南極魚類適應低溫的分子進化研究進展

許強華，陳良標

(1.上海海洋大學 水產(chǎn)種質(zhì)資源挖掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306； 2.海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心，上海 201306； 3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，上海 201306)

圍繞南極洲的南大洋是地球上最冷的水域，從3 200萬年前的漸新紀開始，南極繞極流(the antarctic circumpolar current, ACC)就阻礙了南極海域與其他海域的熱量交流，導致南大洋(the Southern Ocean)的水溫逐步下降。在南極大陸架周圍的海水溫度常年維持在0 ℃以下，并被冰雪覆蓋。南極海域雖然寒冷，但也是海洋魚類分化最快的海域之一[1]。目前，在南極海域占主導地位的是隸屬于鱸形目的南極魚亞目Notothenioidei魚類,該亞目的魚類在南大洋變冷過程中快速分化，目前擁有8個科120多個物種，其中3個科(Bovichtidae、Pseudaphritidae和Eleginopidae)的絕大部分物種分布于南極圈外較溫暖的海域，而其余5個科(Nototheniidae、Artedidraconidae、Harpagiferidae、Bathy- draconidae和Channichthyidae)的101個物種則占據(jù)高緯度的冰凍海域[2]。

一般認為，抗凍蛋白和其他抑制冰晶生長的獨特蛋白的出現(xiàn)，以及浮力的變化為這些魚類向冰凍海域的分化及占據(jù)各種深度的水層奠定了基礎[2]。除了具有獨特的抗凍能力，其中冰魚科Channichthyidae的16個物種還丟失了血細胞中運送氧氣和CO2的血紅蛋白，其血液完全透明。這些魚類的分子生理及與南極環(huán)境密切相關的進化過程，為研究生命演化提供了一個獨特的窗口。南極魚類如何適應長期低溫和極端的光周期，是什么力量驅(qū)動其快速進化，在全球變暖的環(huán)境下它們的命運又將會如何，這一系列問題一直是極地生物學研究的熱點。

迄今為止，鱗頭犬牙南極魚Dissostichusmawsoni、智利油南極魚Eleginopsmaclovinus、龍嘴雪冰魚Chionodracomyersi、扁嘴副帶腭魚Parachaenichthyscharcoti、革首南極魚Nototheniacoriiceps和鴨嘴裂頭冰魚Chaenocephalusaceratus等南極魚的基因組已經(jīng)全面測序和注釋[3-7]。最近多個南極亞目物種的全基因組序列如鞍斑杜父鱸Cottopercagobio、伯氏肩孔南極魚Trematomusbernacchii和尖頭裸龍鰧Gymnodracoacuticeps也開始公布于公共網(wǎng)站(圖1)。研究者們通過與其他已知硬骨魚類的基因組信息進行比較分析，南極魚類適應極端環(huán)境的分子機制及基因組的進化規(guī)律也逐步清晰起來。

物種名后的數(shù)為該物種基因組的大小，基于二代測序結果的物種未在圖中列出。The number followed by the species name indicates the genome size of the species, and the species sequenced by the second generation sequencing are not listed.圖1 已完成全基因組測序的南極亞目魚類物種的進化關系及所屬的科名Fig.1 Phylogenetic relationships and family names among Notothenioidei fish species with accomplished whole genome sequencing

1 南極魚類成體和魚卵抗凍蛋白的種類、起源和結構變異

由于魚類血液的冰點是-1 ℃左右，而南極海水的溫度常年在-2 ℃，能夠降低血液冰點的抗凍蛋白的存在被認為是南極魚類得以向冰凍海域分化的基本前提[8]。目前在各種魚類中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少5種結構不同卻都能抑制冰晶生長從而降低體液冰點的蛋白，即抗凍蛋白[9]。在南極亞目魚類中發(fā)現(xiàn)的這類蛋白稱為抗凍糖蛋白(antifreeze glysoproteins, AFGPs)，其蛋白鏈是由一個被糖基化的三肽重復而成，重復次數(shù)從3次到60多次不等。該蛋白的命名方式傳統(tǒng)上是按照分子量從大到小，分別以AFGP1～AFGP8命名，分子量最小的是AFGP8。這些大小不一的AFGP的基因編碼序列一般會成串地聚在一起，分別由一個三肽L(I/N)F編碼序列分開，蛋白質(zhì)翻譯后才將中間的三肽間隔子切除，從而形成大小不一但獨立編碼的抗凍蛋白分子。每個物種中通常含有多個這樣的多聚抗凍蛋白基因。一般來講，在更寒冷區(qū)域分布的南極魚體內(nèi)擁有更多拷貝數(shù)的抗凍蛋白基因，而生活在南極圈外的南極亞目魚類，只含有殘留的片段或者完全缺少抗凍蛋白[10]。另外，Cheng等[11]通過對這些基因序列分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的5′UTR和 3′ UTR與廣泛存在于魚類及其他動物體內(nèi)的胰蛋白酶基因的5′UTR和編碼序列高度同源。進一步的序列進化分析表明，抗凍蛋白基因起源于一個位于胰蛋白酶第一內(nèi)含子和第二外顯子交界處且具有TAA編碼能力的9個核苷酸，經(jīng)不斷擴增后形成了一個AFGP-胰蛋白酶的嵌合體，這一嵌合體正是抗凍糖蛋白的最初雛形[11]。這種原始基因經(jīng)過進一步的擴增和胰酶編碼序列的消除，形成了目前在基因組中可以看到的AFGP基因及基因家族。可見，南極魚類抗凍糖蛋白是從一段簡單的、原來看似無用的短序列，通過不斷地擴增而形成的。有趣的是，北極鱈魚也具有分子結構幾乎相同的抗凍糖蛋白，但是這些基因并不起源于胰蛋白酶，而是完全從頭起源[7，12]。短序列的擴增和基因的擴增是南北極兩種抗凍蛋白形成的共同機制。

在成年南極魚類體內(nèi)，抗凍糖蛋白會在胰腺外分泌組織中合成，并通過血液循環(huán)運送至全身起到抗凍作用。然而，AFGP基因并不在卵細胞中原位表達。南極魚類的卵和早期胚胎是如何抗凍的，學者們對此開展了相關研究。Chen等[13]通過對南極圈外和圈內(nèi)多物種的、基于基因芯片的比較基因組雜交分析發(fā)現(xiàn)，南極圈內(nèi)物種的卵殼蛋白基因家族發(fā)生了顯著的基因擴增現(xiàn)象。對鱗頭犬牙南極魚的透明帶蛋白(zona pellucida protein，ZP)基因轉(zhuǎn)錄本進行的測序和分類，并結合比較基因組雜交的結果顯示，與溫帶魚類相比，有7種透明帶蛋白，包括ZPAX1、ZPAX2、ZPC1、ZPC3、ZPC4、ZPC5和ZPB的拷貝數(shù)在鱗頭犬牙南極魚中表現(xiàn)出顯著的擴增。這些透明帶蛋白參與卵殼的形成，具有保護發(fā)育中胚胎的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，南極魚類的透明帶蛋白與冰結合，在中等質(zhì)量濃度(4 mg/mL)條件下，可以非依數(shù)性地降低溶液的冰點和熔點，不同ZP種類降低冰點活性介于0.26～0.65 ℃，其中ZPAX1和ZPC5的活性最高，其降低冰點的活性超過相同濃度的AFGP蛋白[14](表1)。另外，轉(zhuǎn)入并表達南極魚科透明帶蛋白基因的斑馬魚卵表現(xiàn)出促進冰晶融化的能力，且轉(zhuǎn)基因魚卵在冰凍環(huán)境下較野生對照魚卵的成活率顯著增高。通過對南極魚類透明帶蛋白ZPC5的突變分析發(fā)現(xiàn)，透明帶蛋白結構域和表面的酸性殘基斑塊是促進冰融化(ice melting-promoting，IMP)活性的基本結構。因此，南極魚卵殼蛋白抗凍的機制與AFGP的抗凍機制并不相同，前者可以同時降低液體的熔點和冰點，而AFGP只降低冰點。AFGP只抑制冰晶生長，而南極魚類的卵殼蛋白能促進冰晶融化[15]。 最近破解的另一個南極亞目物種，鴨嘴裂頭冰魚的基因組表明，透明帶蛋白家族在鴨嘴裂頭冰魚基因組中廣泛擴增，共鑒定到131個透明帶基因，包含20條contig上串聯(lián)重復的109個基因。其中一個位點就包含19個串聯(lián)重復的ZPC5基因[6],這個位點與其他南極亞目魚類并不一致，表明不同的物種具有不同透明帶基因的擴增譜系。南極魚類透明帶蛋白擴增和結構特化的過程是一個極地環(huán)境推動分子適應性進化的一個新的例證(圖2)。

表1 南極亞目魚類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白種類和活性(引自Schrag等[14]和Cao等[15])

南極高寒區(qū)魚類通過透明帶蛋白(ZP)基因的擴增和新功能化產(chǎn)生新型的抗凍蛋白，保護魚卵在冰凍環(huán)境下生存。By gene duplication and neofunctionalization，zona pellucida proteins(ZP) of the Antarctic high cold region fish evolve to become a new-type antifreeze protein，which could protect fish egg survive in frozen environment.圖2 具有抗凍能力的南極魚透明帶蛋白(ZP)Fig.2 Zona pellucida protein (ZP) with antifreeze activities in Antarctic fish

本實驗室對ZPC5結構與抗凍功能的關系進行了詳細研究。對體外表達的ZPC5蛋白的變性試驗表明，南極魚ZPC5的抗凍功能依賴于其ZP結構及其非聚合狀態(tài)[15]。但是，所有ZP蛋白的原始功能都是分泌到卵細胞外周，聚合形成卵殼。因此，ZP蛋白的抗凍功能與其原始結構蛋白的功能存在著結構性的沖突。Chao等[15]在鱗頭犬牙南極魚的基因組中至少鑒定到了3種編碼ZPC5變構體的基因，除了原始ZPC5基因(包含10個外顯子)外，有2種ZPC5基因分別在第9和第10個外顯子中間引入了轉(zhuǎn)錄終止位點，形成了C末端截斷了的ZPC5?？箖龉δ軝z測表明，C末端截斷的ZPC5容易留在細胞內(nèi)，并且不容易聚合，因此，其在冰凍狀態(tài)下保護細胞的功能更強[15]。而這種變構體在其他南極魚類如鴨嘴裂頭冰魚的基因組中也存在，只是截斷的位置有所不同。這種通過分子截斷而避免功能沖突的基因進化機制，類似于極地綿鳚科魚類Ⅲ型抗凍蛋白從唾液酸合成酶起源的“避免適應沖突”(escape from adaptive conflict)新基因起源的機制[16]。這也說明，這種分子進化機制存在普遍性。南極魚類透明帶蛋白基因的多樣性顯然與這些魚類的進化歷史和產(chǎn)卵環(huán)境具有關聯(lián)性。透明帶蛋白基因在非南極亞目的其他極地魚類中擴增的情況、結構的變異及其與環(huán)境的關系是一個值得進一步研究的問題。

2 南極魚類血液發(fā)生和抗過氧化信號通路的特殊性和適應性機制

環(huán)繞南極大陸的海洋是一個寒冷但溫度相對穩(wěn)定的水體，溫度的年變化幅度在-1.9～1 ℃之間。由于海水的氧溶解度與溫度成反比，南極海水處于氧飽和狀態(tài)。因此，生活在這里的南極亞目魚類表現(xiàn)出許多獨特的生理現(xiàn)象。一方面由于南極溫度低，南極魚類具有極低的新陳代謝率，因而對氧氣的需求量比較低；另一方面由于海水氧飽和度增加，南極魚類對運氧能力的需求總體較弱。因此，大部分南極圈內(nèi)物種單位體積內(nèi)血紅細胞數(shù)量比溫帶魚類的血紅細胞數(shù)量明顯減少，而冰魚科的物種則完全失去了血紅蛋白，其原始性血紅細胞數(shù)量僅為具有血紅蛋白的相同大小南極魚的1%左右[17]。最近對南極魚亞目物種基因組中的高度保守核苷酸片段(conserved nucleotide elements，CNEs)進化模式的分析發(fā)現(xiàn)，那些調(diào)控血紅細胞發(fā)生相關基因的CNE在南極圈內(nèi)物種中存在著快速突變，表明它們在長期的低溫環(huán)境下具有功能丟失的趨勢[18]。這也說明血紅細胞的發(fā)生(erythropoiesis)在南極亞目的魚類中受到了放松選擇。在血紅蛋白丟失的冰魚科物種中，除了CNE的放松選擇之外，其造血組織(頭腎)中的TGF-beta信號和p53明顯加強。強化的TGF-beta和p53信號通路促進了90余個microRNAs的合成，包含眾多靶向調(diào)控GATA1、ALAS2等紅系發(fā)生關鍵調(diào)控因子的miRNAs，如miR-152、miR-1388、miR-16b。這幾個miRNAs表達量的提高可以降低斑馬魚胚胎血液的發(fā)生[19-20]。現(xiàn)有的研究表明，南極魚類對血紅細胞發(fā)生過程的調(diào)控是適應低溫的一個重要機制。

轉(zhuǎn)錄組分析可以為長期低溫下魚類的適應機制探索提供指導。Chen等[13]對鱗頭犬牙南極魚的腦、肝、卵巢和頭腎4個組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，并與溫帶/熱帶硬骨魚相同組織的轉(zhuǎn)錄組圖譜進行比較，發(fā)現(xiàn)許多與寒冷相關的基因表達上調(diào)。這些上調(diào)的基因家族在蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)折疊和降解、脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗凋亡、先天免疫、卵殼形成等方面發(fā)揮著重要作用。其中，蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)折疊和降解等保持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)通路和諸多抗過氧化通路基因在基因表達上的變化尤其明顯。后續(xù)在其他物種中基于全基因組測序的比較發(fā)現(xiàn)，諸多抗氧化脅迫相關的基因發(fā)生了高表達或者擴增，這些均為前期轉(zhuǎn)錄組研究提供了良好的例證。

在鴨嘴裂頭冰魚基因組中，與ROS穩(wěn)態(tài)相關的基因家族包括編碼超氧化物歧化酶(SOD)和NADPH醌受體氧化還原酶(NQO1)基因在鴨嘴裂頭冰魚基因組中均發(fā)生了擴增。研究發(fā)現(xiàn)，鴨嘴裂頭冰魚有 5個SOD基因，其他鱸形目硬骨魚只有3個SOD。更可觀的變化是NQO1基因，鴨嘴裂頭冰魚中有33個NQO1基因，遠多于大多數(shù)魚類基因組中2～10個NQO1基因的數(shù)量。另外，鴨嘴裂頭冰魚也是已完成基因組測序的硬骨魚中唯一具有兩個串聯(lián)拷貝的8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶(OGGL)的魚類。OGGL編碼的蛋白質(zhì)用于切除由于活性氧損傷而產(chǎn)生的修飾堿基，而在其他測序的硬骨魚基因組中只有一個OGGL拷貝[6]。

本實驗室在對鱗頭犬牙南極魚和智利油南極魚兩個分別位于南極圈內(nèi)和圈外不同地理位置的近緣南極魚物種12個主要組織的轉(zhuǎn)錄組比較中，同樣也發(fā)現(xiàn)了抗過氧化在適應南極冰凍環(huán)境上的重要性。在差異基因富集的10多個生物學過程中，硒化合物代謝過程和硒半胱氨酸代謝過程得到了顯著富集，這兩個生物學過程均為抗活性氧途徑。與智利油南極魚相比，鱗頭犬牙南極魚組織中大部分含硒蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活性有較大增強。與此相應的，參與含硒半胱氨酸蛋白翻譯的基因在鱗頭犬牙南極魚中也顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)運Selcys的Selcys-tRNA基因家族也發(fā)生了極大擴張。眾所周知，硒蛋白是細胞內(nèi)應對細胞氧化應激的重要分子，增強的抗活性氧能力是對持續(xù)寒冷環(huán)境的一種重要適應。谷胱甘肽過氧化物酶4b(gpx4b)是一種唯一能夠減少脂質(zhì)過氧化氫的硒蛋白。該基因在鱗頭犬牙南極魚中表達較低，而與脂肪儲存相關的所有脂滴組裝蛋白(PLN2、PLN5、Fitm、Seipin)在該魚所有組織中均上調(diào)，這意味著鱗頭犬牙南極魚中存在抑制脂質(zhì)過氧化并向著脂滴儲存方向轉(zhuǎn)變的分子機制[7]。

目前，南極魚類血紅細胞的大幅降低是對低溫的適應性進化還是因為高飽和氧環(huán)境下的退化所致，迄今還是一個尚未解決的問題。本實驗室從血紅細胞發(fā)生相關CNE的進化研究發(fā)現(xiàn)，TGF-beta1及其受體在南極圈內(nèi)魚類發(fā)生的適應性進化，以及它們對紅系發(fā)生的抑制功能均暗示，血紅細胞的減少可能是一種適應低溫的進化過程。另外，低溫環(huán)境下抗氧化脅迫機制的高度提升，無論在有血紅蛋白和無血紅蛋白的物種中均是如此。這表明，抗過氧化機制的強化是魚類適應長期低溫的一個重要機制。這個發(fā)現(xiàn)對于抗低溫和抗高溫水產(chǎn)品種的選育具有重要意義。

3 南極魚類hepcidin基因家族的獨特進化

Hepcidin是一種肝臟分泌的抗菌肽，由前體通過翻譯后剪切形成20～25個氨基酸殘基組成的短肽。在高等脊椎動物中，hepcidin分子一般含有8個高度保守的半胱氨酸殘基，相互配對形成了四對二硫鍵構成穩(wěn)定的發(fā)卡結構。Hepcidin是目前脊椎動物上發(fā)現(xiàn)的唯一鐵離子代謝調(diào)節(jié)因子[21],其通過結合FPN1(ferroportin 1)發(fā)揮調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的作用，而FPN1的作用是將鐵從十二指腸上皮細胞、巨噬細胞及其他鐵輸出細胞輸出。Hepcidin在細胞表面與FPN 1結合，激活hepcidin-FPN1復合物的內(nèi)化，最終導致FPN1泛素化及蛋白復合物降解，從而降低細胞中鐵離子的輸出[22]。

研究表明，南極魚類的hepcidin由多個基因編碼，有的hepcidin分子發(fā)生了結構性的改變。轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，鱗頭犬牙南極魚和革首南極魚分別具有3種和5種不同的hepcidin cDNA，除了傳統(tǒng)的包含8個半胱氨酸(Cystein，Cys)殘基的保守的hepcidin外，還有一種只含4個半胱氨酸的hepcidin分子(4cys hepcidin)[23]。這種4Cys hepcidin分子的氨基酸序列幾乎與8Cys hepcidin的半胱氨酸沒有同源性，表明這類分子在進化過程中發(fā)生了極大的改變，且這種4Cys hepcidin 基因只在南極圈內(nèi)的南極魚亞目魚類中檢測到。有趣的是，沒有血紅蛋白的冰魚科物種，如鴨嘴裂頭冰魚中只有8Cys的hepcidin而缺失4Cys hepcidin，造成這種缺失的原因目前尚不清楚。然而，在鱗頭犬牙南極魚的造血組織頭腎和脾臟中高表達但在鴨嘴裂頭冰魚體內(nèi)缺失的4Cys hepcidin，很可能與鴨嘴裂頭冰魚體內(nèi)血紅蛋白和造血作用缺失有關[23-24]。

這種新型4Cys hepcidin亞型的成熟區(qū)只包含4個半胱氨酸，只能形成2個二硫鍵?？梢酝茰y，其結構可能在低溫下具有更高的靈活性[23]。南極綿鳚科魚類Lycodichthysdearborni并不屬于南極魚亞目魚類，但其同樣也生活在南極圈的冰凍水域中。在L.dearborni體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了獨立進化而來的4Cys hepcidin同源基因，這支持了低溫驅(qū)動半胱氨酸數(shù)目減少的hepcidin產(chǎn)生的假設。

為明確這種結構變異的hepcidin分子是否具有與8Cys的hepcidin一樣的功能，近年來，本實驗室在體外表達了南極魚類的3種hepcidin變構體，其中包含2個具有8Cys和1個具有4Cys的hepcidin，并進行了抑菌試驗。結果表明，無論哪種hepcidin均能抑制細菌的增殖，其抑菌的活性濃度也相似。同樣地，這些hepcidin分子均能與FPN結合(未發(fā)表數(shù)據(jù))。鑒于鐵離子在細胞增殖、死亡、新陳代謝和心血管發(fā)育中不可替代的功能，對hepcidin基因家族在各物種中的組成、各種變構體的功能差異及與環(huán)境因素的關系的闡明將為理解魚類的溫度適應機制提供新的視角。

4 南極魚線粒體的適應性進化

革首南極魚是一種極地特有的硬骨魚，大量分布于南極近海岸水域。對革首南極魚基因組中進化最快的10%的基因的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的富集項與線粒體相關。在發(fā)生正選擇的20個編碼線粒體蛋白中，有10個基因與氧化磷酸化直接相關，其中6個基因編碼ATP合成酶的亞單位，1個基因編碼線粒體復合物Ⅲ的亞單位，3個基因編碼線粒體復合物Ⅳ。這個結果提示，線粒體蛋白的快速進化可能與寒冷環(huán)境的適應相關。相比溫帶魚類，南極魚線粒體在氧消耗率、電子傳遞與ATP合成的耦合效率等方面對溫度更加敏感。它們的快速進化可能影響南極魚類線粒體功能的熱敏感現(xiàn)象，并有助于解釋極地魚類正常代謝的極限溫度[25]。

沒有血紅蛋白的南極冰魚在線粒體上的改變更加明顯。對龍嘴雪冰魚與3種代表不同溫度環(huán)境的魚類(斑馬魚、尼羅羅非魚、三刺魚)骨骼肌轉(zhuǎn)錄組比較和分析發(fā)現(xiàn)，龍嘴雪冰魚中參與各種線粒體過程的基因存在差異表達[5，26]。核糖體大小亞基的組裝是線粒體生成的必要條件，而在龍嘴雪冰魚中參與線粒體核糖體組裝的大部分輔酶基因發(fā)生了過表達。3種形成線粒體連接位點和嵴組織系統(tǒng)(MICOS)的蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本(包括MICOS核心組成IMMT)在龍嘴雪冰魚中顯著低表達。另外，線粒體肌酸激酶(mtCK)是連接內(nèi)部和外部的線粒體膜和促進脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的相關蛋白質(zhì)，其在龍嘴雪冰魚骨骼肌中的表達也顯著降低。有試驗表明，小鼠在敲除線粒體肌酸激酶mtCK 后，肌肉纖維發(fā)生超微結構重塑，這導致線粒體的密度增高、體積增大[27]。這些表型與龍嘴雪冰魚肌肉細胞的表型一致。此外，在嵴重塑中起重要作用的OPA1及調(diào)節(jié)線粒體分裂的關鍵基因DNM1L/DRP1在龍嘴雪冰魚中均發(fā)生下調(diào)，而促進線粒體融合和連接脂滴的MIGA1基因則在龍嘴雪冰魚中發(fā)生了上調(diào)?？梢酝茰y，這些變化使得龍嘴雪冰魚肌肉中含有更多數(shù)量的線粒體[28-29]。

事實上，從龍嘴雪冰魚和非南極物種的比較中得到的結果可以解釋為，龍嘴雪冰魚線粒體過程的基因差異表達在一定程度上可以反映出這是對南大洋冰凍條件的反應，而不是因為缺乏運氧載體——血紅蛋白。與其他具有血紅蛋白的南極魚相比，龍嘴雪冰魚基因組中擴增的基因中，有大量的屬于線粒體蛋白組(IMPI)的基因。這種基因擴增與其mRNA水平的高表達顯著相關，也與高組織特異性的功能特化顯著相關[5]。因此，基因擴增也是南極冰魚體內(nèi)線粒體發(fā)生機制改變的進化模式。

5 南極魚類的熱休克反應

熱休克反應是生物機體在熱應激(或其他應激)狀態(tài)下所表現(xiàn)的以基因表達變化為特征的防御適應反應，具體表現(xiàn)為一種或多種熱休克蛋白(heat-shock proteins，HSPs)表達的增強。長期低溫且穩(wěn)定環(huán)境下進化的南極魚類，其熱休克反應發(fā)生了怎樣的變化，學者們對此開展了相關研究。早期報道顯示，有的南極魚類如伯氏肩孔南極魚已經(jīng)失去了熱休克反應的能力[30]。最近的基因組層面上的分析表明，所有種類的熱休克蛋白如HSP70、HSP90及HSP40等蛋白在極地魚類中均存在，而且有些熱休克蛋白如HSP70、HSP90的表達量比正常狀態(tài)下的溫帶魚類還要高[13]。這提示，低溫環(huán)境下蛋白折疊需要伴侶蛋白的協(xié)助。

研究發(fā)現(xiàn)，南極魚類中的熱激蛋白是組成性表達的，可能是為了緩解蛋白的冷變性[31-34]。革首南極魚的基因組草圖中，HSR(heat shock response)相關基因保存良好。在脊椎動物中，HSF1(heat shock factor 1)被認為是熱應激的主要調(diào)節(jié)因子，而革首南極魚的HSF1失去了依賴磷酸化的小泛素相關修飾(phosphorylation-dependent sumoylation motif，PDSM)的基序，該基序是抑制其反式激活能力所必需的。PDSM中絲氨酸殘基的磷酸化是將小泛素修飾肽(small ubiquitin-related modifier peptide，SUMO)偶聯(lián)到HSF1中單個賴氨酸殘基的先決條件。當需要最大化HSF1活性時，去泛素化酶從HSF1中去除這種修飾。革首南極魚和一些冰魚的HSF1在調(diào)節(jié)結構域中不包含完整的PDSM，并且其PDSM的絲氨酸殘基被天冬酰胺取代。因此，革首南極魚的HSF1不被類泛素化降解，這意味著HSP1的反式激活不受類泛素化作用的抑制。在革首南極魚基因組背景下，失去SUMO位點的PDSM會通過簡單的模式最大限度地激活對熱應激的反應[35-36]。與伯氏肩孔南極魚不同的是，革首南極魚中的HSR在全血轉(zhuǎn)錄組水平上保留了增加熱應激蛋白(HSP70、HSP ssb1、HSP40)的表達能力，以響應急性熱應激[3]。因此，極地魚類的HSR反應具有物種特異性。

6 南極魚類中性浮力的獲得

魚鰾是大多數(shù)硬骨魚的主要浮力器官，而所有的南極亞目魚類都沒有魚鰾。與底棲祖先(如智利油南極魚)顯著不同，有些物種在進化上再次獲得了中性或接近中性的浮力，使它們能填充海洋中上層水域的生態(tài)位，成為南極亞目適應輻射的一個獨特標志。鱗頭犬牙南極魚是少數(shù)獲得了中性浮力的物種之一。研究表明，這個物種通過皮下和肌肉中廣泛的脂質(zhì)(主要是甘油三酯)沉積，以及主要由軟骨和少量礦化骨組成的輕質(zhì)骨骼，降低整體密度，在海水中提供靜態(tài)升力[37]。轉(zhuǎn)錄組分析表明，與智利油南極魚相比，鱗頭犬牙南極魚肌肉中參與三酰甘油合成的酶轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，包括關鍵的?；视?3-磷酸O-?；D(zhuǎn)移酶亞型和胞苷二磷酸-二酰甘油合成酶。同時，與脂肪儲存調(diào)控相關的基因除MEST基因外表達量均顯著增高。相反地，鱗頭犬牙南極魚肌肉中與脂質(zhì)β-氧化相關的基因卻顯著下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，相對于智利油南極魚，鱗頭犬牙南極魚肌肉的代謝途徑從脂質(zhì)分解轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)生物合成和脂質(zhì)儲存，有利于脂質(zhì)的沉積，從而有助于中性浮力的形成。KEGG進一步分析表明，肌肉中脂肪代謝的改變是通過脂肪合成的主要調(diào)控因子PPARγ實現(xiàn) (圖3)。 在這條通路上，一些促進PPARγ功能的因子如ID2、METRN1、STK3、CREB1和SNAI2等被大量表達，這些基因的大量表達促進了脂肪細胞的生成[7]。

鱗頭犬牙南極魚肌肉組織中PPARγ和10個促進脂肪細胞生成的基因(紅框表示)表達比祖先物種均顯著提高，而抑制脂肪合成的因子只發(fā)現(xiàn)1個 TGFB1(藍框)(引自Chen等[7]，2019)。PPARγ and other 10 genes that promote the production of fat cells (red box) show significantly up-regulated expressions in muscle tissues of the Antarctic fish D.mawsoni， compared with its ancestor species.Only one gene TGFB1 (blue box) that inhibits fat synthesis is found(Cited from Chen et al.[7]，2019).圖3 鱗頭犬牙南極魚脂肪細胞生成的基因調(diào)控Fig.3 Gene regulations of adipose cell generation of the Antarctic fish Dissostichus mawsoni

在骨化方面，脊椎動物骨骼發(fā)育的兩個主要調(diào)節(jié)因子Sox9和Runx2的表達在鱗頭犬牙南極魚、伯氏肩孔南極魚和博氏南冰鰧Pagotheniaborchgrevinki的盆骨帶骨轉(zhuǎn)錄組中無明顯變化。然而，許多BMP通路、Wnt通路基因的表達和許多已知參與這一過程的調(diào)節(jié)因子的表達在鱗頭犬牙南極魚中發(fā)生了特異性改變，這可能改變了軟骨形成和成骨之間的發(fā)育平衡[7]。在這些高度上調(diào)的基因中，結締組織生長因子CTGF與早期的成骨分化有關，包括成骨前體細胞的增殖和募集；但當CTGF組成性表達時，其會抑制Wnt-3A和BMP-9誘導的成骨細胞分化[25]。另外，前列腺素過氧化物合成酶2(HSPG2)是滑膜間充質(zhì)細胞向軟骨和成脂分化所必需的，其通過調(diào)節(jié)Sox9和PPARγ促使細胞外基質(zhì)蛋白1(ECM1)與HSPG2相互作用調(diào)節(jié)軟骨形成。MEF2C是一種調(diào)節(jié)肌肉和心血管發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，通過激活軟骨細胞肥大的遺傳程序來控制骨的發(fā)育[38]。目前已知一些基因的上調(diào)可以抑制成骨細胞的形成，如TOB2[39]、CTNNBIP1[40]、分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled-related protein 1,SRFP1)[41]和ZBTB16[42]；而轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的一些成員(BMPR1A、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、Smad1)可促進軟骨形成和成骨細胞形成。這些基因在鱗頭犬牙南極魚骨骼中的表達發(fā)生顯著變化。CYR61和PTN特異性地促進成骨細胞的形成[43-44]，但PTN的表達在鱗頭犬牙南極魚骨骼中顯著減少，這與減少硬骨的形成是一致的。另外，一些基因通過調(diào)節(jié)破骨細胞生成來影響骨化，如Sbno2可促進破骨細胞融合[45]，成骨細胞上EphA2信號的激活導致骨的重吸收。鱗頭犬牙南極魚骨骼的基因表達模式顯示，在骨骼發(fā)育過程中，基因表達有利于軟骨生成而不是成骨細胞生成，這將降低骨密度，并有助于實現(xiàn)中性浮力 (圖4)。因此，南極魚基因組和轉(zhuǎn)錄組的比較研究，為揭示極地魚類中性浮力形成的分子發(fā)育機制指明了新的方向。

鱗頭犬牙南極魚骨細胞轉(zhuǎn)錄組分析表明，與溫帶祖先物種相比，其促進軟骨生成的因子(深灰框)、抑制軟骨分化成骨細胞的因子(籃框)和促破骨因子(紅框)均顯著高表達，而促進成骨細胞生成的因子(綠框)則顯著低表達。The Antarctic fish D.mawsoni osteocyte transcriptome analysis indicates that factors that promote chondrogenesis (dark gray box)，and genes that inhibit osteogenesis (blue box)，and osteoclastic factors (red box) show significantly up-regulation compared with its ancestor species.圖4 基因表達的變化促使鱗頭犬牙南極魚非鈣化軟骨的生成[7]Fig.4 Gene expression changes promote non-calcifiedchondrogenesis in the Antarctic fish Dissostichus mawsoni[7]

7 低溫驅(qū)動的魚類基因組進化趨勢

極地魚類為人們了解環(huán)境溫度與基因組GC含量和蛋白質(zhì)的氨基酸偏好提供了機會。對基因組總體CG含量的比對發(fā)現(xiàn)，南極亞目魚類的基因組與溫帶魚類無明顯差異，均在40%左右[7，46]，但在氨基酸密碼子的使用頻率上，冷水魚和熱帶魚表現(xiàn)出密碼子替換的不對稱性。與熱帶魚相比，冷水魚在同義和非同義密碼子替換中均表現(xiàn)出對GC的偏好。溫帶魚類也偏愛富含GC密碼子的氨基酸，而不傾向于那些富含AT密碼子的氨基酸。寒帶魚富含GC密碼子的非同義替換傾向于在蛋白質(zhì)鏈中增加小分子量的氨基酸比例。對蛋白質(zhì)組二級結構的預測和比較研究表明，寒帶魚類蛋白質(zhì)組中隨機卷曲的頻率明顯高于熱帶魚類。這種替代的偏向性可以增加蛋白質(zhì)的靈活性，對降低低溫環(huán)境下蛋白酶的活化能是有利的[47]。

一系列的研究發(fā)現(xiàn)，生活于南大洋不同溫度區(qū)間的南極亞目魚類的基因組大小存在明顯差異，那些生活于高緯度冰凍海域的南極魚物種具有更大的基因組?；蚪M變大的現(xiàn)象在血紅蛋白丟失的冰魚科物種中特別明顯，其基因組比低緯度寒溫帶海域進化上比較原始的物種大30%～50%[48]。南極亞目魚類未發(fā)生過種類特異的全基因組加倍的事件。高緯度冰凍海域物種基因組的增大主要是轉(zhuǎn)座子大量擴增導致的[6-7]。對鱗頭犬牙南極魚基因組與溫帶南極亞目物種的比較基因組雜交發(fā)現(xiàn)，有17個編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和內(nèi)切酶基因顯示出8～300倍南極圈內(nèi)物種特有的重復[13]。除了轉(zhuǎn)座子的擴增外，很多蛋白的編碼基因也發(fā)生了擴增。Chen等[7]通過基于芯片的比較基因組雜交發(fā)現(xiàn)，118個基因家族在南極魚物種中表現(xiàn)出明顯的擴增，其中包括AFGP基因家族、ZP基因家族、Lectin基因家族、Selcys-tRNA基因及與線粒體相關的基因。對這些擴增基因的功能研究表明，這些擴增基因是對極地冰凍環(huán)境適應的重要遺傳基礎[5，13，15，26]。可以推測，對極地魚類中擴增基因種類和功能的深入探索是發(fā)現(xiàn)抗凍或者抗低溫性狀決定基因的有效途徑。

是什么因素促進了南極亞目魚類轉(zhuǎn)座子活性的增加，從而導致基因組變大，這是一個尚未解決的問題。一般認為，環(huán)境脅迫如極端溫度、氧化脅迫、輻射等因素往往導致轉(zhuǎn)座子抑制機制，如DNA甲基化或組蛋白修飾等表觀遺傳因素的改變，從而使轉(zhuǎn)座子重新回到活躍狀態(tài)[49-50]。南極魚類轉(zhuǎn)座子的擴增是否與低溫脅迫有關，本實驗室對此開展了詳細研究。通過對鱗頭犬牙南極魚基因組中長散在重復序列(LINE-1)擴增時間的計算發(fā)現(xiàn)，這些序列的大量擴增發(fā)生在6百萬年前當極地海洋的溫度降到最低點的時候(圖5)。為進一步研究LINE擴增與低溫的關系，將來源于鱗頭犬牙南極魚的一個長散在重復序列(DmL1)進行了克隆并轉(zhuǎn)染人類和魚類的細胞。結果發(fā)現(xiàn)，低溫刺激下兩種細胞基因組中DmL1的拷貝數(shù)均有所增加。而進一步研究揭示，在冷脅迫條件下，正是由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累激活了絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p38信號通路，并進而引起dmL1轉(zhuǎn)座活性的增加[51]。由于MAPK/p38信號通路普遍參與動物的應激反應，這種機制很可能普遍存在于動物中。顯然，MAPK通路如何激活LINE-1類的逆轉(zhuǎn)座活性，而南極魚類高漲的逆轉(zhuǎn)座活性如何得到有效控制從而保持基因組的穩(wěn)定，是基因組進化領域一個值得研究的問題。

圖5 鱗頭犬牙南極魚、智利油南極魚LINE-1擴增與溫度下降的關系[7]Fig.5 Correlations between LINE1 duplications and the cooling temperature in Antarctic fishes Dissostichus mawsoni and Eleginops maclovinus[7]

8 存在問題及展望

隨著各種組學技術的進步，近10多年來，極地魚類對低溫環(huán)境生理適應的遺傳基礎正在得到揭示。人們已經(jīng)在抗凍和多種組織如血液、骨骼、脂肪等特殊的發(fā)育調(diào)控有了新的認識。在細胞生理學的水平上，以蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持和抗過氧化為特征的抗逆信號通路也被揭示是極地魚類抵抗寒冷環(huán)境的重要通路。然而，對魚類抵抗低溫的分子機制的深入了解有賴于擴展到與其他溫度區(qū)間的魚類進行更深入的比較研究。目前，在極地魚類中所揭示的抗凍蛋白及抵抗過氧化等的分子都是處于低溫信號傳遞鏈的末端分子，是否在魚類中存在低溫感應的關鍵基因或節(jié)點基因還有待進一步研究。

本實驗室和其他一些實驗室對斑馬魚進行的低溫應激下多組織轉(zhuǎn)錄組的分析表明，斑馬魚成體各組織中存在復雜的低溫響應基因調(diào)控網(wǎng)絡，其中JUN和BCL6a在低溫網(wǎng)絡中處于節(jié)點的位置[52]。JUN和BCL6a結合位點在各溫度區(qū)間的魚類物種基因組上的豐度也呈現(xiàn)出與所處溫度范圍相對應的現(xiàn)象[52]。JUN的激活受到JNK、P38等MAPK通路激酶的調(diào)控，因此，MAPK通路在魚類低溫應激中占據(jù)重要位置，這在多種魚類的低溫應激網(wǎng)絡中已得到證明[53-54]。進一步來說，細胞內(nèi)的MAPK通路與其他重要的通路如TGF-beta等也有復雜的聯(lián)系?？梢灶A見的是，這些重要通路聯(lián)合起來共同決定魚類的溫度適應范圍。然而，目前在這些通路中，由哪些關鍵節(jié)點基因控制魚類對溫度的適應范圍還遠未明確。另外，魚類究竟如何感應溫度，它們的神經(jīng)細胞內(nèi)存在的TRP類離子通道是否與其他動物一樣感應溫度，它們在低溫信號的傳導上，對已經(jīng)確定魚類的溫度適應范圍上扮演什么角色，這些問題還有待深入研究。

根據(jù)目前對南極魚類適應低溫的分子進化研究情況，作者提出今后在魚類適應低溫和進化機制領域上有待深入開展研究的科學問題及研究方向有：

1)在極地魚類低溫適應的復雜信號網(wǎng)絡中，起關鍵作用的分子是什么，這些關鍵分子或者調(diào)控序列是在南極環(huán)境下新產(chǎn)生的，還是在原有的分子基礎上加以改進而產(chǎn)生的。

2)極地魚類分子水平的微進化如何促成物種水平的快速分化使南極亞目魚類成為快速分化的海洋魚類的典型代表。

3)在全球變暖的背景下，這些極地魚類的命運將會如何，什么樣的分子或者生物學途徑可以預測各物種的最高耐受溫度。

4)在深入研究這些科學問題的基礎上，利用從南極魚類中挖掘出來的獨特和高效的抗逆基因，為魚類抗逆育種或器官和細胞的低溫保存服務的研究也將是本領域今后的重要研究方向。對極地生命過程的深入研究將使人們更深地了解有關環(huán)境適應與生命演化的基本規(guī)律，同時也將在農(nóng)業(yè)育種和醫(yī)學上產(chǎn)生新的應用前景。

致謝：卜夢迪同學和李文豪老師參與了本文的資料搜集與寫作工作。