解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑的抑菌和防腐效果

金瑋鋆 張鳳杰 張曉蒙

摘要：釀酒葡萄種植、果實(shí)貯存保鮮和葡萄酒貯存時(shí)期均會(huì)發(fā)生不同程度的真菌性病害，影響葡萄酒釀造品質(zhì)，造成一定的生產(chǎn)損失。利用解淀粉芽孢桿菌B15對(duì)真菌的抑制作用，在一定條件下制備得到生物農(nóng)藥——解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑，并對(duì)其在葡萄種植病害防治、葡萄酒窖抑菌及葡萄防腐等方面分別進(jìn)行初步應(yīng)用。藥劑施用結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑施用效果良好，對(duì)葡萄種植病害的平均防效在70%以上;在酒窖封閉空間的平均抑菌率為77.32%;在果蔬防腐應(yīng)用試驗(yàn)中，100 mg/L處理組好果率達(dá)到83.3%，在果蔬保鮮劑應(yīng)用領(lǐng)域具有一定的開發(fā)價(jià)值。B15可濕性粉劑的初步應(yīng)用為我國(guó)釀酒葡萄在葡萄種植、果實(shí)保鮮和葡萄酒貯存整個(gè)流程中真菌病害的防治提供了有價(jià)值的應(yīng)用參考。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;B15可濕性粉劑;真菌病害防治;葡萄種植;酒窖抑菌;葡萄防腐

葡萄酒品質(zhì)的好壞極大程度上取決于所挑選的釀酒葡萄的品質(zhì)，而葡萄種植階段的病害侵?jǐn)_會(huì)極大影響葡萄品質(zhì)，進(jìn)而影響葡萄酒釀造品質(zhì)及口感，嚴(yán)重制約著行業(yè)發(fā)展。葡萄病害一般以真菌為主，常見病害主要有葡萄霜霉病、葡萄灰霉病等。早期防控葡萄病害一般以種植抗病品種、溫室栽培和化學(xué)防治為主[1]。與化學(xué)防治手段相比，生物農(nóng)藥（biological pesticide）具有很好的生物安全性和環(huán)境友好性，是目前全球農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì)[2]。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillm amyloliquefaciens）對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)且易培養(yǎng)繁殖，近幾年被優(yōu)選為研發(fā)穩(wěn)定生物農(nóng)藥的菌種，是一種效果理想的生防菌株，市場(chǎng)上以可濕性粉劑和水劑最為常見[3-7]。相關(guān)文獻(xiàn)已證實(shí)，解淀粉芽孢桿菌對(duì)西瓜生長(zhǎng)枯萎病、番茄枯萎病等田間果蔬真菌性病害具有一定的抑菌防治效果[8-11]，但鮮有提到對(duì)田間葡萄種植病害及葡萄酒貯存污染有抑制效果的相關(guān)研究。

基于實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)前期的理論研究成果[12-14]，將篩選得到的具有有效抑制灰葡萄孢的解淀粉芽孢桿菌B15發(fā)酵液在一定條件下制備成可濕性粉劑，并在葡萄種植期間的病害防治、葡萄酒貯存期酒窖內(nèi)的抑菌情況和葡萄果實(shí)貯存期間的防腐保鮮等3個(gè)方面進(jìn)行施藥應(yīng)用，并對(duì)施用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為我國(guó)釀酒葡萄的真菌性病害防治提供有價(jià)值的應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)主要材料有解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） B15，保藏于國(guó)家酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心（ICAB）國(guó)家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。表面活性劑（分散劑2425，潤(rùn)濕劑200），由北京格林泰姆科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)儀器主要有LGJ-30FD真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)FRITSCH公司）、微型行星式球磨機(jī)PULVERISETTE6（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、LDZX-50KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、DHZ-B高溫全溫振蕩器（太倉(cāng)市豪誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物抑菌劑的劑型合成 解淀粉芽孢桿菌B15發(fā)酵液經(jīng)真空冷凍干燥成固體粉末，按4%添加量與20%表面活性劑和76%膨潤(rùn)土混合，用行星式球磨機(jī)充分粉碎混勻，制備得到解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑（圖1）。

1.3.2 生物抑菌劑的指標(biāo)測(cè)定方法 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑經(jīng)一定比例無(wú)菌水稀釋后，制備得到B15生物抑菌劑。

抑菌劑的孢子計(jì)數(shù)方法為稀釋一定倍數(shù)后，在1 000倍光學(xué)顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

可濕性粉劑pH值的測(cè)定參考GB/T 1601—93《農(nóng)藥pH值的測(cè)定方法》，細(xì)度的測(cè)定參考GB/T 16150—1995《農(nóng)藥粉劑、可濕性粉劑細(xì)度測(cè)定方法》，懸浮率測(cè)定方法參考GB/T 14825—2006《農(nóng)藥懸浮率測(cè)定方法》，熱穩(wěn)定性測(cè)定參考GB/T 19136—2003《農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測(cè)定方法》。

1.3.3 葡萄田間抑菌應(yīng)用試驗(yàn)方法 試驗(yàn)于2019年7—8月，在北京市密云區(qū)某葡萄園區(qū)實(shí)施，試驗(yàn)藥劑為B15生物抑菌劑，對(duì)照藥劑為常見防治葡萄霜霉病的生物農(nóng)藥嘧菌酯懸浮劑，推薦濃度為 250 g/L。試驗(yàn)藥劑用水稀釋，采用DFH-16A型背負(fù)式手動(dòng)噴霧器對(duì)葡萄植株雙面均勻噴霧。

選擇5個(gè)面積在1 hm2左右的相鄰葡萄地塊，抑菌劑施藥濃度按75、150、300 g/hm2等分別噴灑在3個(gè)地塊上，施藥液量均為90 L/hm2，另外2個(gè)地塊分別為對(duì)照和空白對(duì)照（清水）。噴灑時(shí)間為葡萄霜霉病發(fā)病初期，每隔7 d施藥1次，連續(xù)4次。當(dāng)對(duì)照組明顯發(fā)病時(shí)開始調(diào)查，1周后調(diào)查防治效果。

調(diào)查方法為每個(gè)地塊隨機(jī)調(diào)查10個(gè)當(dāng)年抽生新蔓，自上而下調(diào)查全部葉片，采用鄧肯氏新復(fù)極差（DMRT）法記錄各級(jí)病葉數(shù)及總?cè)~數(shù)，具體各級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及藥效計(jì)算方法參考錢一鑫等的調(diào)查方法[15]。

1.3.4 葡萄酒窖抑菌應(yīng)用試驗(yàn)方法 試驗(yàn)于2019年11—12月于北京市密云區(qū)某酒莊酒窖內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)藥劑為B15生物抑菌劑，對(duì)照組為無(wú)菌水。選取合適的大空間酒窖，將酒窖空間均分為前部相對(duì)通風(fēng)、有空氣擾動(dòng)的流動(dòng)空間和后部氧氣濃度較低、氣流相對(duì)封閉的空間等2個(gè)部分進(jìn)行。在2個(gè)空間分別挑選3處互不干擾的不同位置，每個(gè)位置放置均勻高度的平臺(tái)桌，在桌上均勻放置3個(gè)干凈的孟加拉紅平板用于收集空氣中的菌體。

施藥前，打開平板2 h收集菌體，設(shè)為空白對(duì)照組。然后，向2個(gè)空間的空氣中均勻噴灑抑菌劑，施藥濃度為1.2 g/L，藥液量為1 L，噴灑體積為8 m3，然后換一組新平板在相同條件下重復(fù)取樣。平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中，2 d后計(jì)數(shù)，觀察并記錄酒窖空氣中霉菌的數(shù)量。之后每天固定時(shí)間重復(fù)取樣和培養(yǎng)操作。1周后重復(fù)噴灑、取樣和培養(yǎng)操作，試驗(yàn)共進(jìn)行4周。

1.3.5 果蔬防腐應(yīng)用試驗(yàn)方法 試驗(yàn)于2019年12月在實(shí)驗(yàn)室完成，試驗(yàn)藥劑為B15生物抑菌劑，對(duì)照組為無(wú)菌水。

在市場(chǎng)購(gòu)買當(dāng)日現(xiàn)摘同一品種鮮食葡萄，將葡萄果實(shí)單粒完整剪下，每組30粒。將葡萄分別在無(wú)菌水和濃度為1.25、2.50 g/L的抑菌劑中各浸泡 2 min，然后取出自然晾干，置于干燥、潔凈的塑封袋中，每個(gè)袋子上中下位置分別扎一些小孔。1周后重復(fù)施藥處理，共重復(fù)施藥4周，每周觀察并記錄霉?fàn)€果粒數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物抑菌劑的指標(biāo)測(cè)定

2.1.1 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑孢子計(jì)數(shù) 選取105作為稀釋倍數(shù)，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，結(jié)果得到解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑中活性孢子數(shù)為5.02×107個(gè)/g。

2.1.2 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑pH值的測(cè)定 測(cè)定3組后，得到該可濕性粉劑pH值的平均值為7.58。對(duì)照文獻(xiàn)[7-10]可知，可濕性粉劑的pH值在6～8為宜，中性最佳。該可濕性粉劑的pH值處于適宜范圍。

2.1.3 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑細(xì)度的測(cè)定 3組可濕性粉劑試樣取樣量均為20.00 g，經(jīng)3組平行試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)帶入GB/T 16150—1995《農(nóng)藥粉劑、可濕性粉劑細(xì)度測(cè)定方法》中的公式計(jì)算，得到的結(jié)果如表1所示。由表1可知，可濕性粉劑的細(xì)度為（97.97±013）%，符合推薦可濕性粉劑細(xì)度范圍。

2.1.4 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑懸浮率的測(cè)定 經(jīng)3組平行試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)帶入GB/T 14825—2006《農(nóng)藥懸浮率測(cè)定方法》中的公式計(jì)算，得到結(jié)果如表2所示。由表2可知，可濕性粉劑的懸浮率為（85.60±0.63）%，符合推薦可濕性粉劑懸浮率范圍。

2.1.5 解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑熱穩(wěn)定性的測(cè)定 將可濕性粉劑在54 ℃的恒溫箱中放置 14 d 后取出，分別按“1.3.2”節(jié)中所述方法測(cè)定pH值、細(xì)度和懸浮率，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3組平行。測(cè)定結(jié)果顯示，孢子數(shù)為4.55×107個(gè)/g，pH值為7.55，細(xì)度為98.92%，懸浮率為85.58%，與初始測(cè)定結(jié)果相比變化不大?？梢钥闯?，該可濕性粉劑熱穩(wěn)定性良好。

2.2 生物抑菌劑的初步應(yīng)用

2.2.1 果蔬田間抑菌試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果表明，5.02×107個(gè)/g B15可濕性粉劑防治葡萄霜霉病試驗(yàn)在75、150、300 g/hm2處理濃度均呈現(xiàn)出一定的抑菌效果，其平均防效分別為69.8%、72.3%、76.7%，在5%和1%水平上均具有顯著性影響。其中，處理濃度為300 g/hm2時(shí)對(duì)葡萄霜霉病的防治效果優(yōu)于75、150 g/hm2，且與對(duì)照藥劑22 400 g/hm2嘧菌酯懸浮劑的防治效果相當(dāng)，平均防效在70%以上（表3、表4），達(dá)到農(nóng)藥防效的水平（70%～80%）。同時(shí)，B15可濕性粉劑對(duì)葡萄安全無(wú)藥害，藥劑在水中分散性能良好。

據(jù)此建議，B15可濕性粉劑在葡萄田間的施藥濃度控制在150～300 g/hm2，施藥時(shí)間為葡萄發(fā)病前噴施，會(huì)對(duì)夏季露地葡萄霜霉病有較好的防治效果。

2.2.2 葡萄酒窖抑菌試驗(yàn) 酒窖陰暗潮濕的環(huán)境利于霉菌生長(zhǎng)，會(huì)對(duì)葡萄酒品質(zhì)造成影響，一些霉菌代謝產(chǎn)生的霉菌毒素還會(huì)危害消費(fèi)者的身體健康。對(duì)酒窖前后2個(gè)空間分別進(jìn)行施藥試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，封閉空間施藥效果較好，平均抑菌率為77.32%，持續(xù)時(shí)間為3 d;流動(dòng)空間受空氣擾動(dòng)的影響，結(jié)果穩(wěn)定性較差，平均抑菌率為6472%，持續(xù)時(shí)間為1.8 d。

2.2.3 果蔬防腐實(shí)驗(yàn) 由表5可知，試驗(yàn)第1周所有試驗(yàn)組和對(duì)照組均無(wú)霉?fàn)€果粒，第2周開始出現(xiàn)霉?fàn)€果粒，隨著周數(shù)的增加，對(duì)照組霉?fàn)€果粒數(shù)逐漸增多，好果率逐漸降低，最后1周好果率僅為267%。相比對(duì)照組，經(jīng)過抑菌劑處理的2個(gè)試驗(yàn)組的葡萄果粒大部分仍保持完整，最后1周50、100 mg/L 試驗(yàn)組好果率分別為76.7%、83.3%。試驗(yàn)結(jié)果表明，B15抑菌劑在果蔬保鮮方面確實(shí)存在一定的防腐效果，因其為天然生物抑菌劑，易降解沖洗，對(duì)果蔬危害較小，在果蔬保鮮劑方面具有一定的應(yīng)用前景。

3 討論與結(jié)論

本研究根據(jù)解淀粉芽孢桿菌對(duì)葡萄霜霉病、葡萄炭疽病等真菌病原的抑制作用，制備了解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑，并對(duì)其在葡萄種植病害防治、葡萄酒窖抑菌及葡萄防腐等方面分別進(jìn)行了初步應(yīng)用。3種施藥應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果表明，B15可濕性粉劑在葡萄酒廠中的葡萄園種植、酒窖貯存和葡萄防腐方面均具有一定的效果，尤其在果蔬保鮮劑的應(yīng)用領(lǐng)域，具有一定的應(yīng)用前景和潛力。

總體來(lái)說，解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑在具體試驗(yàn)中顯示出良好的應(yīng)用效果，具有很好的應(yīng)用潛力和開發(fā)價(jià)值，為我國(guó)釀酒葡萄在葡萄種植、果實(shí)保鮮和葡萄酒貯存整個(gè)流程中的真菌病害防治提供了有價(jià)值的應(yīng)用參考。

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