陳思平 ,郭培培, ,秦曉威,宗迎,黃艷麗 *,夏志強(qiáng)
1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院(普洱 665000);2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所/農(nóng)業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(萬寧 571533);3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院(成都 611130);4.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所(海口 571101)
香露兜(Pandanus amaryllifoliusRoxb.),為露兜樹科(Pandanaceae)露兜樹屬(Pandanus)多年生熱帶園藝作物,因其葉加于米中蒸食可產(chǎn)生香稻的“粽香”而聞名[1-2],是熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛使用的一種天然食用調(diào)味料。其富含生物堿、多酚、黃酮等活性物質(zhì),具有抑制氧化酶活性、降血糖和改善代謝等作用[3-9]。香露兜原產(chǎn)于印度尼西亞馬魯古群島,我國于20世紀(jì)50年代由歸國華僑引進(jìn)并試種成功,目前主要栽培于海南、云南等省區(qū)[2],現(xiàn)已成為海南當(dāng)?shù)氐南M(fèi)新潮和休閑旅游的特色品牌之一。作為一種深受人們喜愛的天然食用增香料,香露兜長期存在需求旺盛與供應(yīng)不足的問題,因而具有重要的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景,對提高邊遠(yuǎn)地區(qū)農(nóng)民收入和生活水平具有重要意義。
2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)又名古嗎啉,為淡黃色液體,有增進(jìn)食欲和改善新陳代謝的作用[3],是香稻的主要香氣貢獻(xiàn)物,也是香露兜產(chǎn)生“粽香”的特征致香成分[4,19]。相關(guān)研究表明,香露兜中2-AP的含量是香稻中的10倍多[14,20],高2-AP含量正是其商業(yè)價(jià)值所在。2-AP的提取有水蒸氣蒸餾法[10]、有機(jī)溶劑萃取法[11-12]、超臨界CO2萃取法[13-14]等,但鮮有對多種提取方法進(jìn)行比較的報(bào)道。國內(nèi)外采用氣相色譜(GC)技術(shù)[16]、氣相色譜-氫火焰離子化檢測器(GC-FID)技術(shù)[14-15]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)技術(shù)[10,13,17]、高效液相色譜(HPLC)技術(shù)[18]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)[19]等對2-AP的定性和定量分析開展了廣泛的研究,能夠較好地滿足2-AP的檢測要求,但多集中在香稻的研究上,對香露兜中2-AP的分析研究相對較少。而且,隨著大型分析儀器的普及,超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)在定量分析方面具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度,不需要對樣品進(jìn)行富集即可檢測,與GC、HPLC等相比更加快速高效。為對香露兜中的特征香氣成分2-AP進(jìn)行鑒定和定量分析,此次試驗(yàn)以海南引種栽培的香露兜為材料,比較分析乙醇溶劑(75%和100%兩種不同比例)的3種不同提取方法(蒸餾法、浸提法和超聲波輔助法)對香露兜中2-AP提取效率的影響,利用GC-MS技術(shù)結(jié)合保留指數(shù)對樣品中2-AP進(jìn)行鑒定,并在此基礎(chǔ)上采用靈敏度更高的UPLC技術(shù)對2-AP含量進(jìn)行更加準(zhǔn)確的定量分析,旨在為2-AP檢測標(biāo)準(zhǔn)的編訂、香露兜的資源評價(jià)和香露兜產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。
Aglient-7890/5977B GC-MS聯(lián)用儀、Agilent 1290超高效液相色譜儀配備DAD檢測器(美國安捷倫公司);Pall-cascada純水/超純水一體化機(jī)系統(tǒng)(美國頗爾公司);電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠);S6000超聲波清洗機(jī)(東莞市墨潔超聲波設(shè)備公司)。
2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)標(biāo)準(zhǔn)品(≥98.0%,上海源葉生物科技有限公司);C7~C30正構(gòu)烷烴混標(biāo)準(zhǔn)品(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司);75%乙醇、100%乙醇(分析純,山東利爾康醫(yī)療公司);乙醇、甲醇(色譜醇,西隴科學(xué)公司);水(娃哈哈純凈水)。
供試樣品香露兜采自海南興隆熱帶植物園,經(jīng)秦曉威副研究員鑒定為露兜樹科露兜樹屬植物香露兜Pandanus amaryllifoliusRoxb.。
1.2.1 香露兜中2-AP的提取
選取成熟、無病蟲害和無機(jī)械損傷的香露兜新鮮葉片,清洗晾干,切碎并混勻,備用。分別采用蒸餾法、浸提法、超聲波輔助法進(jìn)行提取,每種方法又采用75%和100%兩種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇分別作萃取溶劑。每種提取方式均重復(fù)3次。
蒸餾法:精密稱取40 g樣品于圓底燒瓶中,加入500 mL乙醇溶劑,保持微沸狀態(tài)蒸餾提取4 h,收集餾出液,除水,待測。
浸提法:精密稱取40 g取樣品于錐形瓶中,加入500 mL乙醇溶劑,常溫下浸提4 d,過濾,除水,待測。
超聲波輔助提取法:精密稱取40 g樣品于錐形瓶中,加入500 mL乙醇溶劑,在50 ℃下超聲波輔助提取40 min,過濾,除水,待測。
1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取15.35 mg 2-AP標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,用UPLC級乙醇溶劑溶解,定容,得質(zhì)量濃度為1.535 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,于-18 ℃避光貯存。準(zhǔn)確移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液,稀釋成500,300,150,100,50和30 μg/mL梯度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.2.3 UPLC樣品供試液的制備
準(zhǔn)確稱取5.00 g 1.2.1小節(jié)中香露兜樣品于20 mL容量瓶中,加入U(xiǎn)PLC級乙醇溶劑,定容至刻度線。在50 ℃下超聲波輔助提取40 min,過濾,提取液加入無水硫酸鈉除水,經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾,按1.2.4條件上機(jī)測定。
1.2.4 GC-MS和UPLC儀器分析條件
GC分析條件:DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣位高純度He2(99.999%);流速1 mL/min,不分流;進(jìn)樣口溫度250 ℃;升溫程序:起始溫度50 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升溫至100 ℃,再以6 ℃/min升溫至250 ℃,保持5 min;進(jìn)樣量10 μL。
質(zhì)譜條件:離子源電離方式EI;電子能量70 eV;MS四極桿溫度150 ℃,離子源溫度230 ℃;掃描質(zhì)量范圍m/z30~450。
UPLC分析條件:色譜柱Zorbax Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm,5 Micron);流動(dòng)相為甲醇-水9∶1,流速0.5 mL/min;檢測波長206 nm;進(jìn)樣量5 μL;左右柱溫箱25 ℃。
1.2.5 保留指數(shù)(IT)的計(jì)算
式中:z和z+1分別為目標(biāo)化合物(2-AP)流出前后的正構(gòu)烷所含碳原子的數(shù)目;TR(2-AP),TR(z)和TR(z+1)分別代表2-AP及碳原子數(shù)為z和z+1正構(gòu)烷的保留溫度,且TR(z)<TR(2-AP)<TR(z+1)。
如圖1所示,比較乙醇溶劑(75%和100%兩種不同比例)的3種提取方法(蒸餾法、浸提法和超聲波輔助法)共6種不同提取方式對香露兜中2-AP提取效率的影響,GC檢出的2-AP峰面積存在顯著性差異(p<0.05)。其中,超聲波輔助100%乙醇溶劑提取法檢出的2-AP峰面積最大。
乙醇溶劑對2-AP溶解度比丙醇、甲醇高[12],且安全、毒性低。香露兜中2-AP的提取法較多采用水蒸氣蒸餾法[10]和有機(jī)溶劑萃取法[11-12,20]。超聲波輔助提取法利用超聲波破壞植物細(xì)胞組織,加大了溶劑的滲透作用,提取效率較高,比蒸餾法減少了熱降解、熱揮發(fā)的損失,比浸提法提取得更充分。故采用超聲波輔助100%乙醇萃取法提取香露兜中的2-AP,以獲得較高的提取效率。
圖1 2-AP不同提取方式下氣相色譜峰面積圖
如圖2所示,在1.2.4項(xiàng)檢測條件下,2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和樣品質(zhì)譜掃描均得到較豐富的離子碎片信息,離子碎片特征質(zhì)荷比均在同一位置出現(xiàn),其特征離子峰質(zhì)荷比為m/z111,83,68,69,55,52,42,43和41,分子離子峰為m/z111。2-AP樣品質(zhì)譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品匹配度達(dá)90.4%。
如圖3所示,在1.2.4項(xiàng)檢測條件下,目標(biāo)化合物2-AP色譜峰分離度良好,2-AP標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間t標(biāo)=(12.324±0.18)min,樣品中2-AP保留時(shí)間t樣=(12.529± 0.24)min。由1.2.5項(xiàng)保留指數(shù)公式計(jì)算得2-AP的實(shí)際保留指數(shù)1 331±2,參考保留指數(shù)為1 330±7。2-AP的實(shí)際保留指數(shù)在參考保留指數(shù)范圍內(nèi)。
GC-MS可對某個(gè)特定成分進(jìn)行鑒定和定量分析[17-19]。GC-MS在鑒定香露兜特征香氣成分2-AP的同時(shí),還可檢測出香露兜中角鯊烯、葉綠醇等其他香氣成分[12-14];而在定量分析上,UPLC比GC靈敏度高,更加快速高效。因此,確定分別采用GC-MS和UPLC對香露兜中2-AP進(jìn)行鑒定和定量分析。
圖2 2-AP標(biāo)準(zhǔn)品MS譜圖(A)和樣品MS譜圖(B)
圖3 2-AP標(biāo)準(zhǔn)品GC譜圖(A)和樣品GC譜圖(B)
2.3.1 檢測波長的選擇
2-AP標(biāo)準(zhǔn)品在UPLC檢測器DAD下光譜全掃描,結(jié)果如圖4所示。2-AP在206 nm波長處有最大吸收峰,且干擾較少。確定選擇λ=206 nm作為2-AP定量分析波長。
圖4 2-AP全波長掃描圖
2.3.2 2-AP的UPLC色譜圖
在λ=206 nm處,2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和樣品按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件進(jìn)樣檢測,結(jié)果如圖5所示。2-AP標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間t標(biāo)=5.345 min,樣品保留時(shí)間t樣=5.316 min。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致。
圖5 2-AP標(biāo)準(zhǔn)品UPLC色譜圖(A)和樣品UPLC色譜圖(B)
2.3.3 線性范圍、檢出限和定量限
1.2.2 項(xiàng)系列標(biāo)準(zhǔn)液在1.2.4項(xiàng)檢測條件下進(jìn)樣分析,以色譜峰面積x為橫坐標(biāo),濃度y為縱坐標(biāo),繪制2-AP標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程y=0.351 2x+5.018 8,相關(guān)系數(shù)r2=0.999 5。結(jié)果表明,2-AP在30~500 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
以信噪比S/N≥3和S/N≥10分別計(jì)算檢出限(LOD)和定量限(LOQ),測得LOD為0.005 14 mg/mL,LOQ為0.017 1 mg/mL。
2.3.4 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)
取2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和1.2.3項(xiàng)樣品供試液,各1份,按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件,分別連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)行精密度試驗(yàn)。記錄2-AP峰面積,計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)品δRSD為1.35%,樣品δRSD為1.43%。
取2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和1.2.3項(xiàng)樣品供試液,各1份,按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件,1 d內(nèi)分別在0,2,4,8,12和24 h進(jìn)樣,進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。記錄2-AP峰面積,計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)品δRSD為0.98%,樣品δRSD為1.80%。
取2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和1.2.3項(xiàng)樣品供試液平行樣,各6份,按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件進(jìn)樣檢測,進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。記錄2-AP峰面積,計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)品δRSD為1.08%,樣品δRSD為1.54%。
精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)中,δRSD<2%,均在可接受標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。
2.3.5 樣品加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
取9份已知2-AP含量的樣品供試液,分成3組(每組3份),分別按80%,100%和120%水平加入2-AP標(biāo)準(zhǔn)液,按照1.2.4項(xiàng)儀器工作條件進(jìn)樣檢測,以外標(biāo)法計(jì)算2-AP含量,結(jié)果如表1所示。樣品加標(biāo)回收率在92.6%~98.6%之間,3個(gè)水平δRSD分別為3.23%,2.35%和0.95%。該方法滿足GB/T 27404—2008附錄F[21]的要求,可用于香露兜中2-AP的定量分析。
表1 方法回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=9)
表2 香露兜樣品中2-AP的含量(n=6)
按1.2.3項(xiàng)制備6份樣品供試液平行樣,按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件進(jìn)樣,UPLC測定結(jié)果如表2所示。根據(jù)1.2.3項(xiàng)樣品供試液制備工藝,計(jì)算得香露兜中2-AP含量為637.8 mg/kg。香露兜成熟鮮葉中富含2-乙酰-1-吡咯啉。
此次試驗(yàn)建立了超聲波輔助100%乙醇提取、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)鑒定、超高效液相色譜(UPLC)定量分析香露兜中特征香氣成分2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的檢測方法。采用該方法測得香露兜成熟鮮葉中2-AP含量高達(dá)637.8 mg/kg。該方法準(zhǔn)確度高,靈敏度、可靠性等均符合理化檢測檢驗(yàn)方法確認(rèn)的技術(shù)要求,適用于香露兜中2-AP的鑒定和定量分析,為2-AP相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的編訂提供了技術(shù)支持,也為香露兜的資源評價(jià)、產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。