消癭方對甲狀腺FRTL細(xì)胞增殖與凋亡的影響

盧江昆　葉仁靜　沈潔　袁紹峰　孔祥東

[摘要]目的探討消癭方對甲狀腺FRTL細(xì)胞增殖與凋亡影響及其機(jī)制。方法取4周齡SD大鼠15只，隨機(jī)分為低濃度、中濃度、高濃度消癭方組和陽性藥組、空白組，每組3只。消癭方低、中、高濃度組分別給予7.47、14.94、29.88 g/kg消癭方中藥復(fù)方藥液，陽性藥組給予左甲狀腺素鈉片（0.18 mg/kg），空白組給予蒸餾水，連續(xù)灌胃5 d，腹主動脈取血，分離血清。體外培養(yǎng)大鼠甲狀腺FRTL細(xì)胞，分別應(yīng)用各組血清進(jìn)行干預(yù)。MTT法檢測含藥血清對FRTL細(xì)胞增殖率的影響，Hoechst 33258熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)，Western blotting和RT-PCR法檢測凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白和基因表達(dá)。結(jié)果高濃度消癭方含藥血清干預(yù)后，F(xiàn)RTL細(xì)胞增殖率顯著下降（F=6.71、5.85，P<0.05）;細(xì)胞密度下降，細(xì)胞排列散亂、細(xì)胞核碎裂、細(xì)胞透亮，呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學(xué)特征;促凋亡因子Bax蛋白和基因表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡因子Bcl-2蛋白和基因表達(dá)下調(diào)，促/抗凋亡因子bax/bcl-2間的平衡被打破，凋亡執(zhí)行因子Caspase-3蛋白和基因表達(dá)顯著上調(diào)，差異有顯著性（F=9.97～63.20，P<0.01）。結(jié)論消癭方能夠抑制甲狀腺FRTL細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與促/抗凋亡因子bax/bcl-2間平衡破壞、caspase-3表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]消癭方;甲狀腺;FRTL細(xì)胞;凋亡因子;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號]R259[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0105-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of Xiaoying prescription on the proliferation and apoptosis of thyroid FRTL cells and related mechanism. MethodsA total of 15 Sprague-Dawley rats， aged 4 weeks， were randomly divided into blank group， positive drug group， and low-， medium-， and high-concentration Xiaoying prescription groups， with 3 rats in each group. The rats in the low-， medium-， and high-concentration Xiaoying prescription groups were given the solution of Xiaoying prescription at a dose of 7.47， 14.94， and 29.88 g/kg， respectively， those in the positive drug group were given levothyroxine sodium tablets （0.18 mg/kg）， and those in the blank group were given distilled water， by gavage for 5 consecutive days. Blood samples were collected from the abdominal aorta and serum was separated. Rat thyroid FRTL cells were cultured in vitro， and the serum containing each drug was used for intervention. MTT assay was used to observe the effect of the serum containing drug on the proliferation rate of FRTL cells， Hoechst 33258 fluorescence staining was used to observe apoptotic morphology， and Western blotting and RT-PCR were used to measure the protein and mRNA expression of the apoptotic factors Bax， Bcl-2， and Caspase-3. ResultsThere was a significant reduction in the proliferation rate of FRTL cells after intervention with the serum containing high-concentration Xiaoying prescription （F=6.71，5.85;P<0.05）， with the typical apoptotic morphological features of reduced cell density， scattered arrangement， nucleus fragmentation， and translucent cells. The protein and mRNA expression of the pro-apoptotic factor Bax was upregulated， while the protein and mRNA expression of the anti-apoptotic factor Bcl-2 was downregulated， and the ba-lance between the pro-apoptotic factor bax and the anti-apoptotic factor bcl-2 was broken; there were significant increases in the protein and mRNA expression of the apoptosis execution factor caspase-3 （F=9.97-63.20，P<0.01）. ConclusionXiaoying prescription can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of thyroid FRTL cells， possibly by breaking the balance between the pro-apoptotic factor bax and the anti-apoptotic factor bcl-2 and upregulating the expression of caspase-3.

[KEY WORDS]Xiaoying recipe; thyroid gland; thyroid FRTL cells; apoptotic factor; cell proliferation; apoptosis

甲狀腺結(jié)節(jié)是最常見的內(nèi)分泌疾病之一，發(fā)病率高達(dá)6%～7%，以良性結(jié)節(jié)多見[1-2]。已有研究顯示，甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生是遺傳、免疫紊亂、激素失調(diào)等多種原因共同觸發(fā)而導(dǎo)致甲狀腺結(jié)構(gòu)及功能異常，其中甲狀腺細(xì)胞的增殖與凋亡平衡破壞在疾病的發(fā)生過程中起重要作用[3-4]。西醫(yī)治療甲狀腺結(jié)節(jié)常出現(xiàn)結(jié)節(jié)復(fù)發(fā)、骨質(zhì)疏松、甲狀腺功能下降等副作用[5-6]，而中醫(yī)藥具有毒小效優(yōu)、多環(huán)節(jié)、多途徑治療特點(diǎn)，在防治甲狀腺結(jié)節(jié)、改善癥狀、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等方面優(yōu)勢明顯[7]。消癭方以“益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)”為治則，為中藥治療“癭病”代表性方劑，臨床常用該方加減治療甲狀腺疾病。本研究旨在探討消癭方對甲狀腺FRTL細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為中醫(yī)藥治療甲狀腺結(jié)節(jié)提供基礎(chǔ)理論支撐。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級4周齡SD大鼠15只，雌雄不拘，體質(zhì)量200～220 g，由上海斯萊克動物有限公司提供。

1.1.2藥物消癭方組方：黃芪30 g，玄參15 g，黨參15 g，白芍15 g，北沙參15 g，制香附15 g，浙貝母15 g，夏枯草10 g，當(dāng)歸10 g，柴胡10 g，海浮石10 g，白芥子6 g，原藥材均購自上海群力中草藥店。全方加8倍體積水煎煮2次，并濃縮至人臨床等效劑量的0.5、1.0、2.0倍劑量。左甲狀腺素鈉片購自默克雪蘭諾有限公司，規(guī)格每粒50 μg。

1.1.3主要試劑與儀器大鼠甲狀腺FRTL細(xì)胞株（武漢普諾賽）;DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）;bax、bcl-2、caspase-3多克隆抗體（英國Abcam）;GAPDH單克隆抗體（美國CST）;HRP-IgG二抗（武漢博士德）;MTT粉末、Hoechst 33258染液（上海碧云天）;RIPA、Trizol（北京中杉金橋）;CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（美國Thermo）;超微量核酸蛋白測定儀（英國BioDrop）;凝膠成像分析系統(tǒng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1含藥血清的制備SD大鼠隨機(jī)分為空白組、低濃度消癭方組、中濃度消癭方組、高濃度消癭方組和陽性藥組，每組3只。低、中、高濃度消癭方組分別給予7.47、14.94、29.88 g/kg的中藥復(fù)方煎液（相當(dāng)于臨床等效劑量的0.5、1.0、2.0倍），陽性藥組給予0.18 mg/kg（臨床等效劑量）左甲狀腺素鈉片水溶液，空白組則給予等量蒸餾水。各組均于每天上、下午固定時(shí)間灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃5 d。第6天上午灌胃完成后1 h麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置2 h，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，分裝、保存?zhèn)溆茫褂们坝?.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)取大鼠甲狀腺FRTL細(xì)胞株，用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞基本長滿培養(yǎng)瓶底部（2～3 d）時(shí)消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞，隨機(jī)分為5組。 空白對照組（A組）：加入空白組血清;低濃度消癭方組（B組）：加入低濃度消癭方組含藥血清;中濃度消癭方組（C組）：加入中濃度消癭方組含藥血清;高濃度消癭方組（D組）：加入高濃度消癭方組含藥血清;左甲狀腺素鈉組（E組）：加入陽性藥組含藥血清。

1.3檢測指標(biāo)及方法

1.3.1MTT法檢測細(xì)胞增殖率采用胰蛋白酶消化并調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液，各組分別加入對應(yīng)的含藥或者正常血清。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白孔。分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h，加入MTT液避光孵育4 h，然后加入DMSO液，室溫下振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。增殖率（%）=（A含藥血清-A空白孔）/（A空白血清-A空白孔）×100%。

1.3.2Hoechst染色法檢測細(xì)胞凋亡情況調(diào)整細(xì)胞密度，加入含藥或者正常血清后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出96孔板，棄去培養(yǎng)液，加入PBS液洗滌3次，然后每孔加入Hoechst 33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min;孵育完成后，棄去孔內(nèi)染液，PBS液洗滌3次后，倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的凋亡形態(tài)。

1.3.3Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)收集含藥或者正常血清培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞，加入裂解液冰上裂解20 min，以4 ℃、12 000 r/min離心10 min后取上清液，應(yīng)用超微量核酸蛋白測定儀測定細(xì)胞總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入稀釋后的一抗（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜。洗滌條帶，加入二抗（1∶500稀釋）室溫下孵育4 h，洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯影。用Image-Pro Plus軟件分析各條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目的蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的相對表達(dá)水平。

1.3.4RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因表達(dá)收集含藥或者正常血清培養(yǎng)24 h細(xì)胞于EP管內(nèi)，加入1 mL Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，檢測含量合格后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求操作），采用PCR擴(kuò)增目的基因產(chǎn)物，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照。引物由深圳華大基因公司合成，序列見表1。用2-△△CT法對細(xì)胞目的基因bax、bcl-2、caspase-3水平進(jìn)行定量分析。

以上指標(biāo)檢測各組均用3份血清進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料結(jié)果用±s表示，多組間比較用單因素或析因設(shè)計(jì)資料的多因素方差分析，兩組間比較用Dunnet-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組FRTL細(xì)胞增殖率比較

析因設(shè)計(jì)資料的多因素方差分析顯示，不同處理方式對FRTL細(xì)胞增殖率影響差異有顯著意義（F=12.40，P<0.01），而相同處理方式不同時(shí)間處理對FRTL細(xì)胞增殖率沒有顯著影響（P>0.05），且處理方式和處理時(shí)間無交互效應(yīng)（P>0.05）。與空白對照組比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)能顯著降低FRTL細(xì)胞的增殖率（F=6.71、5.85，P<0.05）。與陽性藥左甲狀腺素鈉組比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細(xì)胞增殖率差異無顯著性（P>0.05）。見表2。

2.2各組FRTL細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察

空白對照組FRTL細(xì)胞密集、分布均勻，細(xì)胞形態(tài)正常，熒光呈暗藍(lán)色，無明顯的凋亡特征;中、低濃度消癭方組FRTL細(xì)胞數(shù)量稍有減少，但細(xì)胞形態(tài)、密度及熒光顏色與空白對照組比較差異不明顯;高濃度消癭方組及左甲狀腺素鈉組FRTL細(xì)胞數(shù)目明顯減少，排列散亂無規(guī)則，部分細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞透亮，熒光顏色明顯，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征。見圖1。

2.3各組FRTL細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與空白對照組比較，中、高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)能顯著增加FRTL細(xì)胞促凋亡因子Bax蛋白的表達(dá)（F=9.97，P<0.01），降低抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(dá)（F=14.73，P<0.01），升高Bax/Bcl-2比值（F=63.20，P<0.01），上調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)（F=53.82，P<0.01）。與左甲狀腺素鈉組相比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)差異無顯著性（P>0.05），而中濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后Bax/Bcl-2比值和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3表達(dá)降低（P<0.01）。與中濃度消癭方組比較，高濃度消癭方組Bax/Bcl-2比值和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)增高（P<0.01）。見圖2和表3。

2.4各組FRTL細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較

與空白對照組比較，中、高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)能顯著增加FRTL細(xì)胞促凋亡因子Bax基因表達(dá)（F=15.52，P<0.01），降低抗凋亡因子bcl-2基因的表達(dá)（F=12.83，P<0.01），升高基因bax/bcl-2比值（F=45.89，P<0.01），上調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3基因的表達(dá)（F=21.91，P<0.01）。與左甲狀腺素鈉組比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)差異無顯著意義（P>0.05），而中濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細(xì)胞基因bax/bcl-2比值降低（P<0.01）。與中濃度消癭方組相比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細(xì)胞基因bax/bcl-2比值顯著增高，差異有顯著性（P<0.01）。見表4。

3討論

甲狀腺結(jié)節(jié)屬中醫(yī)“癭病”范疇，病始在肝，肝氣郁滯而化火，灼傷津液而生痰，痰濁內(nèi)阻，瘀阻脈絡(luò)，以致氣機(jī)逆亂，氣血通行不暢，集結(jié)于頸部，導(dǎo)致此病發(fā)生[8]。其中醫(yī)病機(jī)關(guān)鍵是臟腑功能紊亂，氣血陰虛失和，氣滯、痰凝等有形之邪蘊(yùn)結(jié)于局部而成癭腫，治當(dāng)以“益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)”為法。

消癭方由黃芪、玄參、黨參、白芍、北沙參、制香附、浙貝母、夏枯草、柴胡、當(dāng)歸、海浮石、白芥子等藥組成。方中以黃芪為君藥，益氣固表，消腫生肌，并能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及激素平衡;玄參、黨參、白芍、北沙參為臣藥，助黃芪益氣消腫之功效;制香附、浙貝母、夏枯草、柴胡、當(dāng)歸、海浮石及白芥子為佐使藥，以行氣活血、消腫散瘀、養(yǎng)陰化痰、軟堅(jiān)散結(jié)。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)兼扶正之功。臨床研究證實(shí)，消癭方治療甲狀腺結(jié)節(jié)、橋本甲狀腺炎等甲狀腺疾病療效顯著[9-11]。

甲狀腺細(xì)胞的正常增殖與凋亡是維持甲狀腺功能的基礎(chǔ)，細(xì)胞增殖速度過快以及細(xì)胞凋亡功能降低均參與了甲狀腺結(jié)節(jié)的形成過程[12]?；謴?fù)甲狀腺細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，是治療該疾病的重要策略[13-14]。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法觀察消癭方對甲狀腺FRTL細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，高濃度消癭方刺激的含藥血清能有效抑制FRTL細(xì)胞增殖;但其抑制FRTL細(xì)胞增殖效果不呈時(shí)間依賴性，因此后續(xù)研究中將干預(yù)時(shí)間設(shè)定為24 h。本文應(yīng)用Hoechst 33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，結(jié)果顯示，高濃度的消癭方含藥血清能導(dǎo)致FRTL細(xì)胞數(shù)量下降，分布散亂，細(xì)胞核碎裂、固縮、透亮，呈現(xiàn)明顯的凋亡特征。

Bcl-2家族是目前公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因，包括bax、bad等促凋亡因子和bcl-2、bcl-xl等抗凋亡因子基因，其中bax和bcl-2的相對表達(dá)水平高低直接決定細(xì)胞對凋亡刺激的反應(yīng)程度[15-16]?？沟蛲鲆蜃觔cl-2主要是通過抗氧化或抑制氧自由基產(chǎn)生來阻止細(xì)胞凋亡，促凋亡因子bax則是通過線粒體途徑形成同源二聚體而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，bax/bcl-2間的平衡決定細(xì)胞凋亡是否發(fā)生[17-20]。研究顯示，在甲狀腺結(jié)節(jié)疾病狀態(tài)下，抗凋亡的bcl-2表達(dá)增加而促凋亡的bax下降，導(dǎo)致bax/bcl-2比值異常，凋亡相對不足[21-23]。

Caspase家族是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有特定結(jié)構(gòu)的蛋白酶，該家族相關(guān)蛋白的激活能誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而Caspase家族成員的活性受到Bcl-2家族系列因子的調(diào)控[16，24]。其中，Caspase-3是Caspase家族中最關(guān)鍵的成員之一，是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行者[26]。本文研究結(jié)果顯示，消癭方含藥血清能有效增加促凋亡因子bax表達(dá)而降低抗凋亡因子bcl-2表達(dá)，打破促/抗凋亡因子bax/bcl-2間的平衡，同時(shí)上調(diào)caspase-3表達(dá)，從而誘導(dǎo)甲狀腺FRTL細(xì)胞凋亡。

綜上所述，以“益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)”為治則的消癭方能抑制甲狀腺FRTL細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與破壞促/抗凋亡因子bax/bcl-2間平衡、上調(diào)caspase-3表達(dá)有關(guān)。本研究從細(xì)胞層面明確了消癭方對甲狀腺疾病的治療作用，為該方的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。下一步擬對該方進(jìn)行拆解，篩選并明確其發(fā)揮療效的有效成分。

[參考文獻(xiàn)]

[1]KARKADA M， COSTA A F， IMRAN S A， et al. Incomplete thyroid ultrasound reports for patients with thyroid nodules： implications regarding risk assessment and management[J].? AJR： American Journal of Roentgenology， 2018，211（6）：1348-1353.

[2]朱精強(qiáng)，蘇安平. 甲狀腺結(jié)節(jié)手術(shù)治療的合理選擇[J]. 中國實(shí)用外科雜志， 2015，35（6）：635-639.

[3]XU W M， HUO L L， CHEN Z X， et al. The relationship of TPOAb and TGAb with risk of thyroid nodules： a large epidemiological study[J].? International Journal of Environmental Research and Public Health， 2017，14（7）：E723.

[4]BARTOLAZZI A， BELLOTTI C， SCIACCHITANO S. Methodology and technical requirements of the galectin-3 test for the preoperative characterization of thyroid nodules[J].? Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology： AIMM， 2012，20（1）：2-7.

[5]袁艷倩. 甲狀腺結(jié)節(jié)的中醫(yī)證候?qū)W研究[D].? 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)， 2017.

[6]陳玲，郭盼盼，萬會娜，等. 中醫(yī)藥治療甲狀腺結(jié)節(jié)的研究進(jìn)展[J].? 河北中醫(yī)， 2019，41（12）：1914-1920.

[7]劉志萍，白玉昊，孫莉. 良性甲狀腺結(jié)節(jié)中西醫(yī)研究的現(xiàn)狀與展望[J].? 中醫(yī)臨床研究， 2018，10（3）：123-129.

[8]支穎川. 從中醫(yī)體質(zhì)學(xué)論甲狀腺結(jié)節(jié)的治療[J].? 環(huán)球中醫(yī)藥， 2015，8（5）：586-587.

[9]李姍. 消癭方治療氣陰兩虛型橋本甲狀腺炎及對甲狀腺自身抗體水平的影響[J].? 陜西中醫(yī)， 2017，38（11）：1581-1582.

[10]裴琴. 散結(jié)消癭方治療甲狀腺結(jié)節(jié)療效觀察[J].? 實(shí)用中醫(yī)藥雜志， 2019，35（9）：1057-1058.

[11]貢翊斐，王小平，沈睿，等. 消癭方對微波消融術(shù)后甲狀腺結(jié)節(jié)的影響[J].? 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2018，27（33）：3649-3652.

[12]LIU F Z， LOU K X， ZHAO X T， et al. miR-214 regulates papillary thyroid carcinoma cell proliferation and metastasis by targeting PSMD10[J].? International Journal of Molecular Medicine， 2018，42（6）：3027-3036.

[13]LEE H J， LEE W K， KANG C W， et al. A selective cyclin-dependent kinase 4，6 dual inhibitor，Ribociclib （LEE011） inhibits cell proliferation and induces apoptosis in aggressive thyroid cancer[J].? Cancer Letters， 2018，417：131-140.

[14]CARVALHO D O， FREITAS J， NOGUEIRA P， et al. Xanthohumol inhibits cell proliferation and induces apoptosis in human thyroid cells[J].? Food and Chemical Toxicology： an International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association， 2018，121：450-457.

[15]張勤麗，牛僑. 細(xì)胞凋亡機(jī)制概述[J].? 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)， 2007，24（1）：102-107.

[16]DERAKHSHAN A， CHEN Z， VAN WAES C. Therapeutic small molecules target inhibitor of apoptosis proteins in cancers with deregulation of extrinsic and intrinsic cell death pathways[J].? Clinical Cancer Research： an Official Journal of the Ame-rican Association for Cancer Research， 2017，23（6）：1379-1387.

[17]NAVEENKUMAR S K， HEMSHEKHAR M， SUNDARAM M S， et al. Cell-free methemoglobin drives platelets to apoptosis via mitochondrial ROS-mediated activation of JNK and p38 MAP kinase[J].? Biochemical and Biophysical Research Communications， 2017，491（1）：183-191.

[18]LI D G， WANG K L， ZHANG W， et al. Expression of bax/bcl-2， TGF-β1， and type Ⅲ collagen fiber in congenital muscular torticollis[J].? Medical Science Monitor， 2018，24：7869-7874.

[19]李金貴，劉川，萬華，等. 白藜蘆醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].? 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2018，41（3）：272-276.

[20]王利娟，谷麗娟，孫穎川. miR-92a對宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡影響及其機(jī)制[J].? 青島大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2019，55（4）：406-410.

[21]ALVA-SNCHEZ C， SNCHEZ-HUERTA K， ARROYO-HELGUERA O， et al. The maintenance of hippocampal pyramidal neuron populations is dependent on the modulation of specific cell cycle regulators by thyroid hormones[J].? Brain Research， 2009，1271：27-35.

[22]BARTOLAZZI A， SCIACCHITANO S， DALESSANDRIA C. Galectin-3： the impact on the clinical management of patients with thyroid nodules and future perspectives[J].? International Journal of Molecular Sciences， 2018，19（2）：E445.

[23]VIACAVA P， BOCCI G， TONACCHERA M， et al. Markers of cell proliferation， apoptosis， and angiogenesis in thyroid adenomas： a comparative immunohistochemical and genetic investigation of functioning and nonfunctioning nodules[J].? Thyroid： Official Journal of the American Thyroid Association， 2007，17（3）：191-197.

[24]岳原亦，張揚(yáng)，張一奇. Caspase家族與細(xì)胞凋亡[J].? 中國醫(yī)療前沿， 2011，6（6）：25-26.

[25]馮健愉，朱玉山，陳佺，等. Bcl-2家族蛋白的生理功能及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[J].? 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2019，41（8）：1477-1489.

[26]趙瑞杰，李引乾，王會，等. Caspase家族與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].? 中國畜牧雜志， 2010，46（17）：73-78.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）