九龍?zhí)俣嗉籽趸S酮的快速分離鑒定

邵靜靜 陳州顥 陳雨浪 周學(xué)斌 宋曉容

摘要：目的 對九龍?zhí)俣嗉籽趸S酮進(jìn)行快速分離鑒定。方法：采用HPLC-Q-TOF/MS法追蹤九龍?zhí)僦械亩嗉籽趸S酮，采用制備液相法進(jìn)行快速分離，以質(zhì)譜結(jié)合核磁共振法進(jìn)行快速鑒定。結(jié)果：利用HPLC-Q-TOF/MS分析，發(fā)現(xiàn)了九龍?zhí)僖宜嵋阴ポ腿〔课恢械?個多甲氧基黃酮，以制備液相法快速分離了其中1個，通過質(zhì)譜及核磁共振波譜鑒定為5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮。結(jié)論：該方法適用于九龍?zhí)俣嗉籽趸S酮的快速分離鑒定，為其藥效篩選提供快速樣品制備方法。

關(guān)鍵詞：九龍?zhí)?多甲氧基黃酮;HPLC-MS/MS;分離鑒定

分類號：TQ461

九龍?zhí)伲˙auhinia championii Benth.） 為豆科羊蹄甲屬植物，別名過崗龍、龍須藤、梅花入骨丹等，分布于浙江、廣東、廣西、福建等省[1]。九龍?zhí)傩钥?、辛、平，無毒，具有祛風(fēng)除濕、活血止痛、健脾理氣等功效[2，3]?，F(xiàn)代研究表明九龍?zhí)偬崛∥锞哂锌寡祖?zhèn)痛、保護(hù)心腦血管、抗菌、抗病毒等藥理作用[3-9]。我們前期以HPLC-Q-TOF/MS對九龍?zhí)僖宜嵋阴ポ腿〔课坏幕瘜W(xué)成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)主要為黃酮類和芳香酸類為主。為了進(jìn)一步明確九龍?zhí)俚挠行С煞郑覀儾捎肏PLC-Q-TOF/MS追蹤結(jié)合制備液相分離，快速分離鑒定了九龍?zhí)僖宜嵋阴ゲ课恢械亩嗉籽趸S酮類化合物，為九龍?zhí)俚乃幮镔|(zhì)篩選研究提供了簡便、快速的樣品制備方法。

一、材料與方法

1.儀器與試劑

Bruker Advance 600 MHz型核磁共振儀（德國Bruker公司）;安捷倫1260液相色譜儀，安捷倫四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀6530（美國安捷倫公司）;）;Waters制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司）;SK7210LHC數(shù)控超聲波清洗器（功率350 W，頻率53kHz，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）;EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）;九龍?zhí)俨捎诟＝?，鑒定為九龍?zhí)貰auhinia championii Benth.;色譜甲醇（美國TEDIA公司）;試劑均為分析純。

2.提取與分離

（1）提取

取九龍?zhí)亠嬈? kg，粉碎，以5倍量甲醇超聲提取5次，合并提取液，減壓濃縮后得總提取物141.2 g。取總提取物30 g，以500 ml蒸餾水混懸，分別以乙酸乙酯、正丁醇依次萃?。w積比1：1，萃取3次），將萃取液減壓濃縮后得到乙酸乙酯萃取物5.84g，正丁醇萃取物4.97g。

（2） HPLC-Q-TOF/MS追蹤

Diamonsil C18 （2） 色譜柱（250×4.6mm ，5 μm）;以甲醇為A相，以0.1%甲酸-水為B相，梯度洗脫：0～18min，65% A;18～21min，65～95% A;21～25min，95%A;25～30 min，95～65 % A;30～35 min，65 % A;檢測波長328 nm;柱溫為30℃;進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件：ESI離子源，干燥氣溫度300 ℃，霧化氣壓力35 psi，干燥器流速8 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速11 L/min，毛細(xì)管電壓3500 V（負(fù)離子），4000 V（正離子）;錐孔電壓100 V;掃描范圍m/z 100～1500;二級裂解電壓15-35 eV。利用高分辨質(zhì)譜的精確分子量、分子式以及二級質(zhì)譜碎片數(shù)據(jù)，追蹤九龍?zhí)僖宜嵋阴ゲ课坏亩嗉籽趸S酮類化合物。

（3）分離

采用制備型高效液相色譜，以YMC-Pack ODS-A-HG 色譜柱（250×10mm，S-10μm，12 nm），以甲醇-水（65%）為流動相進(jìn)行分離，收集色譜峰餾分，得到化合物Ⅰ 5.4mg。

二、結(jié)果與討論

我們利用HPLC-Q-TOF/MS分析，發(fā)現(xiàn)了九龍?zhí)僖宜嵋阴ゲ课恢械?個多甲氧基黃酮，以制備液相法摸索了最佳分離條件，分離了其中1個多甲氧基黃酮，其結(jié)構(gòu)鑒定如下。

化合物Ⅰ：白色粉末。1H-NMR （CDCl3，600 MHz）：δ 7.51 （dd，1H，J = 8.4，2.5 Hz，H-6'），7.33（d，1H，J = 8.5Hz，H-5'），6.97（d，1H，J =2.5Hz，H-2'）， 6.80（s，1H，H-8）， 6.60（s，1H，H-3）， 3.99（s，7-OMe）， 3.98（s，6-OMe），3.96（s，5-OMe）， 3.92（s，4'-OMe）， 3.91（s，3'-OMe）。

高分辨質(zhì)譜（HR-ESI-MS）給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 373.1287 [M+H]+，確定其分子式為C20H20O7，分子量為372，其二級質(zhì)譜裂解碎片與5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮相同。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[10，11]基本一致，因此確定化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)為5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮。

我們通過HPLC-Q-TOF/MS追蹤結(jié)合制備液相分離，快速分離鑒定了九龍?zhí)僖宜嵋阴ゲ课恢械亩嗉籽趸S酮類化合物，為九龍?zhí)俚乃幮镔|(zhì)篩選研究提供了簡便、快速的樣品制備方法。課題組將在后續(xù)研究中采用此法對九龍?zhí)僦刑囟ńY(jié)構(gòu)類型的化合物進(jìn)行針對性快速分離，并結(jié)合體內(nèi)外活性研究，探討九龍?zhí)俚乃幮镔|(zhì)基礎(chǔ)，為九龍?zhí)儋Y源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

本研究由浙江省大學(xué)生新苗人才計劃項目（2020R425007），杭州醫(yī)學(xué)院校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目S201913023021、S201913023022、S201913023041）資助。

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（杭州醫(yī)學(xué)院，浙江杭州? 310053））