VEGFR1下調(diào)對Aβ1-42誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老及PI3K信號通路的影響

劉潔

阿爾茨海默病是一種起病隱匿的進行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生于>85歲的老人[1]，對老年人的晚年身體健康及精神健康造成嚴(yán)重傷害，給社會和家庭帶來了極大負(fù)擔(dān)。研究表明阿爾茨海默病發(fā)病與Aβ1-42 (amyloid β1-42，Aβ1-42)在腦血管內(nèi)皮沉積，導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老死亡有關(guān)[2]。血管衰老會改變血管的形態(tài)和功能，如：血管內(nèi)膜增厚以及內(nèi)皮功能失調(diào)等[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)皮的主要成分，對血管的生成、收縮等具有重要調(diào)節(jié)作用，可一定程度維持血管系統(tǒng)穩(wěn)定[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial grow the factor,VEGF)是機體內(nèi)最重要的血管生成因子[5]，可與血管內(nèi)皮生長因子受體1(vascular endothelial growth factor receptor1，VEGFR1)結(jié)合促進新生血管生成。研究表明PI3K/Akt/mTOR信號軸中效應(yīng)分子p-Akt、p-mTOR等蛋白在嬰幼兒增生期血管瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于消退期，對血管生成具有重要作用[6]。本研究通過沉默VEGFR1基因在HBMEC細(xì)胞中表達(dá)并用Aβ1-42誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，檢測4組細(xì)胞的衰老及VEGFR1、PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探討VEGFR1在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC，產(chǎn)品編號為CL0116，購自豐暉生物有限公司；pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒，貨號：pGPU6/GFP/Neo，購自BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心。

1.2 儀器與試劑 Aβ1-42多肽，貨號：04010011827，規(guī)格：5 mg，95%，購自蘇州強耀生物科技有限公司；人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽(Cell Counting Kit-8，CCK-8)ELISA Kit，貨號：69-80160，購自武漢默沙克生物科技有限公司； β-半乳糖苷酶染色試劑盒，貨號：G1580-100T，購自北京索萊寶有限公司；LipofectaminTM 2000，貨號為：rs374987523，購自美國Invitrogen公司；鼠抗人VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K單克隆抗體購自于美國Sigma公司，貨號分別為：RAB1088、RAB1435、RAB1517、RAB1532；PVDF膜購于上海生工生物工程有限公司，貨號：F619537；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗購自于上海生工生物工程有限公司，貨號：D110098；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Thermo公司，貨號分別為：C510003、C503021；蛋白凝膠成像儀，購自Bio-Red公司，型號：Gel Doc XR+；Attune NxT 流式細(xì)胞儀，型號：Attune NxT，購自ThermoFisher公司。

1.3 方法

1.3.1 靶向VEGFR1寡核苷酸的設(shè)計與合成:參考siRNA設(shè)計原則[2,5]，設(shè)計了3條針對VEGFR1的siRNA(VEGFR1 siRNA-1、-2、-3)，另設(shè)計1條無關(guān)序列作為陰性對照。對于每條選定的siRNA序列，設(shè)計2條編碼該序列的單鏈寡核苷酸(single-strand oIigonucleotide，SS oligo)模板，交西安擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建:將合成的SS oligo退火，與經(jīng)過用BamH Ⅰ與Bgl Ⅱ雙酶切的質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo連接，熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，37℃過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:細(xì)胞于37℃、5%CO2、飽和濕度下，用10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期HBMEC細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接種于6孔細(xì)胞板(1×106個/孔)，待細(xì)胞融合度至80%時，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，采用LipofectamineTM3000法進行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，轉(zhuǎn)染后用無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換為含終濃度為50 μmol/LAβ1-42的培養(yǎng)基對細(xì)胞進行處理。實驗分為4組：(1)HBMEC組：不做轉(zhuǎn)染，不用Aβ1-42處理；(2)HBMEC+ Aβ1-42組：不做轉(zhuǎn)染，用Aβ1-42處理；(3)neg+Aβ1-42組：轉(zhuǎn)染攜帶有VEGFR1siRNA-neg質(zhì)粒，用Aβ1-42處理；(4)VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組：轉(zhuǎn)染攜帶有VEGFR1siRNA質(zhì)粒，用Aβ1-42處理，以VEGFR1 siRNA-3干擾效果最優(yōu)，進行后續(xù)實驗。Aβ1-42誘導(dǎo)48 h后，收集4組細(xì)胞，進行后續(xù)實驗。每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力:將1.3.3中的HBMEC+ Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組、VEGFR1siRNA+Aβ1-42組細(xì)胞均加入50 μmol/L Aβ1-42，HBMEC組加入等量的PBS溶液，培養(yǎng)24 h后加入CCK-8 10 μl 繼續(xù)培養(yǎng)1 h。每組設(shè)3個復(fù)孔，酶標(biāo)儀450 nm波長處測定光密度(OD)，以O(shè)D值的大小評價細(xì)胞活力。

1.3.5 Hochest 33342/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況:收集1.3.3中4組細(xì)胞，用Hochest 33342/PI雙染檢測各組HBMEC細(xì)胞凋亡情況，藍(lán)色為正常細(xì)胞，亮藍(lán)色為凋亡細(xì)胞，紅色為死亡細(xì)胞。

1.3.6 β-半乳糖苷酶染色試劑盒(β-Galactosidase Staining Kit)檢測細(xì)胞衰老情況:收集1.3.3中4組細(xì)胞，采用β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測各組HBMEC細(xì)胞衰老情況，衰老細(xì)胞呈藍(lán)色，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.3.7 蛋白印跡(western blot，WB)法檢測細(xì)胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白的表達(dá):按照蛋白提取試劑盒說明書進行提取1.3.3中4組細(xì)胞中的總蛋白，采用BCA蛋白試劑盒對細(xì)胞中總蛋白含量進行測定。采用SDS-PAGE分離等量蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)PVDF膜上，置于4℃下添加VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K一抗及β-actin一抗抗體(1：500)，孵育過夜。洗滌后添加辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)常溫下孵育2 h。采用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)對蛋白水平VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 沉默VEGFR1對4組HBMEC細(xì)胞活力的影響 與HBMEC組比較，HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組、VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)；與HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組相比，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，HBMEC+Aβ1-42組與neg+Aβ1-42組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 沉默VEGFR1對各組HBMEC細(xì)胞活力的影響

2.2 沉默VEGFR1對Aβ1-42誘導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞凋亡的影響 Hochest雙染結(jié)果顯示，HBMEC組細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，幾乎無凋亡細(xì)胞；HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組HBMEC細(xì)胞細(xì)胞核多呈亮藍(lán)色，凋亡細(xì)胞較多，紅色細(xì)胞核幾乎不可見；VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組多數(shù)細(xì)胞細(xì)胞核呈亮藍(lán)色或紅色，凋亡、死亡細(xì)胞進一步增多。見圖1。

圖1 沉默VEGFR1對各組HBMEC細(xì)胞衰老的影響

2.3 沉默VEGFR1對4組HBMEC細(xì)胞衰老的影響 與HBMEC組比較，HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組、VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組均衰老細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)；與HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組比較，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組細(xì)胞衰老比例明顯增高(P<0.05)；HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組衰老細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 沉默VEGFR1對各組HBMEC細(xì)胞衰老的影響

2.4 沉默VEGFR1對各組HBMEC細(xì)胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白的影響 與HBMEC組相比，HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組、VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組細(xì)胞p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，VEGFR1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組相比，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組細(xì)胞p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，VEGFR1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組細(xì)胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖2。

3 討論

阿爾茨海默病是一種嚴(yán)重危害老年人的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，該病的主要病理學(xué)變化是β淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)[7]。研究表明Aβ1-42可作為阿爾茨海默病模型大鼠的誘導(dǎo)劑[8]，Aβ1-42還能夠誘導(dǎo)大鼠衰老，并對大鼠的腦突觸小體造成一定程度的毒性傷害，對加快大鼠腦組織的老化亦具有一定作用[9]。但是Aβ1-42如何對該疾病產(chǎn)生作用目前仍不清楚[10]。本研究結(jié)果顯示，HBMEC組細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，幾乎無凋亡細(xì)胞；Aβ1-42處理后，細(xì)胞核多呈亮藍(lán)色，凋亡細(xì)胞較多，紅色細(xì)胞核幾乎不可見，細(xì)胞存活率下降，衰老凋亡細(xì)胞增多，提示Aβ1-42可成功誘導(dǎo)HBMEC細(xì)胞衰老，促進細(xì)胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，用 VEGFR1 siRNA干擾后，與HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組比較，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組細(xì)胞存活率顯著降低，衰老凋亡細(xì)胞增多，提示沉默VEGFR1基因可進一步促進HBMEC細(xì)胞衰老及凋亡。

表3 沉默VEGFR1對4組HBMEC細(xì)胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR及PI3K蛋白的影響

圖2 WB檢測4組HBMEC細(xì)胞VEGFR1、p-Akt、p-mTOR、PI3K蛋表達(dá);1 HBMEC組；2 HBMEC+Aβ1-42組；3 neg+Aβ1-42組；4 VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組

VEGF屬于血小板衍生生長因子家族的一員，于1989年首次在體外被分離，可與其特異性受體VEGFR結(jié)合后，參與調(diào)節(jié)新生血管增生、誘導(dǎo)血管形成[11-13]。目前已知的VEGFR主要有五種，分別是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、NRP-1和NRP-2[14]。血管內(nèi)皮細(xì)胞中主要包括VEGFR1和VEGFR2，其中VEGFR1既能夠促進微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，又能刺激體內(nèi)新生血管生成，參與多種病理生理過程[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與HBMEC組比較，HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組細(xì)胞中VEGFR1表達(dá)顯著降低，提示Aβ1-42誘導(dǎo)可下調(diào)HBMEC細(xì)胞中VEGFR1表達(dá)，可能與細(xì)胞衰老有關(guān)。本研究進一步采用VEGFR1 siRNA處理HBMEC細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組比較，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組HBMEC細(xì)胞中VEGFR1表達(dá)顯著降低，提示成功沉默VEGFR1基因表達(dá)。

PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threoninekinase，AKT)等多種蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能[17]。研究報道PI3K/Akt信號通路與血管生成密切相關(guān)，陳德才[18]等證明PI3K/AKT信號通路參與血管瘤細(xì)胞的增殖、凋亡過程。PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中VEGFR1表達(dá)[19]，對多種血管生成因子具有調(diào)節(jié)作用，能夠上調(diào)VEGF表達(dá)，調(diào)節(jié)血管生成[20]。本研究結(jié)果顯示，與HBMEC組比較，HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組細(xì)胞中細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR及PI3K蛋白表達(dá)水平降低，提示Aβ1-42可抑制人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路活化。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與HBMEC+Aβ1-42組、neg+Aβ1-42組比較，VEGFR1 siRNA+Aβ1-42組細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR及PI3K蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示沉默VEGFR1可進一步抑制人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路激活，可能與促進Aβ1-42誘導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞衰老有關(guān)。

綜上所述，沉默VEGFR1表達(dá)可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，促進Aβ1-42誘導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞衰老、凋亡程度，提示VEGFR1可能在阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但是其具體作用機制尚需進一步研究。