）；與NC inhibitor（0.47±0.04）、（0.91±0.11）相比，miR-182 inhibitor卵巢癌細胞SKOV3的增殖能力在48 h和72 h時顯著下降（0.27±0.03）、（0.27±0.03）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組（0.45±0.03）、（0.82±0.09）和pcDNAlinc 00261+si-RND3組（0.44±0.03）、（0.90±0.09）卵巢癌細胞SKOV3的增殖能力在48 h和72 h時顯著增加（均P＜0.05）。以上結果表明過表達linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細胞增殖，而miR-182的過表達或RND3的沉默可以逆轉linc 00261過表達對卵巢癌細胞增殖的抑制作用。?

2.5 過表達linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細胞遷移能力

Transwell實驗檢測各組細胞遷移能力，結果表明（圖3）：與pcDNA-NC組（117.40±16.30）相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細胞SKOV3的 遷 移 能 力（73.4±8.9）顯 著 下 降（P=0.017）；與NC inhibitor（124.30±14.50）相 比，miR-182 inhibitor卵巢癌細胞SKOV3的遷移能力（68.40±7.80）顯著下降（P=0.003）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組（118.30±13.90）和pcDNA-linc 00261+si-RND3組（125.4±16.9）卵巢癌細胞SKOV3的遷移能力顯著增加（均P＜0.05）。以上結果表明過表達linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢6 癌細胞7遷 移，而8miR-182的過表達或RND3的沉默可以逆轉linc 00261過表達對卵巢癌細胞遷移能力的抑制。

圖3 Transwell實驗檢測各組SKOV3細胞遷移能力（×200）：A為pcDNA-NC組；B為pcDNA-linc 00261組；C為NCinhibitor組；D為miR-182 inhibitor組；E為pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組；F為pcDNA-linc 00261+si-RND3組

2.6 過表達linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細胞侵襲能力

Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力，結果表明（圖4）：與pcDNA-NC組（75.20±8.90）相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細胞SKOV3的侵襲能力（42.30±4.50）明顯降低（P=0.003）；與NC inhibitor（79.20±9.30）相比，miR-182 inhibitor卵巢癌細胞SKOV3的侵襲能力（47.30±6.30）明顯降低（P=0.004）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNAlinc 00261+miR-182 mimic組（76.30±8.30）和pcD‐NA-linc 00261+si-RND3組（81.40±9.30）卵巢癌細胞SKOV3的侵襲能力顯著增加（均P＜0.05）。以上結果表明過表達linc 00261或沉默miR-182抑制卵巢癌細胞侵襲，而miR-182的過表達或RND3的沉默可以逆轉linc 00261過表達對卵巢癌細胞侵襲能力的抑制。

圖4 Transwell實驗檢測各組SKOV3細胞侵襲能力（×200）：A為pcDNA-NC組；B為pcDNA-linc 00261組；C為NCinhibitor組；D為miR-182 inhibitor組；E為pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組；F為pcDNA-linc 00261+si-RND3組

2.7 過表達linc 00261或沉默miR-182促進卵巢癌凋亡

流式細胞術實驗檢測各組細胞凋亡情況，結果表明（圖5）：與pcDNA-NC組（8.20±0.90）相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細胞SKOV3的凋亡率（32.30±3.20）明顯上調(diào)（P＜0.05）；與NC inhibitor（9.40±1.20）相 比，miR-182 inhibitor卵 巢 癌 細 胞SKOV3的 凋 亡 率（30.50±2.70）明 顯 增 加（P＜0.001）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組（10.20±1.20）和pcDNAlinc 00261+si-RND3組（11.30±1.50）卵巢癌細胞SKOV3凋亡率顯著下降（P＜0.05）。以上結果表明過表達linc 00261或沉默miR-182促進卵巢癌細胞凋亡，而miR-182的過表達或RND3的沉默可以逆轉linc 00261過表達對卵巢癌細胞凋亡的促進作用。

圖5 流式細胞術檢測各組SKOV3細胞凋亡圖：A為pcDNA-NC組；B為pcDNA-linc 00261組；C為NCinhibitor組；D為miR-182 inhibi‐tor組；E為pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組；F為pcDNA-linc 00261+si-RND3組

2.8 linc 00261競爭性結合miR-182調(diào)控RND3基因參與卵巢癌癌細胞的凋亡

qRT-PCR檢測linc 00261、miR-182和RND3 mRNA的表達，結果顯示：與pcDNA-NC組相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細胞中l(wèi)inc 00261（3.24±0.35）和RND3 mRNA（2.36±0.28）表達顯著增加，miR-182（0.39±0.04）表達顯著減少（均P＜0.05）；與NCinhibitor相比，miR-182 in‐hibitor組卵巢癌細胞SKOV3中l(wèi)inc 00261表達（0.98±0.11）無顯著變化（P=0.969），miR-182表達（0.36±0.04）顯著減少，RND3 mRNA表達（2.56±0.32）顯著增加（均P＜0.05）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組卵巢癌細胞SKOV3中l(wèi)inc 00261表達（3.17±0.31）無顯著變化（P=0.997），miR-182表達（1.16±0.13）顯著增加，RND3 mRNA表達（0.92±0.11）顯著減少（均P＜0.05）；與pcDNA-linc 00261組 相 比，pcDNA-linc 00261+si-RND3組卵巢癌細胞linc 00261（3.29±0.33）和miR-182（0.42±0.05）變化差異無統(tǒng)計學意義（P=0.999），RND3 mRNA表達（0.89±0.09）顯著減少（P＜0.001）。

WB檢測RND3和凋亡相關因子Bax，Bcl-2蛋白表達，結果顯示：與pcDNA-NC組相比，pcDNA-linc 00261組卵巢癌細胞SKOV3中RND3（0.58±0.07）和Bax（0.52±0.06）蛋白表達顯著增多（P＜0.01），而Bcl-2蛋白表達量（0.15±0.02）明顯降低（P＜0.001）；與NC inhibitor相比，miR-182 inhibitor卵巢癌細胞SKOV3中RND3（0.61±0.07）和Bax蛋白表達（0.58±0.06）顯著增加，而Bcl-2蛋白表達（0.18±0.03）顯著減少（均P＜0.05）；與pcDNA-linc 00261組相比，pcDNA-linc 00261+miR-182 mimic組和pcDNAlinc 00261+si-RND3組卵巢癌細胞RND3（0.30±0.04）、（0.32±0.04）和Bax蛋白表達（0.21±0.03）、（0.22±0.03）顯著減少，而Bcl-2蛋白表達（0.52±0.05）、（0.54±0.06）顯著增多（均P＜0.05）。

以上結果表明linc 00261通過競爭性結合miR-182，從而調(diào)控RND3基因，進而促進卵巢癌癌細胞的凋亡。

3 討論

卵巢癌是婦科癌癥中死亡率的重要惡性腫瘤之一，患者主要群體為年齡大于65歲的女性。到目前為止，每年全球有超過20萬女性被確診卵巢癌，但卵巢癌的生存率不到35%。且由于卵巢癌隱匿性強，在癌癥早期不易被診斷，從而導致患者預后生存差。探究卵巢癌的發(fā)病機制，為早期卵巢癌確診與后續(xù)治療均具有非常重要的指導意義。

IncRNA和microRNA均為非編碼RNA，由于其調(diào)控廣泛，且在生物中大量存在，因此是目前腫瘤學等領域的重要研究熱點。linc 00261在大部分癌癥中表達下調(diào)。Shandy Shahabi等研究表明，linc 00261在肝癌、乳腺癌以及胃癌中發(fā)生缺失，可通過激活腫瘤細胞中的DNA損傷機制，進而抑制癌細胞增殖、遷移和細胞周期進程。Jingli Shi等研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌中，低表達linc 00261存在不良預后。linc 00261過表達后抑制非小細胞肺癌增殖和侵襲，促進其凋亡。linc 00261可作為海綿體，競爭性結合miR-522-3p，從而調(diào)控非小細胞肺癌增殖、侵襲以及凋亡。還有研究表明linc 00261在子宮內(nèi)膜癌中表達下調(diào)，且可通過競爭性結合miR-182、miR-183、miR-153、miR-27a和miR-96等mi‐croRNA，進而抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移和侵襲。有研究表明，miR-182在肺鱗狀細胞癌中存在異常表達，可能作為肺鱗狀細胞癌的標志物或治療靶點。此外，有研究認為miR-182在結直腸癌、乳腺癌中均可作為標志物或治療靶點。這提示miR-182可能在癌細胞中發(fā)揮促癌作用。在本研究中，我們進一步證實linc 00261在卵巢癌中表達下調(diào)，且經(jīng)過雙熒光素酶等實驗證實linc 00261可作為海綿體，競爭性結合miR-182，進而促進卵巢癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲。

在腫瘤中，microRNA通常通過靶向調(diào)控下游靶基因，進而影響細胞的生物學特性。在本研究中，我們通過RNA22篩選發(fā)現(xiàn)miR-182與RND3之間存在結合位點。RND3作為Rho家族GTP酶家族成員之一，在腫瘤學領域研究較多，但尚無研究表明RND3對卵巢癌的影響。RND3參與細胞有絲分裂調(diào)控，對細胞增殖具有負向調(diào)控作用。在鼻咽癌中，RND3表達下調(diào)后，加速了鼻咽癌細胞遷移和侵襲。為探究在卵巢癌中，miR-182是否會通過靶向調(diào)控RND3，進而調(diào)控卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡。我們通過雙熒光素酶報告證實miR-182可靶向調(diào)控RND3的表達，且RND3沉默后，可阻斷l(xiāng)inc 00261對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，以及對細胞凋亡的促進作用。

綜上所述，在本研究中我們通過一系列實驗，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中l(wèi)inc 00261可通過競爭性結合miR-182，從而促進其靶基因RND3的表達，進而抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。提示miR-182可作為卵巢癌的標志物和治療靶點。通過本研究，我們證實了linc 00261、miR-182和RND3在卵巢癌中的表達，以及三者的調(diào)控關系。但本研究目前僅限于體外實驗，我們?nèi)孕柽M行體內(nèi)實驗進一步驗證以上機制。并通過更多的實驗探究，并確認最終能否用于臨床檢驗診斷與靶向治療。