衍生化氣相色譜-質(zhì)譜法測定復墾土地樣品中19種酚類污染物

李忠煜，李艷廣，黎衛(wèi)亮，汪雙雙，趙江華

（中國地質(zhì)調(diào)查局西安地質(zhì)調(diào)查中心，陜西 西安710054）

土地復墾是指對在生產(chǎn)建設(shè)過程中，因挖損、塌陷、壓占等造成破壞的土地，采取整治措施，使其恢復到可供利用狀態(tài)的活動［1］，主要涉及礦產(chǎn)資源開采、化工產(chǎn)業(yè)、燃煤發(fā)電等［2-3］。復墾土地樣品的特點是樣品基質(zhì)復雜，干擾因素較多，前處理困難，污染物種類多，遷移規(guī)律復雜，各類指標檢出率高［4-5］。隨著“綠水青山”的理念深入人心，全社會對環(huán)保的重視程度越來越高，復墾土地的質(zhì)量評價中對各類污染物檢出限的要求也更加嚴格［6-7］。目前各類污染物指標中，酚類污染物的色譜直接檢測方法，存在色譜響應值低、易揮發(fā)、穩(wěn)定性與回收率差等問題［8］。低濃度樣品測定難度較大，有待研究改進。

酚類化合物是一類中等強度的化學毒物，與細胞原漿中的蛋白質(zhì)發(fā)生化學反應［9］，可經(jīng)皮膚粘膜、呼吸道及消化道進入體內(nèi)［10-11］。低濃度可引起蓄積性慢性中毒，高濃度可引起急性中毒以致昏迷死亡［12-13］。環(huán)境中的酚污染主要是指酚類化合物對水體土壤的污染，含酚廢水是當今世界危害大、污染范圍廣的工業(yè)廢水之一［14］。在許多工業(yè)領(lǐng)域諸如采礦、焦化、煉油、冶金、石油化工、化學合成業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)藥、油漆等工業(yè)排出的廢水中均含有酚類化合物［15］。

根據(jù)酚類化合物的性質(zhì)，可采用氣相色譜、液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［16-18］以及4-氨基安替比林分光光度法［19］（HJ/T 32—1999）對其進行測定。其中，氣相色譜法［20-21］的方法檢出限為10～60 μg/kg，液相色譜法［22-23］的方法檢出限為10～50 μg/kg，氣相色譜-質(zhì)譜法［24-26］的方法檢出限為9.60～480μg/kg?？梢姡苯訙y定的檢出限較高且范圍較寬，難以滿足痕量檢測的需要。酚類化合物在氣相色譜檢測器或質(zhì)譜上的響應值比較低，為實現(xiàn)更低的檢出限，可采用衍生化的方法進行測定［27］。常見的衍生化方法有：酰化衍生，多采用七氟丁酸酐或者乙酸酐作為衍生試劑［28-29］；烷基化衍生，試劑主要為重氮甲烷、五氟芐基溴（PFB）［30-31］；硅烷基化衍生，常用的試劑為三甲基硅烷（TMS）［32-33］；溴化反應，采用酸性條件下KBr-KBrO3溶液為衍生化試劑［34］。各衍生化試劑都可以提高酚類的色譜相應值，同樣也各有缺點，如三甲基衍生物不穩(wěn)定、易分解；酰化、溴化反應衍生物對色譜柱有傷害；五氟芐基溴對人有刺激性等。本文針對復墾土地樣品基質(zhì)復雜、干擾因素多、前處理困難等特點，對該類樣品的提取與凈化方法進行篩選優(yōu)化。根據(jù)酚類污染物檢測中檢出限高、范圍大、重現(xiàn)性差等問題，通過衍生化與非衍生化效果的對比、衍生化條件優(yōu)化、實際樣品測定等方面，建立了復墾土地樣品酚類污染物的衍生化氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和主要試劑

ASE350加速溶劑萃取儀（美國ThermoFisher公司）：配24位萃取盤，不銹鋼萃取池。

TRACE2000 DSQ 氣相色譜-質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher公司）：配色譜柱（長30m，內(nèi)徑0.25mm，固定相液膜厚度0.25μm，固定相為5% -苯基-甲基聚硅氧烷）。

酚類化合物混合標準溶液：濃度為1000mg/L（美國O2si smart solutions公司）。替代物標準溶液：兩種替代物混合標準溶液，濃度為1000mg/L（美國O2si smart solutions公司）。內(nèi)標：苊-d10，濃度為1000mg/L（美國O2si smart solutions公司）。

衍生化試劑：五氟芐基溴（C7H2BrF5），規(guī)格為5g，98%（Alfa Aesar公司）。ρ＝0.05g/mL。稱取0.5g五氟芐基溴，溶于丙酮，并定容在10.0mL容量瓶中，4℃下避光冷藏，待用。

碳酸鉀溶液（ρ＝0.1g/mL）：稱取1g碳酸鉀（丙酮浸泡清洗并氮氣吹干）溶于水中，定容至10.0mL，待用。

無水硫酸鈉、粒狀硅藻土：置于馬弗爐中450℃烘4h，冷卻后裝入干燥器中保存。

正己烷、丙酮、二氯甲烷等均為色譜純（美國J.T.Baker公司）。

1.2 實驗樣品

復墾土地樣品：采自陜西某金屬礦區(qū)的復墾土地。采集地表50cm以下、粒徑小于0.425mm的土壤樣品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

索氏提取［35-36］：稱取5g土壤樣品，加入替代物使用液，所有樣品轉(zhuǎn)入紙質(zhì)套筒，置于索氏提取器回流管中，在圓底溶劑瓶中加入120mL正己烷-丙酮（體積比1∶1）混合溶劑，提取16～18h，回流速度控制在每小時4～6次，收集提取液。

超聲波提?。?7-38］：稱取5g土壤樣品，加入替代物使用液，添加30mL正己烷-丙酮（1∶1）混合溶劑，所有樣品加入具塞比色管中，超聲提取15min，將提取液倒入氮吹瓶中，再次添加30mL正己烷-丙酮（1∶1）混合溶劑，超聲提取15min，然后加入20mL正己烷-丙酮（1∶1）混合溶劑洗滌一次，合并提取液。

加速溶劑萃?。?9-41］：稱取5g土壤樣品于34mL萃取池中，加入替代物使用液，加入填充劑（粒狀硅藻土）與干燥劑（無水硫酸鈉）。萃取溶劑為正己烷-丙酮（1∶1）混合溶液，溫度100℃，壓力1500psi，靜態(tài)萃取時間5min，溶劑淋洗體積為60%池體積，循環(huán)2次，吹掃時間60s，收集提取液。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮：將萃取液轉(zhuǎn)入合適體積的圓底燒瓶，濃縮至2mL左右，轉(zhuǎn)出提取液，用正己烷清洗3次圓底燒瓶，溶液轉(zhuǎn)移至濃縮管合并。再用小流量氮氣濃縮至3～5mL，待衍生化。

氮吹濃縮：萃取液轉(zhuǎn)入濃縮管中，開啟氮吹濃縮。氮吹過程中應將已經(jīng)露出的濃縮器管壁用正己烷反復多次洗滌。濃縮至3～5mL，待衍生化。

衍生化：在濃縮液中加入100μL五氟芐基溴溶液（ρ＝0.05g/mL）和100μL碳酸鉀溶液（ρ＝0.1 g/mL），混勻。加入丙酮使之達到8mL左右，置于60℃水浴中，保持60min，冷卻至室溫。繼續(xù)氮吹濃縮，加入內(nèi)標液，定容至1.0mL，待測。

凈化：如萃取液渾濁或顏色很深，則需要凈化，可采用小柱凈化法［42-43］。具體如下：先用12mL 10%正己烷-二氯甲烷淋洗硅酸鎂小柱（1g/6mL），再用12mL正己烷淋洗，在液面消失前，將萃取液的濃縮液轉(zhuǎn)移至凈化柱中，用少量正己烷洗滌濃縮瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至凈化柱上（注意應始終保持填料上方留有液面），再用12mL 10%正己烷-二氯甲烷洗脫樣品，收集于試管中。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

毛細管色譜柱HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm。氣相色譜條件：進樣口溫度260℃；載氣為氦氣，流速1.0mL/min；不分流進樣，進樣量1.0μL。升溫程序：初始溫度55℃，保持1min，以6℃/min升溫至230℃，保持5min。

質(zhì)譜條件：接口溫度250℃；離子源溫度250℃；電離方式為電子轟擊電離（EI）；電離能量70eV；溶劑延遲15min；選擇離子（SIM）模式。

表1 各組分保留時間、定量離子與輔助離子Table 1 Retention time，quantitative ions and auxiliary ions of each component

各化合物的出峰順序與特征離子見表1與圖1（其中2，4，6-三氯苯酚和2，4，5-三氯苯酚，以及2，3，4，5-四氯酚和2，3，5，6-四氯酚，因無法分離而合并計算），標準曲線見表2。

1.3.3 質(zhì)量控制

所使用的有機試劑均應濃縮后進行空白檢查（濃縮倍數(shù)視分析過程中最大濃縮倍數(shù)而定），試劑空白測試結(jié)果中目標物濃度應低于方法檢出限。用處理過的硅藻土代替樣品，與實際樣品同步分析。測定結(jié)果中目標物濃度應不超過方法檢出限。①基體加標樣品。加標回收率范圍應在70% ～130%之間。每個樣品在稱取之后、處理之前都應加入一定量的替代物，應確定替代物回收率在70% ～130%之間。②重復樣檢查。兩個重復樣品結(jié)果偏差應≤20%，低于方法檢出限的不計。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法篩選

通過對三種前處理方法的方法檢出限、測定下限、加標回收率、精密度，以及各方法在實際操作中的特點進行全面比較，篩選出更合適的前處理方法。

圖1 酚類化合物衍生物總離子流圖Fig.1 Total particle flow diagram of phenolic compounds derivatives

表2 酚類化合物標準曲線Table 2 Calibration curves of phenolic compounds

分別采用索氏提取、超聲波提取、加速溶劑萃?。ˋSE）處理加標后的空白樣品（加標濃度為10 μg/kg），分別將三種方法所得提取液濃縮，經(jīng)硅酸鎂小柱凈化，然后進行衍生化處理，最后濃縮并加入內(nèi)標物定容至1mL。測定并計算酚類化合物的方法檢出限與測定下限（表3）。其中ASE方法的檢出限最低，檢出限范圍最小。原因可能是ASE的提取過程都是在密閉條件下進行，沒有外界干擾，且整個過程由儀器自動完成，樣品處理之間差異相對最小。

在空白土壤樣品中加入一定量的酚類化合物標準品與替代物。使其理論濃度為40μg/kg。稱取5g樣品，分別采用索氏提取、超聲波提取、加速溶劑萃取對樣品進行前處理，每種方法重復6次，比較加標回收率與結(jié)果精密度（表3）。三種處理方法均能滿足試驗要求，綜合比較三種方法的精密度與回收率，ASE處理的效果最好，RSD最小，重現(xiàn)性最好，回收率最高。索氏提取次之，超聲提取最差。又因為索氏提取耗時最長，消耗溶劑最多，因此選擇ASE為最佳前處理方法。

2.2 衍生化與非衍生化對比

氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析酚類化合物，在不衍生情況下，表現(xiàn)在色譜圖上的響應值比較低，各組分峰面積（峰高）差距很大。配制標準曲線的最低濃度一般為1～5mg/L，導致各組分的檢出限不夠低，差距也很大，導致檢出限范圍非常寬泛，甚至相差一個數(shù)量級以上。而衍生后信號強度較高，峰高更均衡（圖1），檢出限范圍更為合理。

根據(jù)文獻與相關(guān)標準方法記載，非衍生化檢測酚類化合物的檢出限一般在10～80μg/kg的范圍之內(nèi)。例如，《全國土壤污染狀況詳查 土壤樣品分析測試方法技術(shù)規(guī)定》發(fā)布稿中提到的酚類化合物檢出限為20～80μg/kg。楊麗莉等［20］采用超聲波提取氣相色譜法測定土壤中21種酚類化合物，檢出限為10～60μg/kg。本文按照上述方法，采用ASE處理加標后的空白樣品（加標濃度分別為200μg/kg、10μg/kg）。重復7次，測定并計算方法檢出限，得到非衍生酚類化合物檢出限為12.5～51.0μg/kg，衍生化檢出限為0.67～3.95μg/kg。衍生化之后，雖然增加了分析步驟，但方法檢出限以及精密度明顯優(yōu)于非衍生方法。

表3 三種提取方法的檢出限、測定下限與精密度與回收率情況Table 3 Detection limit，determination lower limit，precision and recovery of the three extraction methods

2.3 衍生化方法優(yōu)化

2.3.1 衍生化試劑的選擇

酚類化合物的衍生化思路有烷基化、酰基化、硅烷基化等［27］。常用的衍生化試劑有五氟芐基溴、三甲基硅烷、四氯鄰甲氧基苯酚等。各類衍生化試劑各有優(yōu)劣，但都能滿足測試要求。已有研究［28-34］表明，三甲基硅烷衍生物具有熱穩(wěn)定好、揮發(fā)性強、易于制備及色譜性能好等優(yōu)點。但三甲基衍生物對水和酸不穩(wěn)定，易分解，容易被提取液中水分影響。酰化反應的效果也很好，但使用的試劑對儀器及色譜柱的傷害較大。烷基化衍生檢測法比較成熟，常用衍生試劑為五氟芐基溴，其缺點是衍生物在質(zhì)譜中基峰單一，不利于定性。另外，五氟芐基溴為有毒化學試劑，對檢測人員的眼睛具有較強的刺激性。其中，五氟芐基溴衍生物的缺點較容易解決，操作時可保持佩戴手套、護目鏡并在通風柜中進行。綜合分析，三種方法各有優(yōu)劣，考慮到測定準確性與色譜柱壽命等方面，本方法選用五氟芐基溴作為衍生化試劑。

2.3.2 衍生化溫度的優(yōu)化（兩種替代物）

分別在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃溫度下進行衍生化反應，時間控制在1h。利用兩種替代物回收率計算衍生化反應效率（圖2）。結(jié)果表明，替代物回收率隨溫度升高而增加，溫度超過55℃，處理后的液體中已基本沒有殘余的酚類物質(zhì)。并且，替代物加標回收率（91%和93%）也滿足檢測要求，而溫度超過60℃萃取液極易沸騰，導致溶劑損失過快。又因為在水浴鍋中反應，溫度控制較為困難，因此溫度設(shè)定在55～60℃之間即可，無需過于精確。

2.3.3 衍生化時間的確定

準備7個加標樣品進行前處理，并按上述方法進行衍生化反應。從第10min開始濃縮處理，并計算替代物回收率（圖3）。結(jié)果顯示，替代物回收率隨時間增加而增加，反應時間超過50min后，兩種替代物回收率分別為89%與87%，已經(jīng)可以滿足檢測要求，而時間達到60min衍生反應基本完成，處理液中幾乎沒有殘余的酚類物質(zhì)。因此，衍生化時間確定為60min。

2.3.4 衍生化試劑的用量

圖2 不同溫度下衍生化的替代物回收率變化Fig.2 Changes in the recovery of substitutes derived at different temperature

圖3 衍生化時間對替代物回收率的影響Fig.3 Effect of derivation time on the recovery of substitutes

關(guān)于五氟芐基溴與碳酸鉀的加入量，主要考慮的是確保曲線最高濃度也能快速、完全反應，以及可適用于高濃度實際樣品。而碳酸鉀的作用是消耗反應生成物，加速衍生化反應進行，因此需要兩種衍生化試劑遠遠過量即可。通過試驗，確定過量10倍左右較為合適。通過計算，將衍生物加入量定為各100μL（五氟芐基溴濃度50mg/mL，碳酸鉀濃度100mg/mL）。

2.4 方法檢出限、基質(zhì)加標回收率與精密度

采用ASE處理加標后的空白樣品（加標濃度為10μg/kg），重復7次測定并計算酚類化合物的方法檢出限，得到的方法檢出限為0.67～3.95μg/kg，測定下限為2.68～15.8μg/kg（表4）。五氟芐基溴衍生化產(chǎn)物，相較原酚類化合物增加了大分子量基團，提升了衍生物的穩(wěn)定性，也提高了質(zhì)譜響應值，與“全國土壤污染狀況詳查土壤樣品分析測試方法”、楊麗 莉 等［20］、Helaleh等［44］研 究 結(jié) 果（10～80 μg/kg）相比顯著降低了檢出限。

對復墾土地樣品進行基質(zhì)加標回收率實驗，三個加標濃度分別為40μg/kg、100μg/kg、200μg/kg。每個濃度樣品重復6次，分析結(jié)果見表5?？梢钥闯?，高濃度回收率范圍為73.6% ～103.0%，相對標準偏差（RSD）為2.1%～9.6%；中間濃度回收率范圍為73.3%～88.5%，RSD為1.7% ～9.5%；低濃度回收率范圍為75.4%～107.0%，RSD為3.7%～6.6%。實驗結(jié)果表明，ASE提取方法對高、中、低三種濃度的基質(zhì)加標樣品的回收率都在70.0% ～130.0%之間，并且RSD均小于10%，結(jié)果滿意。

表4 酚類化合物衍生化方法檢出限Table 4 Detection limits of phenolic compounds by derivativation method

表5 酚類化合物加標回收率和精密度Table 5 Spiked recovery and precision tests of phenolic compounds

2.5 復墾土地實際樣品酚類化合物檢測情況

按照優(yōu)化后的方法對采自陜西某金屬礦區(qū)復墾土地采集的實際樣品進行分析。首先將采集的樣品陰干、敲碎、過篩，并收集粒徑小于0.425mm的部分。稱取5g樣品，加入兩種替代物使其理論濃度為100μg/kg，拌入5g無水硫酸鈉，裝入萃取池，用粒裝硅藻土填充空隙。按照ASE萃取條件進行提取。提取液濃縮后用硅酸鎂小柱凈化，凈化后的溶液再次濃縮至3mL左右，丙酮定容至8mL。按照優(yōu)化后的方法進行衍生化。然后濃縮至1mL以下加入內(nèi)標物定容至1mL，用氣相色譜-質(zhì)譜儀測定，結(jié)果見表6。

表6 金屬礦區(qū)復墾土地樣品酚類化合物檢測結(jié)果Table 6 Analytical results of phenolic compounds in dreclaimed land samples from metalmining areas

兩種替代物回收率分別是102%、90.6%與87.6%、93.7%，重復樣品的相對偏差（2.3% ～10%）均小于20%，并且低濃度組分結(jié)果穩(wěn)定，最終測定結(jié)果滿意，說明該方法適用于復墾土地樣品酚類污染物的分析檢測。

3 結(jié)論

本文針對目前復墾土地（土壤）樣品中酚類污染物檢測的問題，采用衍生化-氣相色譜質(zhì)譜法進行測定。比對篩選樣品提取方法，優(yōu)化并確定了衍生化試劑與條件等參數(shù)，規(guī)定了質(zhì)量控制方法。該方法較之非衍生化方法檢出限更低，衍生物色譜響應值提高，各化合物的峰面積（峰高）更均衡。衍生化反應的選擇性與質(zhì)譜的選擇離子模式分析，更能避免雜質(zhì)與其他組分的干擾。實際樣品的分析結(jié)果表明，該方法更適用于復墾土地以及各類復雜基質(zhì)土壤與固體廢物樣品中的痕量酚類污染物檢測。

目前衍生化測試方法的應用已較為成熟，操作容易，便于推廣，具有廣闊的應用前景。關(guān)于如何進一步簡化衍生化步驟，提高分析效率，甚至尋找更適合的衍生化試劑等方面，還有待進一步研究。