4種鮭鱒魚外周血細(xì)胞顯微及超微結(jié)構(gòu)比較

陸紹霞， 張春雷，王常安，劉洋，韓世成，劉紅柏

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070)

魚類為低等水生動(dòng)物，易受到生物和非生物因素的影響，所產(chǎn)生的生理或病理變化可通過(guò)血液學(xué)特征反映出來(lái)。黏液免疫和血液免疫是魚類非常重要的免疫機(jī)制，其中，外周血細(xì)胞在特異性、非特異性免疫應(yīng)答過(guò)程中均起著重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，血細(xì)胞的形態(tài)特征與動(dòng)物分類、生理狀況及系統(tǒng)演化方面均有一定的關(guān)系[2-3]，魚類的血細(xì)胞具有吞噬、分泌等功能，可參與機(jī)體的傷口修復(fù)、防御等生理過(guò)程。魚類血細(xì)胞對(duì)自身生理狀況變化和外界環(huán)境因子刺激十分敏感，通過(guò)觀察及測(cè)量血液指標(biāo)可初步判斷魚類的健康情況，為疾病診斷及水域環(huán)境質(zhì)量判定提供參考[4-5]。因此，研究魚類的血細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量和顯微結(jié)構(gòu)在水體生態(tài)環(huán)境監(jiān)控、魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)等方面具有重要的指導(dǎo)作用。

鮭鱒魚是世界上第三大主養(yǎng)魚類，近年來(lái)，關(guān)于鮭鱒魚血細(xì)胞研究中，相關(guān)學(xué)者僅對(duì)二、三倍體山女鱒Oncorhynchusmasou和虹鱒Oncorhynchusmykiss血細(xì)胞的數(shù)量、大小及顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較[6-9]。本試驗(yàn)中，選取白點(diǎn)鮭Salvelinusmalma、紅點(diǎn)鮭Salvelinusleucomaenis、虹鱒及金鱒Oncorhynchusmykiss4種鮭鱒魚作為試驗(yàn)材料，采用瑞氏-姬姆薩混合染色法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)法,觀察并對(duì)比不同鮭鱒魚外周血細(xì)胞的顯微與超微結(jié)構(gòu)及形態(tài)、數(shù)量特征，旨在為鮭鱒魚血液學(xué)和免疫學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用白點(diǎn)鮭(體質(zhì)量49.07 g±12.05 g)、紅點(diǎn)鮭(體質(zhì)量83.23 g±15.07 g)、虹鱒(體質(zhì)量60.12 g±11.86 g)和金鱒(體質(zhì)量42.04 g±10.26 g)各8尾，均為1齡魚，采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚試驗(yàn)站，養(yǎng)殖水溫為7 ℃，選擇健康無(wú)病、活動(dòng)狀態(tài)正常的魚。

1.2 方法

1.2.1 光鏡樣品制備 從每尾魚尾靜脈采集血液，經(jīng)抗凝處理，用Dacie’s稀釋液將血液稀釋200倍和20倍，用于紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)。每尾魚制作血涂片5張， 用瑞氏姬姆薩染液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察血細(xì)胞的形態(tài)特征并拍照，同時(shí)測(cè)量各細(xì)胞的長(zhǎng)徑和短徑，每種細(xì)胞各測(cè)40個(gè)，并在油鏡下對(duì)隨機(jī)視野內(nèi)100個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，計(jì)算各種白細(xì)胞的占比。

1.2.2 電鏡樣品制備 電鏡樣品制備方法借鑒文獻(xiàn)[10]～[12]，略有改進(jìn)。采集魚體尾靜脈血(肝素抗凝處理)，轉(zhuǎn)移至離心管中靜置45 min，以12 000 r/min離心20 min；用移液槍吸取上層血清后，挑取薄薄的一層白細(xì)胞于滅菌離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為3.0%的戊二醛固定液(用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液配制)5 mL固定1 d；用PBS沖洗3次，4 ℃下以3 000 r/min離心3 min，每次間隔12 min；用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸固定1.5 h，用磷酸緩沖液沖洗3次，條件同上；再分別用50%、70%和90%(均為體積分?jǐn)?shù)，下同)梯度乙醇脫水1次，每次10 min，100%乙醇脫水2次，每次10 min，100%乙醇+100%丙酮(體積比1∶1)脫水1次，10 min，100%丙酮脫水1次，10 min，100%丙酮+812樹脂(體積比1∶1)包埋0.5 h，812樹脂包埋2 h，環(huán)氧樹脂包埋30 min，超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在HITACHI7650型透射電鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用單因素方差分析比較不同魚類同種外周血細(xì)胞間的差異，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外周血細(xì)胞的組成及大小

從表1可見：虹鱒紅細(xì)胞密度顯著小于白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭和金鱒(P<0.05)，金鱒白細(xì)胞密度顯著大于白點(diǎn)鮭(P<0.05)；4種魚白細(xì)胞中均觀測(cè)到嗜中性粒細(xì)胞、大淋巴細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞及血栓細(xì)胞，白細(xì)胞中占比最高的均為小淋巴細(xì)胞，其中，虹鱒和紅點(diǎn)鮭外周血中小淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞中的占比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，兩者占比均顯著高于白點(diǎn)鮭和金鱒(P<0.05)；4種鮭鱒魚大淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在白細(xì)胞中的占比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，白點(diǎn)鮭外周血中血栓細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在白細(xì)胞中的占比較其他3種魚高，虹鱒血栓細(xì)胞占比顯著低于其他3種魚(P<0.05)。

表1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.1 Result of blood cells counting

從表2、表3可見：白點(diǎn)鮭紅細(xì)胞的長(zhǎng)徑和短徑均顯著大于紅點(diǎn)鮭(P<0.05)；虹鱒嗜中性粒細(xì)胞的長(zhǎng)徑顯著大于白點(diǎn)鮭 (P<0.05)，4種魚嗜中性粒細(xì)胞的短徑無(wú)顯著性差異(P>0.05)；金鱒大淋巴細(xì)胞的長(zhǎng)徑顯著大于白點(diǎn)鮭和虹鱒(P<0.05)，4種魚大淋巴細(xì)胞的短徑無(wú)顯著性差異(P>0.05)；4種鮭鱒魚小淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞的長(zhǎng)徑和短徑均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；金鱒外周血中大淋巴細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞、血栓細(xì)胞的長(zhǎng)徑和短經(jīng)均大于其他3種魚類。

從形態(tài)學(xué)來(lái)看，虹鱒紅細(xì)胞長(zhǎng)徑與短徑之比較小，其形態(tài)比其他3種魚紅細(xì)胞更接近圓形；4種魚類白細(xì)胞中血栓細(xì)胞長(zhǎng)徑與短徑之比稍大(表2)，表明血栓細(xì)胞更近橢圓形，而其他白細(xì)胞的長(zhǎng)徑與短徑之比更接近于1(表3)，在形態(tài)上接近于圓形。

表2 4種鮭鱒魚血細(xì)胞大小比較Tab.2 Comparison of size of peripheral blood cells among 4 salmonid species

表3 4種鮭鱒魚淋巴細(xì)胞大小比較Tab.3 Comparison of size of lymphocyte among 4 salmonid species

2.2 外周血細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.2.1 紅細(xì)胞 光學(xué)顯微鏡下，可觀察到圓形或近圓形的原紅細(xì)胞，細(xì)胞核較大且圓，核質(zhì)比較大，呈疏松網(wǎng)狀的染色質(zhì)被染成淺紫色，細(xì)胞質(zhì)較少，被染成淺藍(lán)色(圖1A、B、C、D)；幼紅細(xì)胞呈橢圓形，與成熟紅細(xì)胞相似，但細(xì)胞核較成熟紅細(xì)胞稍大，呈橢圓形，核質(zhì)比較大，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，著色較淺，細(xì)胞質(zhì)較成熟紅細(xì)胞少，染成較淺藍(lán)色(圖1E、F、G、H)；成熟紅細(xì)胞呈橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，細(xì)胞表面光滑，細(xì)胞核近橢圓形，位于細(xì)胞中央，核中染色質(zhì)密集，被染成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被染成淺藍(lán)色，紅細(xì)胞的核質(zhì)比約為1∶3 (圖1I、J、K、L)；衰老紅細(xì)胞較正常紅細(xì)胞大，核也較大，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，被染成淺紫紅色，細(xì)胞質(zhì)著色很淺，接近白色(圖1M、N、O、P)。此外，可見被染成淡紫紅色的“核影”紅細(xì)胞，似裸核狀，染色質(zhì)呈疏松網(wǎng)狀，其結(jié)構(gòu)不同于外周血中其他有形成分(圖1S)；偶見分裂期的紅細(xì)胞、溶解紅細(xì)胞(圖1Q、R、T)。

A、B、C、D—白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒、金鱒原紅細(xì)胞；E、F、G、H—白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒、金鱒幼紅細(xì)胞；I、J、K、L—白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒、金鱒成熟紅細(xì)胞；M、N、O、P—白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒、金鱒衰老紅細(xì)胞；Q—白點(diǎn)鮭分裂期紅細(xì)胞；R—紅點(diǎn)鮭溶解紅細(xì)胞；S—虹鱒核影細(xì)胞；T—金鱒溶解紅細(xì)胞。標(biāo)尺長(zhǎng)度=10 μm。A,B,C and D—primitive erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; E,F,G and H—immature erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; I, J, K and L—mature erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; M, N, O and P—aged erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; Q—mitotic erythrocyte of Dolly varden; R—lysed erythrocytes of Alpine charr; S—nuclear shadow erythrocyte of rainbow trout; T—lysed erythrocytes of golden trout. bar scale=10 μm.圖1 紅細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of red blood cells

2.2.2 嗜中性粒細(xì)胞 光學(xué)顯微鏡下，嗜中性粒細(xì)胞多近圓球形，細(xì)胞核位于細(xì)胞的一側(cè)，細(xì)胞質(zhì)呈紫紅色，表面有鋸齒狀突起，核質(zhì)間較為明顯，細(xì)胞核較大且常偏位；核有單葉核和分葉核，單葉核呈腎形、馬蹄形和半圓形，分葉核多為2～3葉，少數(shù)為4～6葉，被染成藍(lán)紫色。細(xì)胞質(zhì)顆粒清晰，被染成紫紅色，顆粒排列不規(guī)則，呈毛玻璃狀。根據(jù)細(xì)胞核類型區(qū)分，白點(diǎn)鮭觀察到5種嗜中性粒細(xì)胞，分別為馬蹄形、半圓形、3葉形、4葉形、6葉形(圖2A、B、C、D、E)；紅點(diǎn)鮭觀察到5種嗜中性粒細(xì)胞，分別為T形、馬蹄形、S形、2葉形及3葉形共(圖2F、G、H、I、J)；虹鱒觀察到4種嗜中性粒細(xì)胞，分別為卵圓形、2葉形、3葉形、4葉形嗜中性粒細(xì)胞(圖2K、L、M、N)；金鱒僅觀察到2葉形嗜中性粒細(xì)胞(圖2O)。

A、B、C、D、E—白點(diǎn)鮭馬蹄形、3分葉、半圓形、4分葉、6分葉嗜中性粒細(xì)胞；F、G、H、I、J—紅點(diǎn)鮭T形、馬蹄形、S形、3分葉、2分葉嗜中性粒細(xì)胞；K、L、M、N—虹鱒卵圓形、2分葉、3分葉、4分葉嗜中性粒細(xì)胞；O—金鱒2分葉嗜中性粒細(xì)胞。標(biāo)尺長(zhǎng)度=10 μm。A，B，C，D and E—neutrophil with a hoof-shape nucleus，trilobed nuclei， half round， quartered nuclei，and six nuclei of Dolly varden; F,G,H,I and J—neutrophil with T-shaped nucleus， hoof-shaped nucleus， S-shaped nucleus，trilobed nuclei，and bilobed nuclei of Alpine charr; K,L,M and N—neutrophil with oval nuclei，bilobed nuclei， trilobed nuclei，and quartered nuclei of rainbow trout; O—neutrophil with bilobed nuclei of golden trout. bar scale=10 μm.圖2 嗜中性粒細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of neutrophils

2.2.3 淋巴細(xì)胞 光學(xué)顯微鏡下，淋巴細(xì)胞近圓形，有的表面光滑，有的有明顯的偽足胞突(圖3G)；核質(zhì)比大，核占細(xì)胞體積的3/4以上，被染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈堿性被染成淺藍(lán)或深藍(lán)色，根據(jù)細(xì)胞的大小可將淋巴細(xì)胞分為大淋巴細(xì)胞(圖3A、B、C、D)及小淋巴細(xì)胞(圖3E、F、G、H)。

A、B、C、D—白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒、金鱒大淋巴細(xì)胞； E、F、G、H—白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒、金鱒小淋巴細(xì)胞； I—白點(diǎn)鮭成群聚集的血栓細(xì)胞；J—紅點(diǎn)鮭腎形血栓細(xì)胞；K—虹鱒短棒狀血栓細(xì)胞；L—金鱒短棒狀血栓細(xì)胞。標(biāo)尺長(zhǎng)度=10 μm。A,B,C and D—large lymphocyte of Dolly varden， Alpine charr， rainbow trout and golden trout; E, F, G and H—small lymphocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; I—group of thrombocyte of Dolly varden; J—thrombocyte with a kidney-shaped nucleus of Alpine charr; K—thrombocyte with a clubbed nucleus of rainbow trout; L—thrombocyte with a clubbed nucleus of golden trout. bar scale=10 μm.圖3 淋巴細(xì)胞及血栓細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of lymphocyte and thrombocyte

2.2.4 血栓細(xì)胞 光學(xué)顯微鏡下，血栓細(xì)胞呈圓形或橢圓形或不規(guī)則圓形，表面光滑，細(xì)胞質(zhì)少，核質(zhì)比大，細(xì)胞核呈腎形(圖3J)、馬蹄形(圖3J)和棒形(圖3K、L)，核中染色質(zhì)密集，被染成深紫色；細(xì)胞質(zhì)僅一薄層，著色較淺，呈淡藍(lán)色、透明色或顏色不清，繞核零星分布，邊界模糊，在白點(diǎn)鮭血細(xì)胞圖片中還可觀測(cè)到聚集成隊(duì)的血栓細(xì)胞(圖3I)。

2.3 外周血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察

2.3.1 紅細(xì)胞 透射電鏡下，4種鮭鱒魚成熟紅細(xì)胞呈橢圓形，表面光滑；細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中央，核膜清晰，可見核孔；異染色質(zhì)沿著核膜內(nèi)側(cè)呈帶狀分布，在核中央呈片狀分布；胞質(zhì)均勻致密，電子密度較高；成熟紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)已無(wú)細(xì)胞器，核糖體亦幾乎消失(圖4A、B、C、D)。

2.3.2 淋巴細(xì)胞 透射電鏡下，鮭鱒魚淋巴細(xì)胞呈不規(guī)則圓形或橢圓形，有的表面伸出許多細(xì)小的指狀突起(圖4E)；核體積大，呈不規(guī)則形，偏于細(xì)胞一側(cè)，核膜清晰，核內(nèi)異染色質(zhì)較少，結(jié)構(gòu)疏松，位于核中央；胞質(zhì)中細(xì)胞器較少，只含有少量細(xì)小顆粒和空泡，紅點(diǎn)鮭和虹鱒淋巴細(xì)胞含有極少量線粒體(圖4F、G、H)。

2.3.3 單核細(xì)胞 透射電鏡下，單核細(xì)胞呈不規(guī)則橢圓形，表面有少量偽足狀突起；核偏位，核膜不清晰，核內(nèi)異染色質(zhì)多，大部分沿核膜內(nèi)緣分布；胞質(zhì)豐富，有少量小的嗜天青顆粒，靠近細(xì)胞膜的外質(zhì)中有許多大小不一數(shù)量不等的囊泡和空泡；金鱒和虹鱒單核細(xì)胞胞質(zhì)可觀察到線粒體，白點(diǎn)鮭胞質(zhì)中溶酶體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量較為豐富，紅點(diǎn)鮭和白點(diǎn)鮭胞質(zhì)中含有少量嗜天青顆粒(圖4I、J、K、L)。

2.3.4 嗜中性粒細(xì)胞 透射電鏡下，嗜中性粒細(xì)胞呈錐形或橢圓形，表面可見突起和微絨毛；胞核較小、分葉，呈不規(guī)則狀，偏于細(xì)胞一側(cè)，核膜不清晰，異染色質(zhì)較多且濃重，胞質(zhì)豐富，特殊顆粒較多，有單位膜包被，形態(tài)多樣，大小差異較大，排列不規(guī)則；比較幾種魚嗜中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞器含量，白點(diǎn)鮭線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量均不豐富(圖4M)，虹鱒及紅點(diǎn)鮭嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)富含各種細(xì)胞器，線粒體數(shù)目多且大、峭清晰、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，可見少量吞噬小泡(圖4N、O、P、Q)，金鱒嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)可見少量線粒體(圖4R)。

2.3.5 血栓細(xì)胞 透射電鏡下，血栓細(xì)胞呈紡錘形、橢圓形或圓形；核較大，位于細(xì)胞中央，呈圓形或長(zhǎng)橢圓形，核膜圍隙和核孔均清晰；異染色質(zhì)豐富、電子致密、多集中分布在核膜內(nèi)側(cè)，細(xì)胞中幾乎無(wú)細(xì)胞質(zhì)，偶見少量線粒體和空泡(圖4S、U、V)；比較4種魚的血栓細(xì)胞顯示，白點(diǎn)鮭紡錘形血栓細(xì)胞核呈橢圓形，染色質(zhì)呈細(xì)沙狀，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)極少有少量空泡(圖4S)，紅點(diǎn)鮭血栓細(xì)胞為不規(guī)則形、細(xì)胞膜鋸齒狀、核近圓形，偏于一側(cè)，核周有少量線粒體及吞噬泡(圖4U)，而虹鱒及金鱒血栓細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核呈橢圓形或近圓形，染色質(zhì)呈細(xì)沙狀，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)極少，有少量空泡及線粒體(圖4V、W、X)。

A、B、C、D—白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒、金鱒成熟紅細(xì)胞；E、F、G、H—白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒、金鱒淋巴細(xì)胞；I、J、K、L—白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭、虹鱒、金鱒單核細(xì)胞；M—白點(diǎn)鮭6葉形嗜中性粒細(xì)胞；N—紅點(diǎn)鮭2葉形嗜中性粒細(xì)胞；O、P—紅點(diǎn)鮭4葉形嗜中性粒細(xì)胞；Q—虹鱒2葉形嗜中性粒細(xì)胞；R—金鱒S形嗜中性粒細(xì)胞；S—白點(diǎn)鮭紡錘形血栓細(xì)胞；T—白點(diǎn)鮭橢圓形血栓細(xì)胞；U—紅點(diǎn)鮭橢圓形血栓細(xì)胞；V—虹鱒血栓細(xì)胞；W—金鱒棒槌形血栓細(xì)胞；X—金鱒血栓細(xì)胞；m—線粒體；n—細(xì)胞核；g—顆粒； Ly—溶酶體； RER—粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； v—囊泡。A，B，C and D—mature erythrocyte of Dolly varden，Alpine charr，rainbow trout and golden trout; E，F(xiàn)，G and H—lymphocyte of Dolly varden，Alpine charr，rainbow trout and golden trout; I，J，K and L—monocyte of Dolly varden，Alpine charr，rainbow trout and golden trout; M—neutrophil with six nuclei in Dolly varden；N—neutrophil with bilobed nuclei in Alpine charr; O and P—neutrophil with quartered nuclei in Alpine charr; Q—neutrophil with bilobed nuclei of rainbow trout; R—neutrophil with S-shaped nucleus of golden trout; S—thrombocyte with spindly nucleus of triploid Dolly varden; T—thrombocyte with oval nucleus in Dolly varden; U—thrombocyte with oval nucleus in Alpine charr; V—thrombocyte of rainbow trout; W—thrombocyte with clubbed nucleus in golden trout; X—thrombocyte of golden trout; m—mitochondria; n—nucleus; g—granules; Ly—lysosome; RER—rough endoplasmic reticulum; v—vesicle.圖4 血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of peripheral blood cells

3 討論

3.1 血細(xì)胞組成

魚類血細(xì)胞一般包括紅細(xì)胞、血栓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞7大類[13]。本試驗(yàn)中4種鮭鱒魚外周血細(xì)胞中包括5類細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，這與陳俠君等[7]的研究結(jié)果一致。林光華等[14]認(rèn)為，魚類血液指標(biāo)值的高低與魚類活動(dòng)性及食性有關(guān)，活動(dòng)性強(qiáng)的魚類高于活動(dòng)性弱的魚類, 肉食性魚類高于草食性魚類, 草食性魚類高于雜食性魚類。本試驗(yàn)中鮭鱒魚屬于肉食性魚類，活動(dòng)能力較強(qiáng)，其紅細(xì)胞數(shù)量較中華鱘Acipensersinensis[15]、5種鯉科魚類多[16]，這與鮭鱒魚的生態(tài)習(xí)性相適應(yīng)，而較波紋唇魚Cheilinusundulatus[17]、瓦氏黃顙魚Pelteobagrusvachelli[18]、白甲魚Onychostomasima[19]、羅非魚Oreochromismossambicus[20]及歐洲鰉Husohuso[21]紅細(xì)胞密度低，可能與水溫、年齡等有關(guān)；4種鮭鱒魚白細(xì)胞密度較中華鱘[22]、歐洲鰉[21]高，這表明其抗病能力也高于二者；4種鮭鱒魚白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞數(shù)量最多，其次為血栓細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，這與大多數(shù)淡水魚一致[14]，但在中華鱘[15]、淡水石斑魚[23]等的白細(xì)胞中，血栓細(xì)胞最多。本研究中，金鱒的白細(xì)胞密度顯著高于白點(diǎn)鮭，而與紅點(diǎn)鮭和虹鱒間無(wú)顯著性差異，表明白點(diǎn)鮭的抗病力可能相對(duì)較差。此外，本研究中測(cè)量出的虹鱒血細(xì)胞的大小較陳俠君等[7]的結(jié)果稍小，可能與測(cè)量誤差、飼養(yǎng)環(huán)境、水溫及個(gè)體差異等有關(guān)。

3.2 紅細(xì)胞

紅細(xì)胞是血液中最主要也是數(shù)量最多的細(xì)胞成分[24]，其主要功能是體內(nèi)攜帶和運(yùn)輸氧氣[25]。紅細(xì)胞的形態(tài)和大小與動(dòng)物的分類地位有關(guān)，進(jìn)化地位越高，紅細(xì)胞越小，此外，細(xì)胞核在高等哺乳動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中逐漸消失。紅細(xì)胞的長(zhǎng)短徑比值可反映紅細(xì)胞的基本形狀：該比值越大，表明紅細(xì)胞越呈長(zhǎng)橢圓形；比值越接近于1，表明紅細(xì)胞越呈圓形。不同種屬間紅細(xì)胞長(zhǎng)短徑比不同，本研究中，白點(diǎn)鮭長(zhǎng)短徑比與金鱒接近，小于紅點(diǎn)鮭，大于虹鱒。與兩棲類和爬行類動(dòng)物相比，魚類進(jìn)化地位低，但大多數(shù)魚類紅細(xì)胞比兩棲爬行類動(dòng)物小，提示紅細(xì)胞大小可能與其適應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間底棲生活有關(guān)。本研究中，4種鮭鱒魚中白點(diǎn)鮭紅細(xì)胞長(zhǎng)徑和短徑均最長(zhǎng)，其相應(yīng)的體積也大于其他3種魚類，表明白點(diǎn)鮭的攜氧能力、機(jī)體代謝能力可能要強(qiáng)于其他3種魚類。在白點(diǎn)鮭血涂片中觀察到處于分裂期的紅細(xì)胞，與對(duì)條石鯛Oplegnathusfasciatus[1]、史氏鱘Acipenserschrenckii[26]等觀察到的結(jié)果一致，表明鮭鱒魚紅細(xì)胞除了在造血器官中產(chǎn)生并釋放到外周血中，還可在外周血中通過(guò)直接分裂產(chǎn)生[7]。此外，外周血中還發(fā)現(xiàn)少量原紅細(xì)胞和幼紅細(xì)胞，這與雜交鱘等相似[27]。有研究表明，未成熟紅細(xì)胞的占總紅細(xì)胞的比例與魚的種類有關(guān)，而未成熟紅細(xì)胞占比受魚體溫度、溶氧等生活環(huán)境的影響，還與魚體的健康狀況有關(guān)[28]。本研究中，電鏡下觀察到4種鮭鱒魚紅細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相似。

3.3 單核細(xì)胞

單核細(xì)胞具有活躍的變形運(yùn)動(dòng)、明顯的趨化性和一定的吞噬功能，在非特異性免疫中起到重要作用[22]。單核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中有較多大小不一數(shù)量不等的囊泡和空泡，對(duì)歐洲鰻鱺Anguillaanguilla[29]、鯉Cyprinuscarpio[30]和鱖Sinipercachuitsi[31]等的研究表明，3種魚均有較強(qiáng)的變形與吞噬能力。本研究中，電鏡下觀察到白點(diǎn)鮭較其他3種魚其單核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)具有更豐富的細(xì)胞器，細(xì)胞核電子更致密，推測(cè)白點(diǎn)鮭單核細(xì)胞變形和吞噬能力較其他3種鮭鱒魚強(qiáng)。陳俠君等[7]在二倍體和三倍體虹鱒血涂片中觀察到單核細(xì)胞數(shù)量很少，而本研究中在血涂片中未觀察到單核細(xì)胞，這可能是因單核細(xì)胞的數(shù)量較少，且有時(shí)血涂片中嗜中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞難以區(qū)分所致。

3.4 血栓細(xì)胞

血栓細(xì)胞為魚類的凝血細(xì)胞，具有凝血、吞噬(碳顆粒、細(xì)菌和細(xì)胞殘骸)和蠶食分解衰老紅細(xì)胞等功能，與哺乳動(dòng)物血小板的功能類似。硬骨魚類血栓細(xì)胞數(shù)量差異較大，有研究表明，血栓細(xì)胞數(shù)量在個(gè)體間波動(dòng)極大，且受涂片制作過(guò)程影響明顯[22]。陳俠君等[7]發(fā)現(xiàn)，虹鱒外周血白細(xì)胞中的血栓細(xì)胞在白細(xì)胞中占比最大，而本研究中發(fā)現(xiàn)，4種鮭鱒魚淋巴細(xì)胞數(shù)量在外周血中占比最大。本研究中，白點(diǎn)鮭、紅點(diǎn)鮭和金鱒外周血中血栓細(xì)胞占比顯著高于虹鱒，4種鮭鱒魚血栓細(xì)胞的大小間無(wú)顯著性差異；血栓細(xì)胞在4種鮭鱒魚中形態(tài)多樣，但同種魚外周血中為何出現(xiàn)多種形態(tài)有待進(jìn)一步研究。另外，鮭鱒魚血栓細(xì)胞中含少量的細(xì)胞器及空泡，可能與血栓細(xì)胞的吞噬功能有關(guān)，也可能類似于血小板中的表面連接系統(tǒng)，作用是增加血漿凝血因子附著的表面積[32]。

3.5 淋巴細(xì)胞

淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的重要組成部分，本研究中發(fā)現(xiàn)了兩種大小和顏色稍有差別但形態(tài)結(jié)構(gòu)基本一致的淋巴細(xì)胞，目前，兩種淋巴細(xì)胞的功能尚未見報(bào)道。林光華[33]研究表明，成年草魚大淋巴細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)所含溶酶體樣顆粒數(shù)量不同，可能兩種淋巴細(xì)胞具有不同功能。也有研究表明，當(dāng)處于靜息狀態(tài)的小淋巴細(xì)胞受到抗原刺激時(shí)，可轉(zhuǎn)變成代謝活躍并具有增殖能力的大淋巴細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞核增大、染色質(zhì)致密、細(xì)胞質(zhì)增多，重新分裂和分化進(jìn)行免疫應(yīng)答，說(shuō)明大小兩種淋巴細(xì)胞可能代表了同種細(xì)胞的不同功能狀態(tài)[34]。本研究中，大小兩種淋巴細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)在4種鮭鱒魚中差異不大，但虹鱒和紅點(diǎn)鮭淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于白點(diǎn)鮭和金鱒，表明虹鱒和紅點(diǎn)鮭抗病力可能高于白點(diǎn)鮭和金鱒；此外，4種冷水魚外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞所占比例最大，血栓細(xì)胞占比也較大，這可能與其長(zhǎng)期棲息于礫石底質(zhì)水體中有關(guān)，白細(xì)胞以血栓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主體，在鮭鱒魚受傷后快速凝血，并將侵入體內(nèi)的病原體殺死，以發(fā)揮免疫保護(hù)作用。

3.6 嗜中性粒細(xì)胞

嗜中性粒細(xì)胞存在于所有硬骨魚類中，但嗜酸性和嗜堿性粒細(xì)胞也因魚種類而異[22]。嗜酸性和嗜堿性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的2種顆粒易溶于水，在制作血涂片過(guò)程中可能被溶解掉，從而不易被觀察[35]。有學(xué)者在金魚和革胡子鯰外周血中發(fā)現(xiàn)極少量的嗜堿性粒細(xì)胞[36-37]；在花斑裸鯉、南方鲇等的外周血中觀察到嗜酸性粒細(xì)胞，但未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞[28,38]；而歐洲鰻鱺等魚類的外周血中僅存在嗜中性粒細(xì)胞[29]。本次試驗(yàn)中也未觀察到嗜酸性和嗜堿性粒細(xì)胞，白點(diǎn)鮭嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量在白細(xì)胞中占最多，虹鱒嗜中性粒細(xì)胞長(zhǎng)徑顯著大于白點(diǎn)鮭，而與紅點(diǎn)鮭和金鱒無(wú)顯著性差異；鮭鱒魚外周血細(xì)胞中觀察到多種核型的嗜中性粒細(xì)胞，從細(xì)胞發(fā)育角度來(lái)說(shuō)，嗜中性粒細(xì)胞的核從未分葉到分葉，其實(shí)是一個(gè)衰老的過(guò)程，且分葉越多，細(xì)胞衰老的程度越高[39]；白點(diǎn)鮭的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量比其他魚類稍多，分葉更多，胞質(zhì)中細(xì)胞器更少，推測(cè)白點(diǎn)鮭的嗜中性粒細(xì)胞較其他3種鮭鱒魚而言，參與機(jī)體防御和免疫的效率更低，而白點(diǎn)鮭嗜中性粒細(xì)胞在白細(xì)胞中占比較其他3種魚大，因此，嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量與工作效率之間可能存在一定的平衡。此外，嗜中性粒細(xì)胞具有吞噬能力，能做變形運(yùn)動(dòng)，可參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[40-41]。本研究顯示，幾種鮭鱒魚嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)富含內(nèi)吞泡及多種細(xì)胞器，表明均具有活躍的吞噬功能。

4 結(jié)論

1)4種鮭鱒魚外周血中可見紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、血栓細(xì)胞和單核細(xì)胞5種細(xì)胞。

2)4種鮭鱒魚的成熟紅細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，金鱒紅細(xì)胞密度最大，白點(diǎn)鮭紅細(xì)胞體積最大，鮭鱒魚紅細(xì)胞除在造血器官中產(chǎn)生，還可在外周血中通過(guò)直接分裂產(chǎn)生。

3)4種鮭鱒魚白細(xì)胞總數(shù)存在差異，其白細(xì)胞均以血栓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，其中，淋巴細(xì)胞數(shù)量最多，其次為血栓細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞數(shù)量最少。金鱒白細(xì)胞密度最大，白點(diǎn)鮭白細(xì)胞密度最小。

4)小淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞大小在4種鮭鱒魚中無(wú)顯著性差異。

5)4種鮭鱒魚淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，血栓細(xì)胞在4種鮭鱒魚中形態(tài)多樣。