紫花前胡苷抗宮頸癌細(xì)胞作用研究

付瓊，殷金鳳，顏愛華

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)生率僅次于乳腺癌。有研究統(tǒng)計顯示，2018年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例累計569 847例，死亡病例累計311 365例，發(fā)病率在女性腫瘤中的占比高達(dá)6.6%?；谌蚣膊∝?fù)擔(dān)數(shù)據(jù)的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌在不同地區(qū)或國家中的發(fā)病率存在差異，發(fā)展中國家的宮頸癌患者死亡率是發(fā)達(dá)國家的18倍左右，占所有宮頸癌相關(guān)死亡人數(shù)的85%，嚴(yán)重危害女性健康。宮頸癌的發(fā)生同人乳頭瘤病毒（hu‐man papilloma virus，HPV）的感染明顯相關(guān)，近些年隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步、HPV疫苗的普及以及篩查的普及，宮頸癌的發(fā)生及死亡率有所下降，但是在發(fā)展中國家仍是威脅女性健康的隱形殺手。宮頸癌的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，多致病因素、多基因調(diào)控共同參與了其發(fā)生發(fā)展。宮頸細(xì)胞增殖凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，宮頸組織中原癌基因的過度激活以及抑癌基因的異常表達(dá)是癌癥進(jìn)展的基本病理特征。

目前宮頸癌的治療手段以手術(shù)結(jié)合放化療治療為主，癌組織的切除縮減能在一定程度上改善患者的臨床癥狀、延長其生存時間，但是這些治療手段無疑都會對機(jī)體帶來創(chuàng)傷，且化療耐藥也是制約宮頸癌治療效果的關(guān)鍵因素之一，因此尋找更為安全有效的治療方式或治療藥物是保護(hù)女性健康，減輕社會負(fù)擔(dān)的重要手段。近年來，中醫(yī)藥研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)單體藥物不僅能直接抑制宮頸癌細(xì)胞的生長，還會在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)化療耐藥，具有其重要調(diào)節(jié)優(yōu)勢。紫花前胡苷是中藥紫花前胡的有效成分，是一種線型四氫呋喃型香豆素苷類化合物，具有抗炎、抗過敏、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用，在多種疾病中發(fā)揮治療功效，但其對宮頸癌的治療作用尚未有相關(guān)報道。本研究以宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對象，在不同濃度的紫花前胡苷作用后，對其凋亡、自噬等相關(guān)特性進(jìn)行檢測，初步探究紫花前胡苷對宮頸癌細(xì)胞的作用及其相關(guān)信號通路。

1 材料與方法

圖1 紫花前胡苷分子結(jié)構(gòu)圖

1.1 材料及試劑

人宮頸癌永生化HeLa細(xì)胞株購自American Type Culture Collection（Manassas，VA，USA）。HeLa細(xì)胞于含10%胎牛血清（Hyclone，澳大利亞）及1%青鏈霉素抗體（基諾生物科技有限公司）的DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone，澳大利亞）中培養(yǎng)。紫花前胡苷及對照品購自天津士蘭科技有限公司（分子結(jié)構(gòu)如圖1），凋亡試劑盒購自BD公司，LC3B腺病毒（Ad-GFP-LC3B）購自碧云天生物科技有限公司。抗體來源及配比如下：cle-caspase3（1∶1 000，absin，abs132005），Cyto C（1∶1 000，proteintech，10993-1-AP），Bax（1∶5 000，proteintech，50599-2-Ig），Bcl2（1∶2 000，proteintech，12789-1-AP），pmTOR（1∶2 000，abcam，ab109268），m-TOR（1∶2 000，abcam，ab2732），P62（1∶3 000，proteintech，18420-1-AP），Beclin1（1∶2 000，proteintech，11306-1-AP），GAPDH（1∶10 000，proteintech，60004-1-Ig）。

1.2 CCK-8法細(xì)胞增殖活性檢測

取對數(shù)期生長細(xì)胞以5 000個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后更換為含不同濃度的紫花前胡苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小心棄去培養(yǎng)基，每孔中加入配好的CCK-8溶液100μL，3副孔/組，并設(shè)置CCK-8檢測試劑空白對照組。37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1～4 h后在450 nm吸收波長處進(jìn)行OD值測量，以對照組OD值為1左右時的數(shù)值計算細(xì)胞增殖活性，計算公式為：處理組細(xì)胞增殖活力（%）=［（處理組OD值－無細(xì)胞對照孔OD值）/（對照組OD值－無細(xì)胞對照孔OD值）］×100%，每組結(jié)果由3組獨立的重復(fù)試驗組成。

1.3 凋亡檢測

將處理好的對照組及處理組細(xì)胞輕輕用PBS沖洗3次后，純胰酶消化3～5 min，完全培養(yǎng)基終止后輕輕吹打轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，800 r/min×7 min離心消化。PBS洗滌兩次后加入100μL的1×Annexin結(jié)合液，充分吹打混勻細(xì)胞后，每管分別加入5μL的Annexin-PE及AAD染液，常溫下避光孵育15 min后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。每組結(jié)果由3組獨立的重復(fù)試驗組成。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法

胰蛋白酶消化細(xì)胞收集后通過RIPA裂解液（含cocktail）裂解細(xì)胞后冰浴30 min。低溫超速離心后（4℃下12 000 r/min×10 min）提取蛋白質(zhì)上清，BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量分析。蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液后95℃金屬浴5 min，分裝后-20℃保存樣品。每次SDS-PAGE膠電泳取蛋白30微升/孔，經(jīng)10%～15%凝膠分離后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，BSA封閉后加入相應(yīng)一抗孵育過夜。第2天，TBST洗膜5 min×3次，生物素標(biāo)記的二抗常溫下孵育1 h后，BeyoECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色。結(jié)果采用Image Lab分析目的蛋白相對表達(dá)量。每組結(jié)果由3組獨立的重復(fù)試驗組成。

1.5 細(xì)胞腺病毒轉(zhuǎn)染

細(xì)胞消化混懸后進(jìn)行鋪板，使得12 h后的細(xì)胞密度達(dá)20%～30%。腺病毒Ad-GFP-LC3B轉(zhuǎn)染MOI值選擇為50。轉(zhuǎn)染24 h后觀察轉(zhuǎn)染效果并進(jìn)行換液，72 h后進(jìn)行藥物干預(yù)24 h。4%多聚甲醛固定液固定、封片于共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。每組實驗獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 紫花前胡苷可抑制HeLa細(xì)胞增殖活性并促進(jìn)凋亡

HeLa細(xì)胞在0、0.1、1、10 mmol/L濃度的紫花前胡苷作用24 h后的細(xì)胞增殖活性檢測（CCK-8法）四組細(xì)胞處理后OD450分別為1.07±0.14、0.91±0.06、0.74±0.17、0.35±0.13。與對照組（0 mmol/L）細(xì)胞相比，0.1 mmol/L濃度處理24 h后細(xì)胞增殖活性降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.383），而1 mmol/L、10 mmol/L濃度處理24 h后細(xì)胞增殖活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.038，P＜0.001）；此外，分別與0.1 mmol/L、1 mmol/L組相比，10 mmol/L濃度處理組細(xì)胞增殖活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003，P=0.027）。處理后HeLa細(xì)胞的凋亡水平如圖2所示：對照組（0 mmol/L）、0.1 mmol/L組、1 mmol/L組、10 mmol/L組的HeLa細(xì)胞凋亡率依次升高，分別 為（14.93±2.95）%、（15.43±2.13）%、（21.63±3.19）%、（31.42±5.01）%，且在10 mmol/L濃度處理下升高最為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）；此外，分別與0.1 mmol/L、1 mmol/L組相比，10 mmol/L濃度處理組細(xì)胞凋亡水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002、P=0.036）。上述結(jié)果表明，紫花前胡苷可抑制HeLa細(xì)胞增殖活性并促進(jìn)凋亡，并呈一定的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系，10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h組細(xì)胞的活力明顯下降、凋亡率明顯升高，后續(xù)實驗處理組選用條件為10 mmol/L紫花前胡苷處理24 h。

2.2 紫花前胡苷可激活HeLa細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路

10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白免疫印跡實驗，檢測紫花前胡苷處理前后HeLa細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路相關(guān)cle-caspase3、Cyto C、Bax、Bcl2的蛋白水平變化。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，紫花前胡苷處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白cle-caspase3［（0.99±0.23）比（2.21±0.23），P=0.010］、Cyto C［（0.93±0.23）比（2.60±0.32），P=0.032］、Bax［（1.05±0.17）比（0.34±0.08），P＜0.001］水平升高，抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)下降［（0.93±0.17）比（0.34±0.08），P=0.038］，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明紫花前胡苷處理后細(xì)胞內(nèi)的線粒體相關(guān)的凋亡信號通路被激活。

圖2 不同濃度的紫花前胡苷作用24 h后，CCK-8檢測不同組之間HeLa細(xì)胞活力

圖3 紫花前胡苷處理后HeLa細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路檢測

2.3 紫花前胡苷處理后HeLa細(xì)胞內(nèi)自噬信號相關(guān)蛋白上調(diào)

10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白免疫印跡實驗，檢測紫花前胡苷處理后HeLa細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)p-mTOR、mTOR、P62、Be‐clin1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的蛋白水平變化。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，紫花前胡苷處理后細(xì)胞內(nèi)pmTOR/mTOR比 例 下 降［（1.01±0.23）比（0.30±0.11），P=0.031］，Beclin1表達(dá)及LC3-II/LC3-I升高［（1.02±0.10）比（2.21±0.19），P=0.016；（1.05±0.25）比（3.62±0.70），P=0.043］，自噬流發(fā)生相關(guān)蛋白P62表達(dá)下降（0.94±0.13 vs.0.39±0.03，P=0.027），均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，紫花前胡苷處理后HeLa細(xì)胞內(nèi)自噬信號相關(guān)蛋白上調(diào)，表明紫花前胡苷可能激活HeLa細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)信號通路。

2.4 紫花前胡苷促進(jìn)HeLa細(xì)胞內(nèi)LC3B的顆粒化聚集

Ad-GFP-LC3B轉(zhuǎn)染72 h后轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上。10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h后，共聚焦顯微鏡下觀察LC3B分布狀態(tài)。紫花前胡苷處理后細(xì)胞內(nèi)的LC3B成顆粒性聚集，說明了自噬小體的生成增多。對照組與處理組每個細(xì)胞內(nèi)自噬小體生成顆粒分別為（2.67±3.06）、（78.0±11.1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。進(jìn)一步證實紫花前胡苷處理可上調(diào)HeLa細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)信號通路。

3 討論

圖4 紫花前胡苷處理后HeLa細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)信號通路檢測

宮頸癌的發(fā)生是正常宮頸上皮在多種理化因素刺激下逐漸發(fā)生瘤樣病變的過程，持續(xù)的致癌因素刺激最終導(dǎo)致了浸潤性宮頸癌的發(fā)生。中晚期進(jìn)展性宮頸癌患病后死亡率較高，對于早期的宮頸癌而言，及時的治療干預(yù)可明顯改善患者預(yù)后。癌細(xì)胞的過度增殖、抗凋亡特性的增強(qiáng)以及自噬信號的紊亂都會導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。在本研究中我們檢測了一種線型四氫呋喃型香豆素苷類化合物紫花前胡苷對宮頸癌HeLa細(xì)胞的作用及相關(guān)信號通路，為宮頸癌治療藥物研發(fā)提供候選小分子單體結(jié)構(gòu)。

本研究通過細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞凋亡檢測實驗證實紫花前胡苷可抑制HeLa細(xì)胞增殖活性并促進(jìn)凋亡率，并呈一定的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h組細(xì)胞的活力明顯下降、凋亡率明顯升高，因此后續(xù)實驗選用10 mmol/L處理24 h的實驗參數(shù)探索相關(guān)信號通路變化。凋亡和自噬是調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝以及細(xì)胞死亡的重要方式，是細(xì)胞應(yīng)對各種損傷性刺激所作出的反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，紫花前胡苷處理后HeLa細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路被激活，表現(xiàn)為凋亡相關(guān)蛋白clecaspase3、Cyto C、Bax水平升高以及抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)下降。目前關(guān)于紫花前胡苷抗研究較少，有研究顯示紫花前胡苷可抑制TGF-β/Smad信號通路改善尿毒癥血清誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，此外，還可通過NF-κB信號傳導(dǎo)通路抑制哮喘小鼠氣道炎性反應(yīng)，但尚無對腫瘤作用的相關(guān)報道，其誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確。有研究表明，呋喃型香豆素苷類化合物歐前胡素可激活細(xì)胞自噬，并在宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥效應(yīng)。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種新的程序性死亡形式，通過形成膜包被的自噬小體包裹細(xì)胞器及其他組成成分，隨后與溶酶體結(jié)合成自是溶酶體最終被降解完成“自我消化”過程，促進(jìn)細(xì)胞的新陳代謝及細(xì)胞器更新。自噬與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其與凋亡的相互作用關(guān)系極為復(fù)雜，正常生理情況下，自噬利于細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)的維持；在應(yīng)激發(fā)生時，自噬可防止有毒或致癌的損傷蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的累積，抑制細(xì)胞癌變，而HPV可通過抑制細(xì)胞自噬促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展；另一方面，自噬也為癌細(xì)胞提供更豐富的營養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤生長，紫杉醇可通過抑制宮頸癌細(xì)胞自噬進(jìn)而抑制宮頸癌進(jìn)展。因此，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，自噬的作用具有兩面性。有研究表明自噬是凋亡的引發(fā)形式之一，自噬的過度激活能夠通過引起線粒體的損傷促進(jìn)細(xì)胞死亡的發(fā)生。當(dāng)線粒體過度被消化，或者線粒體膜電位通透性的持續(xù)提高，能夠通過線粒體膜電位不可逆的下降，釋放凋亡誘導(dǎo)因子等物質(zhì)。在自噬調(diào)節(jié)的過程中，mTOR抑制后可以通過ULK1/2以及Beclin1促進(jìn)自噬小泡的形成，而p62通過與LC3相互作用，被自噬溶酶體分選后降解，是自噬常見的標(biāo)志分子。而紫花前胡苷引起宮頸癌細(xì)胞凋亡是否與自噬相關(guān)目前仍無相關(guān)報道，因此，本研究還檢測了自噬相關(guān)信號通路變化情況，結(jié)果顯示：紫花前胡苷處理后HeLa細(xì)胞后自噬相關(guān)mTOR信號通路中p-mTOR水平下降，Beclin1以及LC3-Ⅱ累積增多，自噬流相關(guān)蛋白P62表達(dá)下降，LC3B在紫花前胡苷處理組中呈顆粒性聚集，表明紫花前胡苷能夠促進(jìn)HeLa細(xì)胞LC3的表型轉(zhuǎn)換及P62的降解，提示了紫花前胡苷誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的同時伴有自噬流的發(fā)生。

綜上所述，本研究初步探索了紫花前胡苷對HeLa宮頸癌細(xì)胞的作用及相關(guān)信號通路，明確了一定濃度的紫花前胡苷具有較好的抗宮頸癌細(xì)胞作用，且其機(jī)制可能與自噬相關(guān)細(xì)胞凋亡有關(guān)。但自噬是否是紫花前胡苷誘導(dǎo)HeLa凋亡的必要因素仍需進(jìn)一步對自噬信號通路干預(yù)相關(guān)研究證實，此外，目前該研究尚停留在細(xì)胞層面，還需進(jìn)一步從動物水平以及基因、代謝層面進(jìn)一步闡述其治療作用及機(jī)制。