響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶水解制備牡蠣肽及其分析評(píng)價(jià)

姚鳳麗，張明振，王鵬，劉霞，喬樂(lè)克，張京良 *

1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（青島 266003）；2.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院（青島 266003）；3.乳山市華隆生物科技股份有限公司（威海 264513）；4.青島市市立醫(yī)院（青島 266011）；5.青島海洋生物醫(yī)藥研究院（青島 266071）

牡蠣（oyster），俗稱生蠔，是全球養(yǎng)殖規(guī)模最大的貝類品種，也是我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類品種之一[1]。牡蠣營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、糖原、牛磺酸、維生素以及硒、鐵、鈣等微量元素[2]。牡蠣蛋白氨基酸組成完全，質(zhì)量?jī)?yōu)于牛乳和人乳[3]，素有“海中牛奶”之稱。目前，牡蠣的利用仍以鮮食和加工制成干制品為主，市面上的牡蠣精深加工制品較少，這嚴(yán)重限制了牡蠣的高值化利用。牡蠣是開(kāi)發(fā)生物活性肽的優(yōu)良材料。研究表明，牡蠣肽有抗氧化[4]、增強(qiáng)免疫力[5]、抗腫瘤[6]、抑菌[7]等多種生物活性，而且牡蠣肽鮮味氨基酸含量豐富，可被廣泛應(yīng)用于功能食品和海鮮調(diào)味品的研究開(kāi)發(fā)，前景廣闊。

酶解法制備牡蠣肽，由于條件溫和、專一性強(qiáng)、水解程度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前重點(diǎn)研究和使用的方法，其中復(fù)合蛋白酶酶解相較單一酶酶解，往往能獲得更高的水解度、更好的外觀及口感，已逐步成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

此次試驗(yàn)采用胰酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶解制備牡蠣肽，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件，并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，為牡蠣的精深加工及牡蠣肽的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣（乳山市華隆生物科技股份有限公司）；胰酶（酶活力35×104U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力80×104U/g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；分子量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）；SKD-100凱氏定氮儀（上海沛歐分析儀器有限公司）；PH2700酸度計(jì)（美國(guó)EUTECH公司）；Agilent 1260液相色譜儀（Agilent公司）；L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀（日本日立集團(tuán)）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牡蠣酶解基本工藝

新鮮牡蠣去殼洗凈并搗碎，加蒸餾水調(diào)節(jié)料液比為1∶1（g/mL），升溫至50 ℃，調(diào)節(jié)pH 7.5，按2 000 U/g加入復(fù)合蛋白酶（胰酶與木瓜蛋白酶固定活力比為2∶1）保溫酶解2 h后，沸水浴10 min滅酶，冷卻至室溫，以8 000 r/min離心10 min，取上清，加入1%的活性炭吸附0.5 h，0.22 μm膜過(guò)濾，冷凍干燥得牡蠣肽樣品。

1.3.2 酶解條件優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

在牡蠣酶解基本工藝的基礎(chǔ)上，以水解度為指標(biāo)，分別考察不同加酶量（1 000，2 000，3 000，4 000和5 000 U/g）、料液比（1∶0，1∶0.5，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和1∶5（g/mL））、酶解溫度（40，45，50，55，60和65 ℃）、酶解pH（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0）、酶解時(shí)間（1，2，3，4，5，6，7和8 h）對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

以水解度為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken原理進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。4個(gè)因素分別為加酶量（3 000，4 000和5 000 U/g）、酶解溫度（40，50和60 ℃）、酶解pH（6.0，7.0和8.0）、酶解時(shí)間（3，4和5 h）。

1.3.3 水解度的測(cè)定

酶解液總氮含量采用凱氏定氮法[8]測(cè)定，氨基酸態(tài)氮含量采用中性甲醛滴定法[9]測(cè)定。水解度按式（1）計(jì)算。

1.3.4 牡蠣肽分子質(zhì)量測(cè)定

參照鄒琳[10]的方法，略作修改。采用凝膠滲透色譜（GPC）法測(cè)定牡蠣肽分子質(zhì)量分布。色譜條件：流動(dòng)相體積比為V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=40∶60∶0.05；使用TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）色譜柱；進(jìn)樣體積10 μL；流速1.00 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。所得數(shù)據(jù)用GPC軟件分析，獲得牡蠣肽的分子質(zhì)量分布。

1.3.5 牡蠣肽氨基酸組成分析

牡蠣肽樣品經(jīng)酸水解后，用全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測(cè)除色氨酸之外的17種氨基酸[11]，色氨酸采用比色法[9]測(cè)定。

1.3.6 牡蠣肽氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

根據(jù)FAO/WHO建議的氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行氨基酸評(píng)分（amino acid score，ASS）[12]，以標(biāo)準(zhǔn)全雞蛋蛋白質(zhì)氨基酸含量為基準(zhǔn)進(jìn)行化學(xué)評(píng)分（chemical score，CS），計(jì)算必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）[16]。具體計(jì)算方法如式（2）～（4）所示。

式中：n為必需氨基酸數(shù)目；a，b，c，…，h為樣品中必需氨基酸的含量，mg/g；A，B，C，…，H為標(biāo)準(zhǔn)全雞蛋蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)必需氨基酸含量，mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1（a）可知，在加酶量1 000～5 000 U/g的范圍內(nèi)，水解度隨加酶量的增加呈先升高后平緩的趨勢(shì)。底物充足時(shí)，增加酶量可以提高酶與底物的接觸率，水解度升高；當(dāng)加酶量達(dá)到4 000 U/g時(shí)，繼續(xù)增加酶量，酶解速率受底物量制約，水解度增加不明顯。

由圖1（b）可知，料液比較小時(shí)底物濃度高，底物堆積影響水解效率[17]；當(dāng)料液比為1∶2（g/mL）時(shí)水解度最高，料液比繼續(xù)增大，底物濃度降低，影響底物與酶結(jié)合效率，水解度降低。

由圖1（c）可知，在40～65 ℃的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，水解度呈現(xiàn)先小幅升高后降低的趨勢(shì)；50 ℃時(shí)水解度最大（25.62%），在45～55 ℃溫度范圍內(nèi)，水解度維持在較高水平，為復(fù)合酶的適宜酶解溫度范圍；溫度繼續(xù)升高，酶變構(gòu)失活，水解度急劇降低。

pH影響酶活性中心的構(gòu)象，從而影響酶和底物的特異性結(jié)合，過(guò)酸或過(guò)堿均會(huì)降低酶活。由圖1（d）可知，在pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)，水解度隨pH增加先升高后降低，當(dāng)pH為7.0時(shí)水解度最高，即復(fù)合酶的最佳酶解pH為7。

由圖1（e）可知，水解度隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)先增加后穩(wěn)定。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，體系游離氨基酸含量增加，水解度持續(xù)上升，在4 h時(shí)達(dá)到最大；繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，底物繼續(xù)消耗，底物與酶的接觸率下降，導(dǎo)致水解變慢，水解度增勢(shì)變緩，因此最佳酶解時(shí)間為4 h。

圖1 各因素對(duì)水解度的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果及模型分析

按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，共進(jìn)行29組試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert軟件進(jìn)行回歸分析，得到的預(yù)測(cè)模型為Y=+28.26+2.07A-0.82B-1.17C+1.86D-0.49AB+0.29AC-1.13AD-0.98BC-0.23BD+0.040CD-0.44A2-3.49B2-1.97C2-0.55D2。

對(duì)上述模型及各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2?；貧w模型整體極顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.221 3＞0.05），證明試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，模型擬合度高。R2=0.957 6，說(shuō)明此回歸模型擬合較好；R2Adj=0.915 2，表明該模型可以解釋91.52%的響應(yīng)值變化。該模型中，一次項(xiàng)A、B、C、D，二次項(xiàng)B2、C2對(duì)水解度的影響極顯著（p＜0.01），交互項(xiàng)AD、BC對(duì)水解度的影響顯著（p＜0.05），其余各項(xiàng)不顯著。

表2 回歸模型方差分析與顯著性檢驗(yàn)

2.2.2 交互作用分析

響應(yīng)面在水平方向投影形成的等高線形狀可以反映交互作用強(qiáng)弱，等高線形狀呈橢圓形代表交互作用較強(qiáng)[14]。圖2為各因素交互作用的響應(yīng)面圖，可以看出，加酶量（A）和酶解時(shí)間（D）、酶解溫度（B）和酶解pH（C）交互作用顯著，交互作用分析結(jié)果與方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

2.2.3 最優(yōu)條件預(yù)測(cè)及檢驗(yàn)

根據(jù)上述回歸模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為加酶量4 999.99 U/g，酶解溫度48.14 ℃，酶解pH 6.83，酶解時(shí)間4.69 h；預(yù)測(cè)最優(yōu)條件下水解度為30.34%。為方便試驗(yàn)，將上述條件調(diào)整為加酶量5 000 U/g，酶解溫度48.1 ℃，酶解pH 6.8，酶解時(shí)間4.7 h；在此條件下，實(shí)際測(cè)得的水解值為30.65%，與預(yù)測(cè)結(jié)果相差較小，證明響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。

2.3 產(chǎn)物分子質(zhì)量測(cè)定

分子質(zhì)量＜1 000 Da的肽被稱為寡肽或低聚肽，研究表明二肽、三肽等寡肽可以直接被人體吸收[15]，證明寡肽具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

由圖3可知，該牡蠣肽的重均分子量（MW）為948 Da，99.66%以上的牡蠣肽分子質(zhì)量在5 000 Da以下，分子質(zhì)量低于1 000 Da的占65.61%，表明復(fù)合酶酶解效果優(yōu)異，獲得的牡蠣肽分子質(zhì)量較小，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的潛在生物活性。姚玉靜等[16]利用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解制備牡蠣肽，產(chǎn)物中分子質(zhì)量＜1 000 Da的多肽占50.1%，分子質(zhì)量＜3 000 Da的多肽占83.5%，與此次研究結(jié)果相近。

圖3 牡蠣肽的凝膠滲透色譜圖

2.4 氨基酸組成分析及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

2.4.1 氨基酸組成分析

由表3可知，牡蠣肽中共鑒定出18種氨基酸，氨基酸種類齊全，其中8種必需氨基酸占總含量的38.10%，接近FAO的理想模式（40%），必需氨基酸/非必需氨基酸為61.55%，說(shuō)明該牡蠣肽是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白來(lái)源。牡蠣肽中6種鮮味氨基酸齊全，鮮味氨基酸含量占氨基酸總量的46.5%，其中Glu含量最高，占總氨基酸含量的14.87%，可見(jiàn)該牡蠣肽具有鮮美的風(fēng)味。

2.4.2 氨基酸質(zhì)量評(píng)價(jià)

牡蠣肽的氨基酸評(píng)分（ASS）及化學(xué)評(píng)分（CS）計(jì)算結(jié)果如表4所示。以ASS為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，各氨基酸評(píng)分均大于或接近100，評(píng)分最高的是Lys，其ASS評(píng)分為147.6；以CS為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，第一限制性氨基酸為Met+Cys，第二限制性氨基酸為Trp，評(píng)分最高的是Lys，其CS評(píng)分為123.03。FAO/WHO規(guī)定EAAI≥85時(shí)，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白源，本研究所得牡蠣肽EAAI為91.68，必需氨基酸含量高且與理想氨基酸組成接近，可以作為優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。

表3 牡蠣肽的氨基酸組成

表4 牡蠣肽中必需氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

此次研究?jī)?yōu)化了復(fù)合酶法制備牡蠣肽的工藝，使用胰酶和木瓜蛋白酶酶解牡蠣制備牡蠣肽，以水解度為檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析，確定最優(yōu)酶解工藝參數(shù)：加酶量5 000 U/g，料液比1∶2（g/mL），酶解溫度48.1 ℃，酶解pH 6.8，酶解時(shí)間4.7 h；最大理論水解度為30.34%，實(shí)際值為30.65%，證明響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。產(chǎn)物主要為分子質(zhì)量＜1 000 Da的寡肽，表明該工藝可實(shí)現(xiàn)對(duì)牡蠣的高效酶解。牡蠣肽中18種氨基酸齊全，必需氨基酸和鮮味氨基酸含量高，各必需氨基酸評(píng)分均高于或接近FAO/WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)模式，EAAI為91.68，表明該牡蠣肽具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和鮮美風(fēng)味，可用于開(kāi)發(fā)牡蠣肽功能食品、調(diào)味品等，對(duì)于實(shí)現(xiàn)牡蠣的高值化利用有重要參考價(jià)值。