UPLC 法測定維C 銀翹片中6 種有效成分的含量

周亞菁，沈于蘭

無錫市藥品安全檢驗檢測中心，無錫 214028

維C 銀翹片是由山銀花、連翹、牛蒡子、甘草等10 味中藥加入對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、維生素C 等3 種化學(xué)藥加工而成的復(fù)方制劑[1]，本品臨床主要用于治療流行性感冒引起的發(fā)熱、頭疼、咳嗽、口干、咽喉疼痛等癥[2]。《中國藥典》2015 年版對維C銀翹片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中分別采用高效液相色譜（HPLC）法測定綠原酸、牛蒡苷、維生素C、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏含量，其測定的5 種成分采用幾種不同的流動相系統(tǒng)分別檢測，實際操作繁瑣、工作效率低[3]，且未對甘草和連翹兩味中藥進行質(zhì)量控制。

目前尚未有文獻報道采用UPLC 法同時測定維C 銀翹片中的多種成分。現(xiàn)采用UPLC 梯度洗脫，同時測定維C 銀翹片中6 種成分（維生素C、對乙酰氨基酚、綠原酸、甘草苷、連翹苷、牛蒡苷）的含量，與藥典方法相比，少了馬來酸氯苯那敏的測定，增加了連翹苷、牛蒡苷的測定，優(yōu)化了質(zhì)量控制方法。

1 儀器與藥品、試劑

UPLC（美國Waters 公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

樣品：市售維C 銀翹片：（廠家A：批號：C20180723、廠家B：批號：181032、廠家C：批號：180356）；規(guī)格：每片含維生素C 49.5 mg、對乙酰氨基酚105 mg、馬來酸氯苯那敏1.05 mg。

對照品：維生素C（批號：100425-201504，純度：100%）、對乙酰氨基酚（批號：100018-201610，純度：99.9%）、綠原酸（批號：110753-201817，純度：96.8%）、甘草苷（批號：111610-201908，純度：95.0%）、連翹苷（批號：110821-201816，純度：95.1%）、牛蒡苷（批號：110819-201812，純度：95.0%），均購于中國食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲酸為色譜級；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜柱：Thermo BDS Hypersil C18（4.6 mm ×100 mm，3.0 μm）；流動相：水（A），0.1%甲酸－乙腈（B），梯度洗脫：0～8 min、2%～15%B，8～25 min、15%～30%B，25～40 min、30%～5%B，40～45 min、5%～2%B；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.2 mL·min-1；進樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液分別精密稱取綠原酸對照品10.416 mg，置5 mL 量瓶中；甘草苷對照品4.872 mg，置50mL 量瓶中；連翹苷對照品17.962mg，置100mL量瓶中；牛蒡苷對照品18.240 mg，置5 mL 量瓶中；分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸、甘草苷、連翹苷、牛蒡苷的對照品貯備液。

精密稱取維生素C 對照品68.84 mg，對乙酰氨基酚對照品155.14 mg，再精密加入綠原酸、甘草苷、連翹苷、牛蒡苷對照品貯備液各2 mL 置同一20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為維生素C 3.442 mg·mL-1、對乙酰氨基酚7.749 mg·mL-1、綠原酸0.202 mg·mL-1、甘草苷0.00926 mg·mL-1、連翹苷0.0171 mg·mL-1、牛蒡苷0.347 mg·mL-1的混合對照品貯備液。

精密量取混合對照品貯備液5.0 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取同一批號的維C 銀翹片（廠家A：批號：C20180723）20 片，除去包衣，研細，精密稱取細粉約0.25 g，置15 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲振蕩30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 結(jié)果

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗及專屬性考察分別精密量取混合對照品溶液、供試品溶液和單一對照品溶液各2 μL，在“2.1”色譜條件下，分別注入液相色譜儀。

以供試品溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，結(jié)果表明，維生素C、對乙酰氨基酚、綠原酸、甘草苷、連翹苷、牛蒡苷6 個成分峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，達到基線分離。理論塔板數(shù)按維生素C 峰和牛蒡苷峰計算均不低于8000。

供試品溶液在與6 種對照品色譜相應(yīng)位置上出現(xiàn)一一對應(yīng)的色譜峰，相應(yīng)的DAD 譜圖一致，表明方法專屬性良好。見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察分別精密量取“2.2”項下混合對照品貯備液0.5、1.0、2.0、5.0、7.0 mL，置10 mL量瓶中，制成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“2.1”色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）和濃度（X，μg·mL-1）作線性回歸，得線性方程和相關(guān)系數(shù)，見表1。6 種成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 （A）混合對照品溶液、（B）供試品溶液UPLC 色譜圖

2.3.3 檢測限和定量限以信噪比（S/N）3 作為檢測限（LOD），信噪比（S/N）10 作為定量限（LOQ），取“2.2.1”項下制備的對照品儲備液，用甲醇稀釋不同比例后進樣測定6 種成分的檢測限和定量限。見表1。

表1 6 種成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限、定量限結(jié)果

2.3.4 進樣精密度試驗精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積，計算RSD（n=6）。維生素C、對乙酰氨基酚、綠原酸、甘草苷、連翹苷、牛蒡苷的峰面積的RSD 分別為1.3%、0.8%、1.0%、0.7%、1.3%、0.9%。表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗取同一批號的維C 銀翹片（廠家A：批號：C20180723），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6 份。按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算各成分含量。計算得維生素C、對乙酰氨基酚、綠原酸、甘草苷、連翹苷、牛蒡苷的平均含量分別為51.78、106.08、1.95、0.098、0.23、4.17 mg·片-1，RSD（n=6）分別為0.5%、1.0%、0.3%、1.1%、1.8%、1.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗取同一批號的維C 銀翹片（廠家A：批號：C20180723），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h 測定。維生素C、對乙酰氨基酚、綠原酸、甘草苷、連翹苷、牛蒡苷的峰面積的RSD（n=5）分別為0.9%、0.8%、1.3%、1.1%、1.5%、1.3%。表明6 種成分在室溫放置12 h 均穩(wěn)定。

2.3.7 回收率試驗精密稱取已知各成分含量的維C 銀翹片（廠家A：批號：C20180723）細粉約0.125 g，置15 mL 量瓶中，分別精密加入已知濃度的對照品貯備液（維生素C 2.180 mg·mL-1、對乙酰氨基酚4.391 mg·mL-1、綠原酸0.0807 mg·mL-1、甘草苷0.00463 mg·mL-1、連翹苷0.00855 mg·mL-1、牛蒡苷0.173 mg·mL-1）高、中、低濃度各9、7.5、6 mL，每個濃度各3 份，按“2.1 項”下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得各成分的含量，計算回收率，維生素C、對乙酰氨基酚、綠原酸、甘草苷、連翹苷、牛蒡苷的平均回收率依次為99.3536%、98.7488%、97.0363%、93.5348%、101.5961%、96.2097%。

2.3.8 樣品測定取樣品3 批，按“2.2”項下制備供試品溶液，分別將混合對照品溶液和供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

因為維C 銀翹片中所測6 種成分極性差異較大，為了達到同時分析的效果，在190～400 nm 內(nèi)進行全波長掃描，綜合分析各成分的最大吸收波長，最終選取280 nm 作為檢測波長。在此波長下6 種成分均具有較好的色譜吸收，且在樣品中與相鄰的色譜峰可以達到良好基線分離，符合含量檢測的要求。

3.2 供試品制備方法的選擇

綜合考慮所測6 種成分的理化特性[4]，它們在水中的溶解度均較小，易溶于甲醇，分別考察了50%甲醇、80%甲醇和純甲醇溶解稀釋樣品，并考察不同超聲時間（30、45、60 min）的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用純甲醇提取樣品，超聲處理30 min，各組分色譜分離度良好，能保證各成分提取完全，干擾少。

3.3 與《中國藥典》2015 年版方法的比較

在《中國藥典》2015 年版一部中規(guī)定：每片含綠原酸、牛蒡苷分別應(yīng)不得少于1.5 mg、2.5 mg；所含維生素C、對乙酰氨基酚應(yīng)為標(biāo)示量的90%～110%。采用此藥典方法檢測維C 銀翹片，結(jié)果見表3。

表3 《中國藥典》方法結(jié)果

對比表2 所測4 種成分結(jié)果，本法與藥典法的4 種成分的含量測定結(jié)果基本一致。

4 小 結(jié)

建立了UPLC 法測定維C 銀翹片中多指標(biāo)成分的含量，解決了HPLC 法分析時間長、耗用試劑量大的缺點，操作簡便、有機溶劑消耗少、靈敏度高、重現(xiàn)性好，對維C 銀翹片的質(zhì)量控制方法作了優(yōu)化。